專利名稱：結核菌檢測用的引物和探針以及使用它們檢測人型結核菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用核酸擴增及其檢測體系，在臨床檢查中檢測人型結核菌結核分 枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，以下稱為人型結核菌)的檢測方法。
背景技術：
人型結核菌是導致人產(chǎn)生結核病的病原體，是被分類在分枝桿菌屬 (Mycobacterium)并具有抗酸性質(zhì)的革蘭氏陽性桿菌。結核病雖然近年顯著減少，但是，最 近產(chǎn)生了老年人的發(fā)病率上升、在沒有經(jīng)歷過結核感染的年輕人中引起集體感染等重大問 題。另一方面，除了人型結核菌以外，已知鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、胞內(nèi)分 felf lif (Mycobacterium intracellulare) >ifiSiT^feIflii (Mycobacterium kansasii) 等非結核性抗酸菌對人表現(xiàn)病原性。另外，在感染AIDS病毒的免疫缺陷者當中，非結核性 抗酸菌引起疾病成了主要問題。由于這些非結核性抗酸菌病多數(shù)對抗結核藥具有抗藥性， 所以在決定治療方案時，鑒別診斷結核病和非結核性抗酸菌病是很重要的。但是，從臨床 癥狀、病理組織學的觀點來看，鑒別結核病是非常困難的，因此診斷必須通過菌的鑒定來進 行。在鑒別診斷結核病或非結核性抗酸菌病時，一般通過小川培養(yǎng)基分離培養(yǎng)樣品， 為了鑒定種而進一步采用進行生化試驗的方法。然而，通常由于分枝桿菌屬生長慢，培養(yǎng)時 需要相當長的時間。因此，進行歷來的基本方法的涂片試驗或培養(yǎng)試驗時，為了得到結核病 與否的診斷結果，光是菌的分離培養(yǎng)就需要3 4周時間，然后在鑒定種的各種試驗中還需 要2 3周時間。另外也有使用針對分枝桿菌屬的抗原的抗體的結核菌檢測法，但是，由于分枝桿 菌屬種之間的交叉反應，欠缺相對于結核菌的特異性，靈敏度也不夠。近年，利用聚合酶鏈反應(PCR)等的核酸擴增技術的診斷技術作為有用的方法被 研究，也研究了可以被利用到結核菌的診斷中，研究了結核菌DNA基因組的各區(qū)域是否在 用PCR進行的結核菌檢測中可以用作靶標。例如報道了檢測編碼分枝桿菌屬的65千道爾頓抗原的基因區(qū)域的方法(例如參 照非專利文獻1、非專利文獻2、非專利文獻3、非專利文獻4、非專利文獻5)。然而，已知 65千道爾頓抗原基因除了在人型結核菌中具有以外，在鳥分枝桿菌(M. avium)(鳥型結核 菌)、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum)、副結核分枝桿菌(M. paratuberculosis)、堪薩斯分枝 桿菌(M. kansasii)、BCG和海分枝桿菌(M. marinum)等同屬菌中也具有。尤其是，由于與 非結核性抗酸菌病的典型的病原菌鳥分枝桿菌或堪薩斯分枝桿菌的交叉性高，因此檢測65千道爾頓抗原基因的方法作為特異地檢測人型結核菌的方法還存在問題。另外，研究了使用自牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)DNA鑒定的序列-編碼 MPB70蛋白質(zhì)的基因序列進行結核分枝桿菌的鑒定的試驗方法(例如，參照非專利文獻6)。 然而，Kulski 等人在 FEMS MicrobiolLett. 1997 年 3 月 1 日；148(1) :43_48(非專利文獻 7)報道了其結果，已知其中進行的PCR檢驗結果在以MPB70蛋白質(zhì)作為靶標時，與堪薩斯分 枝桿菌的DNA中存在的類似序列產(chǎn)生交叉反應，該方法在特異地檢測人型結核菌檢測中也 存在問題。
此外，報道了編碼蛋白質(zhì)抗原b (Pab)的基因序列作為標記的結核分枝桿菌/牛分 枝桿菌的檢測方法(例如參照非專利文獻8)，證實了以結核分枝桿菌/牛分枝桿菌檢測目 的使用該標記的有效性。但是，由于考慮到Pab基因在結核基因組中僅存在一個拷貝，因此 不太優(yōu)選作為核酸擴增的靶標材料(相對地，后述的IS6110序列在核酸基因組中存在10 個拷貝。)。此外，報道了 IS6110作為探針的RFLP (限制性片段長度多態(tài)性)可以在結核菌的 診斷中使用(例如參照非專利文獻9)，并且可以作為結核的流行病學調(diào)查的重要工具在世 界各國中被使用。IS6110是結核菌特有的插入序列，在染色體DNA中存在多個IS6110，其 在每種菌株中的數(shù)目、位置不同，其特性在一定程度上穩(wěn)定地遺傳下去。其結果是根據(jù)菌 株的不同而顯示不同的RFLP型，也可以分為衍生的組。直至目前為止，很多報道涉及使用 IS6110的結核檢測方法，報道了具有超過75%的靈敏度和接近100%的特異性。但是，另一 方面，研究結果也報道了在使用IS6110的檢測方法中，存在產(chǎn)生假陽性的問題(非專利文 獻10)。另外，也有對IS6110設計特異的引物而進行PCR的檢測方法(例如參照專利文獻 1、專利文獻2、專利文獻3、專利文獻4)，但存在涉及結核分枝桿菌以外的來自分枝桿菌屬 的與IS6110相關的序列也擴增的問題。另外，IS6110樣序列也存在于結核菌以外的其他微 生物中，在以IS6110作為靶標的檢測方法中，暗示了這些微生物也被檢測出來的問題。因 此，歷來檢測IS6110的方法在特異地檢測各種人型結核菌方面是不充分的，并存在問題。由以上看出目前的情況是期望確立一種新的特異地檢測人型結核菌的方法。專利文獻1 特表平5-507617號公報專利文獻2 特表平11-514522號公報專利文獻3 日本專利第2814422號公報專利文獻4 美國專利第5370998號說明書專利文獻5 特開昭60-500717號公報專利文獻6 特開昭60-281號公報專利文獻7 美國專利第5210015號說明書專利文獻8 美國專利第5538848號說明書專利文獻9 美國專利第5，801，155號說明書專利文獻10 美國專利第5925517號說明書專利文獻11 美國專利第6，492，121號說明書專利文獻12 日本專利第2650159號公報專利文獻13 特公平7-114718號公報專利文獻14 特開昭58-40099號公報
專利文獻15 特開昭62-265999號公報非專利文獻1 :Chia 等人，J. Clin. Microbiol.，1990 年，第 28 卷，第 9 期， 1877-1880 頁；非專利文獻2 =Brisson-Noel 等人，Lancet, 1989 年，第 334 卷，p. 1069-1071非專利文獻3 :Hackel 等人，Molecular and cellular Probes，1990 年，第 4 卷， p. 205-210非專利文獻4 :ffoods, Cole, FEMS Mycrobiology Letters, 1989 年，第 65 卷， p. 305-310非專利文獻5 =Hance 等人，Molecular Microbiology, 1989 年，第 3 卷，第 7 期， p.843-849非專利文獻6 :Kulski 等人，J. Clin Microbiol.，1995 年，第 33 期，p. 668-674非專利文獻7 =Kulski 等人，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 1997 年 3 月 1 日，第 148 卷， 第 1 期，p. 43-48非專利文獻8 =Sjobring 等人，J. Clin. Microbiol.，1990 年，第 28 卷，第 10 期， P. 2200-2204非專利文獻9 =Hermans PWM 等人，J. Clin. Microbiol.，1990 年，第 28 卷， p.2051-2058非專利文獻10 =Lee 等人，Neurological Sciences, 1994 年，第 123 卷，p. 173-179非專利文獻11 =Thierry 等人，Nucleic Acid Res.，1990 年，第 18 卷，第 1 期，
P. 188非專利文獻12 :Nucleic Acids Res.，1986 年，第 14 卷，p. 6115-6128非專利文獻 13 =Kent PT, Kubica GP, Pubric HealthMycobacteriology, A Guild for the Level III laboratory,U. S. Department ofHealth and Human Services,Public Health Service, Center for DiseaseControl, Atlanta, U. S. A. ,1985 年，p. 31-5
