專利名稱：動(dòng)物雙歧桿菌及其制備雙歧桿菌發(fā)酵飲料的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株動(dòng)物雙歧桿菌及其在制備雙歧桿菌發(fā)酵飲料中的應(yīng)用，特別涉 及一動(dòng)物雙歧桿菌菌株及其發(fā)酵雪蓮果復(fù)合汁制備發(fā)酵飲料的工藝。
背景技術(shù)：
人體腸道內(nèi)存在數(shù)以百萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌，這些菌大多數(shù)與人和平共處有益而無(wú)害， 稱為人體正常菌群。人體腸道菌群的總重量約占人體總重量的1/50 1/60，其中95% 以上是活菌，每天在人體腸道內(nèi)進(jìn)行著活躍的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)?？胺Q人體第六大器官。人 體的營(yíng)養(yǎng)、消化、生物拮抗、免疫、抗腫瘤、藥物效能和抗衰老等與人體腸道微生物密 切相關(guān)。雙歧桿菌是人體消化道菌群中的優(yōu)勢(shì)益生菌之一，自嬰兒出生2 3天開(kāi)始增 殖，5 7天達(dá)高峰，并占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)?？诜咕幬铩⑹中g(shù)、飲食變化，疾病和衰老等 均能使腸道雙歧桿菌數(shù)量發(fā)生變化，隨著年齡的增長(zhǎng)，歧桿菌數(shù)量逐漸減少，體弱多病 的老人腸道內(nèi)該菌幾乎消失，而健康人雙歧桿菌保持著恒定的數(shù)量約108 109CFU/ml。 這反映出人體腸道內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)量乃是檢驗(yàn)人是否健康的指標(biāo)之一。隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展和對(duì)雙歧桿菌的認(rèn)識(shí)，大量研究證實(shí)了雙歧桿菌在人體內(nèi) 發(fā)揮著多種生理活性功能，包括拮抗致病菌，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)免疫，抗癌， 抗腫瘤，延緩衰老等。因此雙歧桿菌在食品及醫(yī)學(xué)界受到廣泛關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)了多種雙歧桿 菌制品。醫(yī)藥產(chǎn)品有1)片劑形式，如金雙岐三聯(lián)活菌片2)膠囊或沖劑，如膠囊形式的 麗珠腸樂(lè)膠囊，沖劑形式的優(yōu)菌多顆粒、女士?jī)?yōu)菌多顆粒、龍寶寶益生菌沖劑等。3)液 體制劑如三株口服液、株王常維舒口服液。這些產(chǎn)品在治療腸道菌群失調(diào)引起的腹瀉、 慢性腹瀉、抗生素治療無(wú)效的腹瀉及便秘的等方面發(fā)揮了很大的作用，同時(shí)也是某些臨 床疾病的良好的輔助藥物。雙歧桿菌保健品及食品有昂立一號(hào)；雙歧桿菌與保加利亞 乳桿菌、嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵的酸奶，酸豆乳；添加雙歧桿菌代謝產(chǎn)物的食品如日本的 L-乳酸的新型保健糖果等。近年來(lái)興起了對(duì)于以其它食材為原料，生產(chǎn)雙歧桿菌及其代謝產(chǎn)物或保健食品 的研究。目前還未見(jiàn)以雪蓮果為原料的雙歧桿菌飲品或制劑上市。雪蓮果，學(xué)名Smallanthus sanchifalius，別名晶薯、菊薯、神果、地參果。屬
菊科，葵花屬植物，故又稱為菊薯，原產(chǎn)自南美洲的安第斯山脈，是當(dāng)?shù)赜〉诎踩说囊?種傳統(tǒng)根莖食品，已有500年歷史。1985年日本琦玉縣引種成功，近年來(lái)通過(guò)多種途徑 進(jìn)入中國(guó)，目前已在云南、福建、海南、貴州、湖南、湖北、山東、河南、河北引種栽 培成功。生產(chǎn)示范面積逾96公頃。產(chǎn)品多用于出口，部分進(jìn)入超市。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株動(dòng)物雙歧桿菌及其在制備雙歧桿菌發(fā)酵飲料中的應(yīng)用。動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01已于2005年04月13日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCM.1353。動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis) 01，其保藏編號(hào)為 CGMCC 1353。