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明欲解決的課題鑒于上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種排除診斷上的假陽性的新穎的結核菌檢 測用引物，和使用該引物簡便、迅速且準確度高地檢測人型結核菌的檢測方法。用于解決課題的手段本發(fā)明以解決上述課題為目的并已完成了發(fā)明，包括以下內(nèi)容。(1)含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7或序 列號8中所述的核酸序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鳥嘌呤、T表示胸腺 嘧啶。另外，任意位置的T可以被尿嘧啶(U)替換。下同)的部分或全部，或其互補序列的 部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。(2) 一種人型結核菌檢測用引物，含有寡核苷酸，該寡核苷酸含有序列號1、序列 號2、序列號3、序列號4或序列號5中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分 或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交。(3) 一種人型結 核菌檢測用探針，含有寡核苷酸，該寡核苷酸含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8中所述的核酸序列的部分 或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交。(4) 一種人型結核菌的檢測方法，其特征在于使用寡核苷酸作為引物和/或探 針，該寡核苷酸含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號4或序列號5中所述的核酸序列的
部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜 、-父。(5) 一種人型結核菌檢測用試劑盒，包括含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號 4或序列號5中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與人型結 核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物和/或探針。本發(fā)明人對直至目前所確定的人型結核菌和其他生物的各種基因，反復進行各屬 種之間的各基因序列的同源性的理論驗證和實驗驗證，結果發(fā)現(xiàn)存在這樣的堿基序列，所 述堿 基序列特異地與人型結核菌的插入重復序列-IS6110序列的特定區(qū)域雜交，是對人型 結核菌的檢測有用的堿基序列。對這些發(fā)現(xiàn)作進一步深入的研究，結果研發(fā)了對人型結核菌具有特異性、并用于 其檢測的寡核苷酸(序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7 和序列號8中所述的核酸序列)和利用它們的人型結核菌檢測用核酸引物和標識探針，并 確立使用它們的人型結核菌的檢測方法。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的人型結核菌的檢測方法，與歷來使用的IS6110作為靶標的結核菌 的檢測方法相比，可能排除診斷上的假陽性，并且可能以更高的特異性和精確度檢測人型 結核菌。附圖簡述[

圖1]是實施例1中所得的電泳結果。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使 用以下的試樣時的結果。M4:分子量標記(標記4)、a:大腸菌(Escherichia coil)、 b、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結核菌)、C、堪薩斯分枝桿菌 (Mycobacterium kansasii)、d:海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、e 猿分枝桿菌 (Mycobacterium simiae)、f 療病分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)、g 戈氏分枝 Iflif (Mycobacterium gordonae) > h 氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai) > i 鳥分枝 桿菌(Mycobacterium avium)、j 胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)k 胃分 枝桿菌(Mycobacterium gastri) >1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)、m 無色分枝桿 菌(Mycobacteriumnonchromogenicum)、η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)、ο 次要 分枝桿菌(Mycobacterium triviale)、p 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum) >q 龜 分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、s Mybacterium peregrinum。[圖2]是實施例2中所得的電泳結果。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用 以下試樣時的結果。Ml:分子量標記(標記1)、M4:分子量標記(標記4)、a:大腸桿菌 (Escherichia coil)、b、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結核菌)、c、堪 薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)、d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)、f 療病分枝桿菌(Mycobacteriumscrofulaceum)、g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)、h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)、 鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium)、j 胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k 胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)、l 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)、 m無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)、 η地分枝桿菌 (Mycobacterium terrae)、ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)、p 偶發(fā)分枝桿菌 (Mycobacterium fortuitum)、q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、r 月農(nóng)月中分枝桿菌 (Mycobacterium abscessus)、s :Mybacterium peregrinum0 [圖3-1]是比較例1中所得電泳圖。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用 以下試樣時的結果。另外，當使用無色分枝桿菌(Mycobacteriumnonchromogenicum)作 為試樣時(m)的條帶用虛線圓圈起來表示。另外，當使用次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)作為試樣時(ο)的條帶用箭頭指向的虛線圓圈起來表示。MI 分子量標記(標 記1)、Μ4:分子量標記(標記4)、a:大腸桿菌(Escherichia coil)、b、結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、c、i甚薩斯分枝！flif (Mycobacteriumkansasii) >d 海分枝 桿菌(Mycobacterium marinum)、e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)、f 療病分枝桿 菌(Mycobacteriumscrofulaceum)、g 戈氏分枝!flif (Mycobacterium gordonae)、h 斯氏 分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)、i 鳥分枝桿菌(Mycobacteriumavium) > j 胞內(nèi)分枝 Iflif (Mycobacterium intracellulare) k 胃分枝If 胃(Mycobacterium gastri) > 1 ·分 枝桿菌(Mycobacterium xenopi)、m 無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum) > η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)、o 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)、p 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)、q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、s :Mybacterium peregrinum(peregrinum分枝 桿菌)。[圖3-2]表示對次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)試樣進行上述電泳 所得的部分(ο)中，對擴增片段的大小判斷為與人型結核菌的陽性條帶非常相似的部分的 PCR產(chǎn)物進行純化、分析得到的核酸序列列表。其中，源自部分(b)的人型結核菌的PCR產(chǎn) 物的序列作為第一核苷酸序列，為了比較，表示在序列表的上段。另外，自部分(ο)所得的 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)來源的PCR產(chǎn)物的序列作為第二核苷酸序列，表 示在序列表的下段。[圖4]表示在實施例3中進行的實時PCR檢測結果，繪制相對各PCR用DNA試樣 的基因組的拷貝數(shù)(χ軸、對數(shù)值)的Ct值(y軸)的校正曲線。[圖5]是實施例4所得的電泳的結果。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使 用以下的試樣時的結果。M 分子量標記、(1)沒有試樣、(2)人型結核菌+鳥分枝桿菌 (M. avium) +胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) + 堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、(3)人 型結核菌、(4)鳥分枝桿菌(M. avium) +胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) +堪薩斯分枝 桿菌(M. kansasii)、(5)人型結核菌(10個拷貝)+鳥分枝桿菌(M. avium) +胞內(nèi)分枝桿菌 (M. intracellulare) +堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、(6)鳥分枝桿菌(M. avium)、(7)人 型結核菌+胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) +堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)。另外，在 電泳模式的左邊用箭頭表示電泳方向，表示各擴增產(chǎn)物的部分的出現(xiàn)順序。“TB”表示結核 分枝桿菌(M. tuberculosis)、“avium”表示鳥分枝桿菌(M. avium)、“intra”表示胞內(nèi)分枝tf lif (Μ. intracellulare) >"kansasii"^/^ifil^Jif^feff lif (Μ. kansEisii)。[圖6]表示在實施例5中進行的實時PCR檢測結果，繪制相對各PCR用DNA試樣 的基因組的拷貝數(shù)(χ軸、對數(shù)值)的Ct值(y軸)的校正曲線。實施發(fā)明的最佳方式
本發(fā)明涉及的人型結核菌的IS6110基因是由全長885個堿基對的堿基序列組成， 例如在根據(jù)巴斯德研究所的報告"Nucleic Acid Resl990,No. 18(1), p. 188”(非專利文獻 11)中記載了該全堿基序列。作為本發(fā)明涉及的寡核苷酸，可以列舉含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號 4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的 部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(以下，簡稱為 本發(fā)明的寡核苷酸。)。作為本發(fā)明涉及的含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號 6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸，例如可以列舉含有與序 列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8所述的核酸 序列具有約70%或以上、優(yōu)選約80%或以上、更優(yōu)選約90%或以上、最優(yōu)選約95%或以上 的同源性的堿基序列的寡核苷酸，或特征在于含有序列表的序列號1、序列號2、序列號3、 序列號4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部，并且由連 續(xù)10個堿基或以上、優(yōu)選20個堿基或以上組成的寡核苷酸。作為本發(fā)明涉及的含有相對序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列 號6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部為互補序列的部分或全部的寡核苷 酸，例如可以列舉具有與含有本發(fā)明的序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序 列號6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸雜交的堿基序列的部 分或全部的寡核苷酸。所謂上述的本發(fā)明涉及的具有與含有本發(fā)明的序列號1、序列號2、序列號3、序列 號4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸雜 交的堿基序列的部分或全部的寡核苷酸，具體地，可以列舉具有在高嚴格的條件或嚴格的 條件下，與含有本發(fā)明的序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號 7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸雜交的堿基序列的部分或全部的寡 核苷酸等。另外，其中所謂的“高嚴格的條件”具體地是指例如在50%的甲酰胺中、42 70°C、優(yōu)選60 70°C的雜交，然后在0. 2 2XSSC、0. 十二烷基硫酸鈉(SDS)中、25 70°C洗凈的條件。另外，所謂的“嚴格的條件”具體地是指例如在6XSSC或與其等價的鹽濃度的雜 交溶液中，在50 70°C的溫度條件下進行16小時的雜交，在6XSSC或與其等價的鹽濃度 的溶液等中根據(jù)需要進行預洗凈后，在IXSSC或與其等價的鹽濃度的溶液等中洗凈的條 件。所謂本發(fā)明涉及的與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，可 以列舉前述的具有在高嚴格的條件或嚴格的條件下，與人型結核菌的IS6110基因的核酸 序列雜交的堿基序列的寡核苷酸等。該高嚴格的條件和嚴格的條件如前所述。