本發(fā)明還提供一種雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料的制備方法，是將動(dòng)物雙歧桿菌 (Bifidobacterium animalis) 01 CGMCC 1353活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，接種在含有雪蓮果果漿的液 體中，36-38°C厭氧培養(yǎng)至pH為3.8-4.8，結(jié)束發(fā)酵，獲得雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料。1上述方法中，動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)01 CGMCC 1353接種前 經(jīng)過(guò)種子活化培養(yǎng)，方法如下所述1) 一代種子的制備將動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis) 01 CGMCC 1353 接種到 MRS 液體培養(yǎng)
基中，在37°C厭氧培養(yǎng)24h_48h得到一代種子。2) 二代種子的制備將一代種子接種在MRS液體培養(yǎng)基中37°C厭氧培養(yǎng)14_16h得到第二代種子。3)三代種子的制備將二代種子接種在MRS培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)14h得到第三代種子。4)種子擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟3)獲得的第三代種子發(fā)酵液，以體積比為3%接種量接種至復(fù)合果 汁-MRS液體培養(yǎng)基(制備方法如下所示)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。復(fù)合果汁-MRS改良液體培養(yǎng)基的制備復(fù)合雪蓮果汁(含雪蓮果果漿的液體)與MRS液體培養(yǎng)基以體積比1 2-2 1 混合，pH7.0，115°C高壓滅菌15-20min。復(fù)合雪蓮果汁與MRS液體培養(yǎng)基體積比優(yōu)選 為 1 1。2上述方法中，所述含雪蓮果果漿的液體按下述方法制備1)雪蓮果清洗切分，在85-100°C水中燙漂滅酶，然后撈出雪蓮果肉，以雪蓮果 肉和水的質(zhì)量比1 1-5的比例加入水混合打漿，得到雪蓮果漿；2)添加是雪蓮果漿體積的1-10%的脫脂復(fù)原乳和是雪蓮果漿體積的1-8%西紅 柿汁，混合均質(zhì)后，得到混合果汁；所述脫脂復(fù)原乳的制備方法為10 12.5g脫脂乳加 入1L飲用水，充分?jǐn)嚢枞芙猥@得脫脂復(fù)原乳；3)在混合果汁里充氮，使氧還電位降至-0.03ev以下，滅菌得到復(fù)合雪蓮果汁。所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的步驟1)中，所述燙漂滅酶的溫度優(yōu)選為 100 °C,時(shí)間優(yōu)選為10分鐘。所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的步驟1)中，所述雪蓮果肉和水的質(zhì)量比優(yōu) 選為1 2。所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的步驟2)中，所述脫脂復(fù)原乳的添加量?jī)?yōu)選 為雪蓮果漿體積的5% ；所述西紅柿汁的添加量?jī)?yōu)選為雪蓮果漿體積的3%。3所述方法中，所述厭氧培養(yǎng)的溫度為37°C ；所述動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteri umanimalis)01 CGMCC 1353 的接種量為 1 X 105-1 X 107cfu/ml,優(yōu)選為 1 X 106cfu/mlcfo/ml。本發(fā)明提供的動(dòng)物雙歧桿菌，保藏編號(hào)為1353，可用于制備雙歧桿菌發(fā)酵飲 料。動(dòng)物雙歧桿菌01具有耐受消化道逆環(huán)境，抗氧化等保健功效。本發(fā)明還利用上述動(dòng)物雙歧桿菌，選擇了富含雙歧因子且價(jià)格低廉的雪蓮果， 制備了一種雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料，并優(yōu)化了該雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料的生產(chǎn)工 藝，其中包括雪蓮果復(fù)合汁的制備工藝，雙歧桿菌種子的制備工藝。在雪蓮果汁加入輔 料充氮滅菌，突破了傳統(tǒng)乳原料的束縛，配之以營(yíng)養(yǎng)豐富的脫脂復(fù)原乳，并配以西紅柿 輔料制成復(fù)合果汁，復(fù)合果汁經(jīng)該株雙歧桿菌的發(fā)酵產(chǎn)生乙酸和乳酸，B族維生素等多 種具有重要生理活性的代謝產(chǎn)物，形成了良好的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，成品無(wú)菌 灌裝，在4°C條件下貯藏15天內(nèi)雙歧桿菌活菌數(shù)保持在106CFU/mL以上，大腸菌群在 30天內(nèi)呈陰性。本發(fā)明制備的雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料色澤溫和(圖1)，口感好，風(fēng)味 佳，貨架期較長(zhǎng)，具有良好的保健效果的保健飲品。