另外，本發(fā)明的寡核苷酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。 當然核糖核酸時，胸苷殘基⑴與尿苷殘基⑶可以相互替換。另外，也可以在合成時將任 意位置的T變?yōu)閁進行合成，得到含有尿苷殘基的DNA。同樣地也可以得到含有將任意位置 的U變成T的胸苷殘基的RNA。另外，也可以是1個或多個核苷酸的缺失、插入或替換，也可 以是如肌苷(I)這樣的修飾核苷酸。為了獲得本發(fā)明的寡核苷酸，也可以使用通過本身公知的化學合成法制備的寡核 苷酸。因此，相比克隆化的寡核苷酸或多核苷酸，更可以容易、大量且便宜地獲得一定質(zhì)量 的寡 核苷酸。例如，使用通常進行DNA合成的DNA合成儀，根據(jù)通常的磷酰胺(* ^ * 7 ^夕· ^ 卜)法合成寡核苷酸，根據(jù)使用陰離子交換柱色譜的常規(guī)方法進行純化，可以得到作為目 的的本發(fā)明的寡核苷酸。作為本發(fā)明涉及的人型結核菌檢測用引物，可以列舉具有含有序列號1、序列號 2、序列號3、序列號4或序列號5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或 全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的人型結核菌檢測用 引物(以下稱為本發(fā)明的引物)。本發(fā)明的引物中使用的含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號4或序列號5中 所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110 基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的具體例子，可以是在前述的本發(fā)明的寡核苷酸的敘述中 所述的。另外，本發(fā)明的引物，例如在符合作為目的的核酸雜交條件下，從含有序列號1 5中所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互補序列的部分或全部的寡核苷酸 中，考慮解鏈溫度(Tm值)等、可以以適當區(qū)域的適當長度使用。考慮到維持作為引物序列 的特異性所需的堿基數(shù)，優(yōu)選具有10個堿基或以上、更優(yōu)選具有20個堿基或以上的長度。將本發(fā)明的引物作為在PCR等中使用的引物時，例如優(yōu)選正向引物是含有序列號 1或2中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全部的寡核苷酸，反向引物 是含有序列號3或4中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部的寡核 苷酸。其中，正向引物優(yōu)選序列號1或2中所述的核酸序列的寡核苷酸，反向引物優(yōu)選序 列號3或4中所述的核酸序列的寡核苷酸。作為特別優(yōu)選的引物的組合，可以列舉(a)正向引物是序列號1中所述的核酸序 列的寡核苷酸，反向引物是序列號3中所述的核酸序列的寡核苷酸的組合，或(b)正向引物 是序列號2中所述的核酸序列的寡核苷酸、反向引物是序列號4中所述的核酸序列的寡核 苷酸的組合。獲得本發(fā)明的引物的方法是如獲得前述的本發(fā)明的核苷酸的方法中所述的方法。
本發(fā)明的引物也可以通過標識物質(zhì)被標識。作為用于通過標識物質(zhì)標識本發(fā)明的引物的標識物質(zhì)，可以使用放射性同位素或 酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物素等公知的標識物質(zhì)中的任一種。例如，作為放射性同位素，可以列舉32P、33P、35S等；作為酶，可以列舉堿性磷 酸酶、西洋辣根過氧化物酶等；作為熒光物質(zhì)，可以列舉花菁染料(Cyanine Dye)系的Cy3、Cy5 (Amasham Bioscience公司)、熒光素等；作為發(fā)光物質(zhì)，可以列舉含有吖啶嗡酯 (Acridinium Ester)的化學發(fā)光試劑等通過放射性同位素標識本發(fā)明的引物時，可以列舉在合成引物時，通過摻入使用 放射性同位素標識的核苷酸以標識引物的方法、或合成引物后，使用放射性同位素標識的 方法等。具體地，可以列舉通常使用較多的隨機引物法、切口移位法、通過T4多核苷酸激酶 的5'-末端標識法、使用末端轉脫氧核苷酰酶的3'-末端標識法、RNA標記法等。通過酶標識本發(fā)明的引物時，可以使用使堿性磷酸酶、西洋辣根過氧化物酶等酶 分子與標識的引物直接共價鍵合等該領域中常用的方法即直接標識法。通過熒光物質(zhì)標識時，例如可以通過該領域中常用方法的標識技術摻入熒光素標 識的核苷酸到引物上。另外，在具有連接臂的核苷酸作為序列的寡核苷酸的一員的替代方 法(例如，參照非專利文獻12)中，也可以通過熒光物質(zhì)標識核苷酸。這時，也有通過特開 昭60-500717號公報(專利文獻5)中公開的合成法由脫氧尿苷化學合成5位上具有連接 臂的尿苷，在上述寡核苷酸鏈中引入熒光物質(zhì)的方法。通過發(fā)光物質(zhì)標識的方法和通過生物素標識的方法，通?？梢愿鶕?jù)該領域中采用 的發(fā)光標識或生物素標識核苷酸的常規(guī)方法進行。作為本發(fā)明涉及的人型結核菌檢測用探針，可以列舉含有寡核苷酸(本發(fā)明的寡 核苷酸)的探針(以下稱為本發(fā)明的探針)，該寡核苷酸含有序列號1、序列號2、序列號3、 序列號4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部，或其互補 序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交。在本發(fā)明的探針中使用的本發(fā)明的寡核苷酸的具體例子如前述的本發(fā)明的寡核 苷酸的敘述中所述。本發(fā)明的探針例如在符合作為目的的核酸雜交條件下，由含有序列號1 8所述 的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互補序列的部分或全部的寡核苷酸，計算解 鏈溫度(Tm值)等，可以以合適的長度使用合適的區(qū)域。但是，考慮到使探針具有充分的特 異性，同時為了維持作為探針序列的特異性所需的堿基數(shù)，優(yōu)選具有10個堿基或以上，更 優(yōu)選20個堿基或以上的長度。另外，序列號6、序列號7或序列號8中所述的核酸序列是通過使用本發(fā)明的引物 進行PCR而被擴增的核酸序列。例如，序列號6中所述的核酸序列是通過以序列號1中所 述的核酸序列的寡核苷酸作為正向引物，序列號3中所述的核酸序列的寡核苷酸作為反向 引物進行PCR而被擴增的序列；序列號7中所述的核酸序列是通過以序列號2中所述的核 酸序列的寡核苷酸作為正向引物，序列號4中所述的核酸序列的寡核苷酸作為反向引物進 行PCR而被擴增的序列；序列號8中所述的核酸序列是通過以序列號4中所述的核酸序列 的互補鏈序列的寡核苷酸(序列號14)作為正向引物，序列號5中所述的核酸序列的寡核 苷酸作為反向引物通過PCR而被擴增的序列。獲得本發(fā)明的探針的方法如在獲得前述的本發(fā)明的核苷酸的方法中所述。本發(fā)明的探針可以通過標識物質(zhì)被標識。作為通過標識物質(zhì)標識本發(fā)明的探針中所使用的標識物質(zhì)，可以使用放射性同位 素或酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物素等公知的標識物質(zhì)的任一種。標識本發(fā)明的探針的標識物質(zhì)的具體例子和標識方法如在本發(fā)明的引物的標識方法的敘述中所述。另外，作為后述的實時PCR檢測法中使用的標識探針，可以列舉通過在實時檢測 法中通常使用的標識物質(zhì)對本發(fā)明的探針進行了標識的探針。例如，可以列舉5'末端使用 報告熒光物質(zhì)(羧基熒光素(FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)等)標識的，3' 末端使用猝滅劑染料(例如羧基四甲基若丹明(TAMRA)等熒光物質(zhì)、Black Hole Quenc her 染料BHQ，4-((4-二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等的非熒光物質(zhì))標識的本發(fā) 明的寡核苷酸。