圖1為本發(fā)明的雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料樣品(包裝形式之一)。圖2為基于hsp60序列的動(dòng)物雙歧桿菌01系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01CGMCC 1353 的獲得一、動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01CGMCC 1353 的獲得及其鑒定無(wú)菌厭氧取得廣西巴馬長(zhǎng)壽老人新鮮糞便25g，置于無(wú)菌預(yù)還原225mL生理鹽 水中。充分混勻，采用亨蓋特厭氧稀釋技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行10倍系列稀釋，選取稀釋倍數(shù)為 105、106、107以亨蓋特厭氧滾管法進(jìn)行分離，置于37°C恒溫箱培養(yǎng)48 72h。挑選菌落 特征為光滑、凸圓、邊緣整齊、乳白色或微帶黃色、質(zhì)地柔軟的中小菌落，接種于MRS 液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24 48h，進(jìn)行革蘭氏染色。挑選具有雙歧桿菌形態(tài)等特征的 菌落，再進(jìn)行需氧和厭氧培養(yǎng)，選取僅在厭氧培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的菌落，再一次顯微鏡觀 察，選取形態(tài)不規(guī)則的疑似雙歧桿菌菌株，進(jìn)行鑒定。最終獲得一株菌株命名為01。對(duì)菌株01進(jìn)行生理生化與hsp60序列鑒定。GroEL (Hsp60)是分子伴侶家族中 一類，Hsp60廣泛存在于原核生物，真核動(dòng)植物中。其基因序列具有高度保守性。被用 于各物種間親緣關(guān)系的分析。有研究表明雙歧桿菌的16S序列非常接近，而hsp60的序 列在雙歧桿菌各種之間差異較大，能夠更好的區(qū)分雙歧桿菌所屬種。01菌株生理生化檢 測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，動(dòng)物雙歧桿菌01的hsp60基因序列鑒定方法如下1、基因組的提取1)雙歧桿菌總DNA的提取基因組提取試劑盒(北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)提取雙歧桿菌總 DNA。2、目的片段的擴(kuò)增1)簡(jiǎn)并引物
H60F 5 ‘ -GG (ATGC) GA (CT) GG (ATGC) AC (ATGC) AC (ATGC) AC (ATGC) GC (ATGC) AC (ATGC) GT-3 ‘H60R 5 ‘ -TC (ATGC) CC (AG) AA (ATGC) CC (ATGC) GG (ATGC) GC (CT) TT (ATGC) AC (ATGC) GC-3 ‘引物的合成由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。2)PCR反應(yīng)體系20u 1 雙蒸水14.25ul ； DNTP 2.5ul ；上游引物l.Oul ；下游引 物 l.Oul ； Teq 酶 0.25ul ；模板 l.Oul ；PCR 反應(yīng)程序初始變性 95°C，5min。退火 46°C，30s ；延伸 72°C，lmin ； 30 個(gè)循環(huán)；終延伸72°C，lOmin。3、目的片段序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 將PCR反映體系混合物送至測(cè)序公司測(cè)序，動(dòng)物雙歧桿菌01的hsp60基因序列 如序列表中序列1所示，將測(cè)序得到的hsp60序列與基因bank中序列進(jìn)行比對(duì)，用得到 被測(cè)菌株與模式菌株保守序列的相似度。以seqnconverter軟件轉(zhuǎn)換序列格式，MEGA3.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖2顯示了動(dòng)物雙歧桿菌01基于hsp60基因序列的 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。雙歧桿菌現(xiàn)有報(bào)道的菌種有32種。我們的01菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中與如雙 歧桿菌及動(dòng)物雙歧桿菌在同一個(gè)分支上，有人認(rèn)為乳雙歧桿菌為動(dòng)物雙歧桿菌的一個(gè)亞 種。另有試驗(yàn)結(jié)果證明01菌株的16SrDNA序列更接近動(dòng)物雙歧桿菌。結(jié)合生理生化鑒 定結(jié)果，將01菌株鑒定為動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)。動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis) 01已于2005年04月13日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西 路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCCM.1353。表2動(dòng)物雙歧桿菌01的生理生化特性