作為在本發(fā)明涉及的人型結核菌的檢測中使用的試樣，可以列舉人的痰、血液、經(jīng) 支氣管采樣等的各種臨床材料。另外，也可以是從樣品中分離培養(yǎng)的培養(yǎng)菌、自它們分離純 化的核酸、或通過核酸擴增檢測體系等被擴增的核酸。從上述試樣提取、純化DNA可以依據(jù)從樣品中提取抗酸菌(結核菌)DNA中使用的 常規(guī)方法進行。例如在以菌體作為試樣時，例如可以列舉通過SDS等表面活性劑或硫氰酸胍 (GTC)等蛋白變性劑處理菌體以破壞結核菌的膜結構的方法、通過玻璃珠等物理壓碎菌體 的方法等。以痰作為試樣時，作為前處理，可以通過美國疾病管理預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，簡稱 CDC)推薦的 NALC (N-乙酰 _L_ 半胱氨酸)-NaOH 法(非專利文獻13)進行樣品的均質(zhì)化。然后，可以通過一般的DNA制備法(酚/氯仿提取、乙醇沉淀法等，Rapid and simple method for purification of nucleic acids,J. Clin. Microbiol. ,1990 年 3 月； 28(3) ,495-503, Boom R，Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, ffertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J)進行DNA的提取和純化。從樣品中分離、培養(yǎng)的培養(yǎng)菌用作檢測人型結核菌的試樣時的例子有例如收集小 川培養(yǎng)基上的菌落，懸浮在滅菌蒸餾水中，離心分離收集菌體后，再懸浮在蒸餾水中，高壓 滅菌釜處理后，經(jīng)菌體的粉碎處理(通過玻璃珠進行物理壓碎等)，再離心分離回收上清 液。從所得的上清液中可以提取純化DNA。對于DNA的提取純化，由于市售有各種試劑盒， 因此可以使用這些試劑盒進行，也可以根據(jù)該領域中的常規(guī)方法(例如，酚/氯仿提取法、 使用乙醇或異丙醇等使沉淀的方法等)進行。例如，可以使用(株)“，‘〃制離子交換 樹脂類型的DNA提取純化試劑盒Genomic-tip等進行DNA的提取、純化。作為本發(fā)明涉及的人型結核菌的檢測方法，可以列舉將含有序列號1、序列號2、 序列號3、序列號4或序列號5中所述的核酸序列的部分或全部，或含有其互補序列的部分 或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物和/或探針 的方法(使用本發(fā)明的引物和/或探針的方法)。例如，使用本發(fā)明的引物，使其與試樣中的核酸雜交，通過DNA聚合酶等進行核酸 擴增(例如PCR;專利文獻6)使引物延伸，因為對于人型結核菌，可以使IS6110核酸序列 的特異區(qū)域的序列擴增，通過測定所得引物延伸物，可以檢測人型結核菌。作為本發(fā)明涉及的使用本發(fā)明的引物檢測人型結核菌的檢測方法的具體例子，可 以列舉“人型結核菌的檢測方法，其特征在于包括下述步驟(i)使用含有序列號1、序列號 2、序列號3、序列號4或序列號5中所述的核酸序列的部分或全部，或含有其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物(本發(fā)明 的引物)，以試樣中的核酸作為模板進行PCR，(ii)對于上述(i)所得的引物延伸物進行電 泳，由其結果判斷有無人型結核菌”。在上述方法中使用的本發(fā)明的引物的具體例子如前所述。優(yōu)選地，可以列舉以含有序列號1或2中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補 序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為正 向引物，以含有序列號3或4中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全 部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為反向引物。使用 上述引物的PCR、及接下來進行電泳法的條件、操作方法等可以參照該領域中 通常使用的常規(guī)方法。作為進行電泳并由其結果判斷有無人型結核菌的方法，例如可以例舉(a)通過確 認目標堿基對數(shù)的引物延伸物部分來判斷的方法、(b)通過使用標識探針的雜交來判斷的
方法等。作為(a)通過確認目標堿基對數(shù)的引物延伸物部分來判斷的方法，例如可以列舉 使用序列號1所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號3所述的寡核苷酸作為反向引物， 進行PCR后，對所得的引物延伸物進行電泳，對確認有178個堿基對部分的試樣判斷為陽性 的方法。另外，例如也可以是使用序列號2所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號4所 述的寡核苷酸作為反向引物，進行PCR后，對所得的引物延伸物進行電泳，對確認有182個 堿基對部分的試樣判斷為陽性的方法。另外，例如也可以是使用序列號14所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號5 所述的寡核苷酸作為反向引物，進行PCR后，對所得的引物延伸物進行電泳，對確認有324 個堿基對部分的試樣判斷為陽性的方法。作為通過使用(b)的標識探針的雜交進行判斷的方法，例如，可以列舉在進行電 泳后，對于所得的電泳部分，進行使用標識物質(zhì)標識的標識探針與本發(fā)明的核苷酸的雜交， 通過檢測該標識探針的標識，確認與該標識探針雜交的部分是否存在，以判斷陽性的方法。例如，可以列舉以使用序列號1所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號3所述 的寡核苷酸作為反向引物進行PCR的情況為例，PCR后，進行電泳，對于所得的部分，進行使 用標識物質(zhì)標識的標識探針與含有序列號6中所述的核酸序列的寡核苷酸的雜交，通過檢 測該標識探針的標識，確認與該標識探針雜交的部分是否存在，以判斷陽性的方法。另外，使用序列號2所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號4所述的寡核苷酸 作為反向引物進行PCR時，PCR后，進行電泳，對于所得的部分，進行使用標識物質(zhì)標識的標 識探針與含有序列號7所述的核酸序列的寡核苷酸的雜交，通過檢測該標識探針的標識， 確認與該標識探針雜交的部分是否存在，以判斷陽性的方法。另外，使用序列號14所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號5所述的寡核苷 酸作為反向引物進行PCR時，PCR后，進行電泳，對于所得的部分，進行使用標識物質(zhì)標識 的標識探針與含有序列號8所述的核酸序列的寡核苷酸的雜交，通過檢測該標識探針的標 識，確認與該標識探針雜交的部分是否存在，以判斷陽性的方法。可以列舉下述例子來詳細說明本發(fā)明涉及的人型結核菌的檢測方法例如進行PCR以及電泳后，其中PCR使用序列號2所述的寡核苷酸作為正向引物，序列號4所述的寡 核苷酸作為反向引物，通過確認目標堿基對數(shù)的引物延伸物部分的方法進行檢測，如下所 述。首先，根據(jù)前述方法，從應該檢出人型結核菌的試樣中得到純化的DNA試樣。另 夕卜，通過前述的方法，從本發(fā)明涉及的核苷酸，使用DNA合成儀，根據(jù)磷酰胺法，合成序列號 2所示的序列(以下稱為IS_F6)和序列號4所示的序列(以下稱為IS_R6)的寡核苷酸。
制備含有各0. 2 2. Ομπι 的 IS_F6 和 IS_R6、1. O 4. OmM MgCl2、80mMKCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. 005 0. 2% Triton X-100 (卜'J 卜 > X-100、聚氧乙烯辛 苯基醚、rohm-and-haas 公司商品名)、分別為 0. 1 0. 6mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 禾口 10 80單位/mL的Taq DNA聚合酶的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 9)，作為PCR用反應 液。向PCR用反應液中添加Ing純化的DNA試樣使用作PCR用試樣，通過DNA熱循環(huán) 儀，進行20-40次PCR。對PCR后所得的5 μ L反應液進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。接著溴 化乙錠染色后，用紫外線檢測熒光。另外，分子量標記也與反應液一起遷移，通過比較相對 遷移程度，計算出被檢測的DNA片段的長度。在使用IS_F6作為正向引物和IS_R6作為反 向引物的PCR中，預測IS6110的核酸序列中的182個堿基對的DNA片段(序列號7)被復 制。其中，182個堿基對的熒光條帶被確認的試樣可以判斷為陽性。作為本發(fā)明涉及的使用寡核苷酸作為引物的人型結核菌的檢測方法的其他實施 方式，可以列舉將本發(fā)明的引物使用前述方法標識的標識引物，進行以試樣中的核酸作為 模板的PCR，在通過測定所得引物延伸物的標識可以檢測到標識的情況下，判斷人型結核菌 陽性的方法。上述方法中，在進行PCR后，除去游離的標識引物，測定引物延伸物的標識，可以 檢測到標識時，判斷為人型結核菌陽性。作為除去游離的標識引物的方法，可以列舉通過使核酸沉淀的常規(guī)方法(乙醇沉 淀法、使用異丙醇的沉淀法等)使進行PCR后所得的反應物中的引物延伸物沉淀，然后除去 含有未沉淀的游離標識弓I物的上清液的方法。另外，也可以列舉在適當?shù)臈l件下，通過凝膠層析法處理進行PCR反應所得的反 應物，分離引物延伸物和游離的標識引物的方法，通過電泳分離的方法等。對于本發(fā)明的人型結核菌的檢測方法，也可以使用實時擴增檢測體系(例如參照 專利文獻7、專利文獻8的記載)。作為通過實時擴增檢測體系的檢測體系例子，可以列舉實時PCR檢測體系。例如，可以在本發(fā)明的人型結核菌的檢測方法中使用TaqMan 實時PCR法(例 如參照專利文獻8的記載)、MGB Eclipse Probe System法(例如參照專利文獻9的記 載)、Molecular Beacons Probe Technology 法(例如參照專利文獻 10 的記載)、LUX Fluorogenic Primer 法(InvitrogenCorporation)、Quenching probe-PCR(QP)法(例如 參照專利文獻11的記載)等各種實時PCR檢測法。更加具體地，通過使用以FAM標識5'末端，TAMRA標識3'末端的探針的TaqMan 實時PCR法(例如參照專利文獻8的記載)，可以高靈敏度且定量地檢測目標的微量的DNA。S卩，使用含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號4或序列號5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列 雜交的寡核苷酸作為引物(本發(fā)明的引物)，使用含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號 4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8中所述的核酸序列的部分或全部或其互補序列 的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡 核苷酸)的5'末端通過報告熒光染料被標識，3'末端通過猝滅染料被標識的寡核苷酸作 為標識探針，試樣中的核酸作為模板，進行PCR，通過檢測從該標識探針游離的標識物質(zhì)而 進行的方法。上述TaqMan 實時PCR法的原理如下所示。 可以使用通過熒光染料(報告分子) 標識5'末端，猝滅染料標識3'末端的、在目標基因的特定區(qū)域雜交的寡核苷酸探針。該 探針在通常的狀態(tài)下，通過猝滅染料抑制報告分子的熒光。在完全使該熒光標識探針與目 標基因雜交的狀態(tài)下，從其外側使用TaqDNA聚合酶進行PCR。如果通過TaqDNA聚合酶進行 延伸反應，則熒光標識探針由于該核酸外切酶活性而自5'端水解，報告染料游離，發(fā)出熒 光。實時PCR法通過實時地監(jiān)測該熒光強度，可以正確地測定模板DNA的初期量。作為本發(fā)明涉及的實時PCR檢測體系中使用的、通過熒光染料(報告分子)標識 5'末端、猝滅染料標識3'末端的探針中使用的探針，可以是前述的本發(fā)明的探針，或由所 述探針序列設計的探針。例如，可以列舉由序列號6設計的序列號11所示的序列。另外，作 為標識5'末端的報告熒光物質(zhì)，可以列舉FAM、HEX、TET等，其中優(yōu)選FAM。作為標識3' 末端的猝滅染料，可以列舉TAMRA等熒光物質(zhì)、BHQ、DABCYL等非熒光物質(zhì)，其中優(yōu)選TAMRA。作為本發(fā)明涉及的實時PCR檢測體系中使用的正向引物的優(yōu)選例子，可以列舉含 有序列號1或2中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全部，并且與人型 結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，作為反向引物的優(yōu)選例子，可以列舉含 有序列號3或4中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全部，并且與人型 結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。實時PCR檢測體系中所使用的其他的脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、 DNA聚合酶等試劑，可以使用在通常的實時PCR中所使用的試劑，實時PCR技術除了使用本 發(fā)明的引物和探針以外，也可以根據(jù)實時PCR的一般方法進行。闡述本發(fā)明涉及的通過實時PCR檢測體系(TaqMan 實時PCR法)檢測人型結核 菌的檢測方法的例子如下所示。首先，根據(jù)前述方法，從可以檢測人型結核菌的試樣中制得純化的DNA試樣。另 夕卜，使用DNA合成儀，通過磷酰胺(* 7 * 7 S夕M卜)法合成序列號1所示的序列(IS_ F5)、序列號3所示的序列(IS_R5)的寡核苷酸。另外，自通過使用IS_F5和IS_R5作為引物進行PCR而擴增的序列號6的寡核苷 酸設計用作探針的序列(序列號11)，合成該序列的寡核苷酸。通過常規(guī)方法將報告染料 FAM鍵合至該寡核苷酸的5'末端，將報告消光體TAMRA鍵合至該寡核苷酸的3'末端，制得 熒光標識探針。使用上述制備的IS_F5作為正向引物，IS_R5作為反向引物，例如如下所示進行實 時 PCR。即，制備含有各1 μ M的引物IS_F5和引物IS_R5、100 1 OOOnM熒光標識探針、 1.0 4. OmM MgCl2、80mM KCl、500yg/mL BSA、0. 1 %膽酸鈉、0. 005 0. 2% TritonX-100、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10 80 單位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶的 IOmM Tris-HCl緩沖液(pH8. 9)，作為反應液。向20 μ L反應液中加入Ing純化的DNA試樣作為 PCR用試樣，加入到96孔反應板的孔中，使用TaqManTMpCR專用實時PCR檢測裝置進行實時 PCR0反應進行30 50個循環(huán)，測定每次循環(huán)報告染料的發(fā)光量。在人型結核菌的判斷中，測定報告染料的發(fā)光量時，可以判斷人型結核菌陽性。另外，在實時PCR法中，由于可以 制作校正曲線，因此可以制得試樣中的人型結核 菌的基因組DNA的數(shù)目(拷貝數(shù))。另外，由于該數(shù)目與人型結核菌的數(shù)目成比例，因此也 可以得到試樣中的人型結核菌的數(shù)目。校正曲線的制作方法可以參照實時PCR方法中通常 進行的常規(guī)方法進行。例如，使用拷貝數(shù)已知的人型結核菌的基因組DNA試樣作為標準，制 備稀釋系列的濃度(拷貝數(shù))的PCR用DNA試樣。接著，使用各稀釋系列的PCR用DNA試 樣，根據(jù)上述方法進行實時PCR，測定報告染料的發(fā)光量。在各個稀釋系列的PCR用DNA試 樣中，繪制相對PCR的各個循環(huán)數(shù)(χ軸)測定的發(fā)光量的測定值(Rn、y軸)，制作成擴增 曲線。接著，選擇發(fā)光量呈指數(shù)函數(shù)地擴增的Rn部，引入臨界線(Threshold line) (Th)。 Th和各個PCR用DNA試樣的擴增曲線的交叉點為臨界循環(huán)(ThresholdcycleMCt)值。接 著繪制相對使用的各個PCR用DNA試樣的拷貝數(shù)的對數(shù)值(χ軸)的Ct值(y軸)，對應各 Ct所得的近似曲線可以作為校正曲線。