權(quán)利要求
1.動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)01，其保藏編號(hào)為 CGMCC 1353。
2.動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis) OICGMCC 1353在制備雙歧桿菌發(fā)酵飲料中的應(yīng)用。
3.—種雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料的制備方法，是將動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriuma nimalis) OICGMCC 1353接種在含有雪蓮果果漿的培養(yǎng)基中，36_38°C厭氧培養(yǎng)至pH為 4.2-4.5，結(jié)束發(fā)酵，獲得雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述含有雪蓮果果漿的培養(yǎng)基是含雪 蓮果果漿的液體與MRS液體培養(yǎng)基混合得到的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體按下述方法 制備1)雪蓮果清洗切分，在85-100°C水中燙漂滅酶，然后撈出雪蓮果肉，以雪蓮果肉和 水的質(zhì)量比1 1-5的比例加入水混合打漿，得到雪蓮果漿；2)添加是雪蓮果漿體積的1-10%的脫脂復(fù)原乳和是雪蓮果漿體積的1-8%西紅柿 汁，混合均質(zhì)后，得到混合果汁；3)在混合果汁里充氮，使氧還電位降至-0.03ev以下，滅菌得到含雪蓮果果漿的液體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體制備方法的 步驟1)中，所述燙漂滅酶的溫度為100°C，時(shí)間為10分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體制備方法 的步驟1)中，所述雪蓮果肉和水的質(zhì)量比為1 2。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述含雪蓮果果漿的液體 制備方法的步驟2)中，所述脫脂復(fù)原乳的添加量是雪蓮果漿體積的5% ；所述西紅柿汁 的添加量是雪蓮果漿體積的3% ；所述含雪蓮果果漿的液體與MRS液體培養(yǎng)基混合的體 積比例是2 1-1 2，優(yōu)選為1 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述厭氧培養(yǎng)的溫 度為37°C ；所述動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)OlCGMCC 1353的接種量為 1 X IO5-I X 107cfu/ml,優(yōu)選為1 X 106cfo/ml ；所述脫脂復(fù)原乳的制備方法為10 12.5g脫 脂乳加入IL飲用水，充分?jǐn)嚢枞芙猥@得脫脂復(fù)原乳。
10.權(quán)利要求3-9中任意一項(xiàng)所述的方法制備的雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了動(dòng)物雙歧桿菌及其在制備雙歧桿菌發(fā)酵飲料的應(yīng)用。該動(dòng)物雙歧桿菌為動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)01，其保藏編號(hào)為CGMCC 1353。動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)01CGMCC 1353可用于制備雙歧桿菌發(fā)酵飲料。本發(fā)明制備的雪蓮果雙歧桿菌發(fā)酵飲料色澤溫和(圖1)，口感好，風(fēng)味佳，貨架期較長(zhǎng)，具有良好的保健效果的保健飲品。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102010845SQ20101029489
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者劉國(guó)榮, 旭日花, 李平蘭, 王洋 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)