對于定量試樣中的人型結核菌的基因組DNA的數(shù)目(拷貝數(shù))，首先，從可以檢測 人型結核菌的試樣中分離純化DNA，然后，對所得的DNA試樣進行實時PCR，同樣地制作擴增 曲線。得到在制作校正曲線時的Th和所得擴增曲線交叉的Ct值。通過將該Ct值應用于 校正曲線，由此可以獲得試樣中的人型結核菌的基因組DNA量(拷貝數(shù))。另外本發(fā)明在核酸擴增步驟中，可以應用利用RNA轉錄產(chǎn)物的檢測法。例如，可以 列舉NASBA(基于核酸序列的擴增)法(專利文獻12)、3SR(自我維持的序列擴增)法(專 利文獻13)等，其中利用逆轉錄酶和RNA聚合酶的協(xié)同作用(逆轉錄酶和RNA聚合酶在協(xié) 同地作用的條件下反應)的特定溫度核酸擴增法適用于測定系統(tǒng)的自動化。另外，作為本發(fā)明的人型結核菌的檢測方法，可以列舉通過標識物質(zhì)標識含有序 列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8中所述的核 酸序列的部分或全部、或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核 酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)作為標識探針，使該標識探針與試樣中的核 酸雜交，除去游離的標識探針后，檢測雜交復合體的標識的方法。具體地，可以列舉例如(a)將本發(fā)明的寡核苷酸結合在固相載體上，用作捕捉探 針，使其與試樣中的核酸雜交，使試樣中的人型結核菌衍生的核酸固定在固相上的檢測法 (例如，參照專利文獻15的記載)，(b)使用(a)的捕捉探針和本發(fā)明的標識探針，使其與 試樣中的核酸雜交，在固相載體上形成捕捉探針和人型結核菌衍生的核酸和標識探針的復 合體，進行測定標識探針的夾心試驗(例如，參照專利文獻14的記載)的方法等?；蛘咭?可以使用(c)使用生物素標識的本發(fā)明的標識探針，與試樣中的核酸雜交后，通過抗生物 素蛋白結合載體捕捉試樣中的人型結核菌衍生的核酸的方法。另外，在本發(fā)明的人型結核菌的檢測方法中所使用的試劑中，可以使用通常在該 領域中所使用的試劑類，例如緩沖劑等穩(wěn)定劑、防腐劑等不會妨礙共存試劑等的穩(wěn)定性、不 會妨礙PCR或雜交反應的試劑。另外，其濃度也適宜選擇通常在該領域中經(jīng)常使用的濃度范圍。
如果列舉緩沖液的具體例子，完全可以列舉例如三羥甲基氨基甲烷緩沖液、磷酸 緩沖液、佛羅那緩沖液、硼酸緩沖液、良好緩沖液(V ‘7 K緩衝液)等在實施通常的PCR或 雜交反應時所使用的緩沖液，其PH也沒有特別的限制，通常優(yōu)選5 9。另外，根據(jù)需要，可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶等)、對 應酶的基質(zhì)(dNTP、rNTP等)、或者雙鏈嵌入劑(溴化乙錠、SYBR Green等)或者FAM或 TAMRA等標識檢測物質(zhì)等。作為本發(fā)明涉及的人型結核菌檢測用試劑盒，可以列舉“包含含有序列號1、序列 號2、序列號3、序列號4或序列號5所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或 全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物(本發(fā)明的引 物)的人型結核菌檢測用試劑盒?！币镆部梢詾橥ㄟ^標識物質(zhì)標識的引物。上述試劑盒還可以包含使用標識物質(zhì)標識的本發(fā)明寡核苷酸作為標識探針。另外，可以列舉“包含下述組成試劑的試劑盒，(1)含有序列號1或2所述的核酸 序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸 序列雜交的寡核苷酸作為正向引物，(2)含有序列號3或4所述的核酸序列的部分或全部， 或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷 酸作為反向引物”。 上述試劑盒還可以包含使用標識物質(zhì)標識本發(fā)明的寡核苷酸作為標識探針。另外，可以列舉“包含本發(fā)明的寡核苷酸作為探針的人型結核菌檢測用試劑盒”。 所述探針也可以使用標識物質(zhì)標識。組成這些試劑盒的組成試劑的優(yōu)選方式和具體例子如前所述。另外，在本發(fā)明的人型結核菌的檢測用試劑盒中，也可以含有例如緩沖劑等穩(wěn)定 齊U、防腐劑等不會妨礙共存試劑等的穩(wěn)定性、不會妨礙PCR或雜交反應的試劑。另外，其濃 度也可以適合選擇通常在該領域中經(jīng)常使用的濃度范圍。如果列舉緩沖液的具體例子，完全可以列舉例如三羥甲基氨基甲烷緩沖液、磷酸 緩沖液、佛羅那緩沖液、硼酸緩沖液、良好緩沖液等在實施常規(guī)PCR或雜交反應時所使用的 緩沖液，其PH也沒有特別的限制，通常優(yōu)選5 9的范圍。另外，根據(jù)需要，可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉錄酶等)、對 應酶的基質(zhì)(dNTP、rNTP等)、或者雙鏈嵌入劑(溴化乙錠、SYBR Green等)或者FAM或 TAMRA等標識檢測物質(zhì)等。以下列舉實施例，更加具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不會因此而受到任何的限制。 實施例實施例1(1)合成結核菌檢測用PCR引物使用ABI公司DNA合成儀392型，通過磷酰胺法，合成序列號2所 示的序列(ACCTCACCTATGTGTCGACC，以下稱為IS_F6)禾Π序列號4所示的序列 (AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG，以下稱為IS_R6)的寡核苷酸。合成方法參照ABI公司手冊， 通過在55°C下對寡核苷酸的氨水溶液加熱一晚實施各種寡核苷酸的脫保護。接著，通過Pharmacia公司生產(chǎn)的使用FPLC的陰離子交換柱色譜，對合成的寡核苷酸純化。(2)制備試樣使用如下所示的細菌，通過下述的方法提取、純化DNA，得到DNA試樣。細菌每一種都有臨床分離株，培養(yǎng)后，通過菌落的形狀和歷來的各種生化試驗等就可以鑒別出菌種來。首先，對于分枝桿菌(Mycobacterium)屬細菌，使小川培養(yǎng)基上的菌落懸浮在純 化水上，高壓滅菌釜處理(120°C · 2個大氣壓、20分鐘)后，經(jīng)菌體的粉碎處理(通過直徑 2mm玻璃珠進行物理壓碎)，離心分離，得到上清液。由所得的上清液，使用(株)* 7 Y夂 制的離子交換樹脂型DNA提取純化試劑盒Genomic-tip進行DNA的提取、純化。另外，對于 大腸桿菌，根據(jù)大腸桿菌的DNA提取方法的常規(guī)方法提取和純化DNA。所得的純化DNA最后配制成Ing/μ L(10mM Tris-HCl緩沖液、ρΗ8. 9)，作為DNA試 樣。a 大腸桿菌(Escherichia coli)b 結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f 瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝!flif (Mycobacterium gordonae)h:斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)j 內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)m 無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 膿腫分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)(3) PCR使用上述(1)制備的IS_F6作為正向引物，IS_R6作為反向引物，如下所述進行 PCR。首先，制備含有各ΙμΜ 的引物 IS_F6 和引物 IS_R6、1. 5mM MgCl2、80mM KCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. TritonX-100 (卜'J 卜 > X-100、聚氧乙烯辛苯基醚、 rohm-and-haas 公司商品名)、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 40 單位 /mL 的 Taq DNA聚合酶(株)二 ^ # 乂 ·夕一 乂制)的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 9)，作為PCR用
反應液。在20μ L的PCR用反應液中添加Ing DNA試樣用作PCR用試樣，通過MJ Research公司的DNA熱循環(huán)儀(DNA Engine PCT200)，在下述反應條件下進行30個循環(huán)的PCR。PCR反應條件熱變性94°C、0. 5分鐘退火55°C、1分鐘聚合反應75°C、0.5分鐘。(4)檢測5yL上述(3)所得的PCR后的反應液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳的電 學條件為恒電壓100V，進行30分鐘。操作方法和其他條件參照生物實驗說明的第2卷， p53-63(秀潤社、中 山廣樹著)中所述的一般使用的方法。接著，溴化乙錠染色后，使用UV 樣本攝影裝置FAS-III系統(tǒng)(東洋紡織(株)制)通過紫外線檢測熒光。另外，分子量標 記也與反應液一起遷移，通過比較相對遷移程度，計算出被檢測的DNA片段的長度。另外， 分子量標記使用Xl7VHaein消化(標記4、(株)二 〃 # 乂 ·夕一乂制)。(5)結果所得的電泳結果如圖1所示。在圖1中，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用以下的試樣時的結果。M4 分子量標記(標記4)a 大腸桿菌(Escherichia coli)b 結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f 瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)j 內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)m 無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Myeobaeterium peregrinum)通過使用正向引物IS_F6和反向引物IS_R6進行PCR，預計IS6110的核酸序列中 的182個堿基對的DNA片段(序列號7)被復制。因此，182個堿基對的熒光條帶被證實則 判斷為陽性。由圖1的結果可以明白使用本發(fā)明的引物IS_F6和引物IS_R6進行PCR，結果僅使用結核分枝桿菌作為試樣時(b)可確認182個堿基對的熒光條帶，可以判斷為陽性。與 之相反，使用其他的分枝桿菌屬細菌或其他屬的細菌即大腸桿菌試樣作為試樣時(a和c s)，不能證實相應的熒光條帶，完全可以判斷為陰性 如上，通過在PCR中使用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物，判斷可以特異地檢測人型 結核菌。另外，可以預期通過PCR等的核酸擴增具有高靈敏度，不必要分離細菌，就可以直 接在檢測中使用臨床材料，對人型結核菌的檢測最長也就1日以內(nèi)即可以結束，而通過現(xiàn) 有的培養(yǎng)細菌的檢測方法則需要花數(shù)周時間在培養(yǎng)上。實施例2(1)合成結核菌檢測用PCR引物使用與實施例1⑴相同的儀器，在相同的操作下，合成序列號1所 示的序列(TGGGTAGCAGACCTCACCTAT，以下稱為IS_F5)禾Π序列號3所示的序列 (CGAGTACGCTTTCTTGTTGG,以下稱為 IS_R5)的寡核苷酸。(2)制備試樣使用實施例1 (2)中所得的DNA試樣。(3) PCR上述(1)制備的IS_F5用作正向引物、IS_R5用作反向引物，如下所述進行PCR。首先，制備含有各ΙμΜ 的引物 IS_F5 和引物 IS_R5、1. 5mM MgCl2、80mM KCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. 1% TritonX-100、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 禾口 40單位/mL的Taq DNA聚合酶(株)二 ^ # 乂 ·夕一 乂制)的IOmM Tris-HCl緩沖液 (pH 8. 9)，作為PCR用反應液。向20 μ L的PCR用反應液中添加Ing DNA試樣用作PCR試樣，使用與實施例1 (3) 中使用的相同儀器，在同樣的反應條件下進行PCR。(4)檢測在與實施例1(4)同樣的方法下，進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，通 過紫外線檢測熒光。(5)結果所得的電泳結果如圖2所示。在圖2中，各泳道數(shù)字分別表示分別使用以下試樣時的結果。Μ4 分子量標記(標記4)a 大腸桿菌(Escherichia coli)b 結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f 瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)j 胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)
k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi))m 無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)
ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)另外，通過使用正向引物IS_F5和反向引物IS_R5的PCR，預計IS6110的核酸序列 中的178個堿基對的DNA片段(序列號6)被復制。因此，178個堿基對的熒光條帶被證實 則判斷為陽性。比較例1基于公知的IS6110序列，通過使用所制備的引物序列的檢測法(特表平 11-514522號公報專利文獻11)進行人型結核菌的檢測。(1)合成結核菌檢測用PCR引物特表平11-514522中公開的引物序列中，合成“TTCGGACCACCAGCACCTAACC” (序列 號9、以下稱為IS_F2)和“CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG” (序列號10，以下稱為IS_R2)的寡核苷酸。合成使用與實施例1(1)同樣的儀器，在同樣的操作下進行。(2)制備試樣 使用實施例1⑵所得的DNA試樣。(3) PCR上述(1)制備的IS_F2用作正向引物、IS_R2用作反向引物，如下所述進行PCR。首先，制備含有各ΙμΜ 的引物 IS_F2 和引物 IS_R2、1. 5mM MgCl2、80mM KCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. 1% TritonX-100、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 禾口 40單位/mL的Taq DNA聚合酶(株)二 ^ # 乂 ·夕一 乂制)的IOmM Tris-HCl緩沖液 (pH 8. 9)，作為PCR用反應液。向20 μ L的PCR用反應液中添加Ing DNA試樣用作PCR用試樣，使用與實施例1 (3) 中使用的相同儀器，在同樣的反應條件下進行PCR。(4)檢測在與實施例1(4)同樣的方法下，進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，通過 紫外線檢測熒光。另外，分子量標記使用λ./Hind III消化(標記1) (Ml泳道)或X174/ HaeIII消化(標記4)(都是(株)二 〃 乂 ·夕一 V制)。(5)結果所得的電泳的結果如圖3-1所示。在圖3-1中，另外，各泳道的數(shù)字分別表示使用各個以下試樣時的結果。Ml 分子量標記(標記1)M4 分子量標記(標記4)
a:大腸桿菌(Escherichia coli)b 結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f 療; 分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)j 內(nèi)ife木干胃(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi))m 無色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)另外，預計通過使用正向引物I S_F2、反向引物I S_R2進行PCR所復制的是IS6110 的核酸序列中的197個堿基對的DNA片段。因此，197個堿基對的熒光條帶被證實則判斷為 陽性。如從實施例2中所得的圖2的結果可以明白使用本發(fā)明的引物IS_F5、引物IS_ R5時，僅僅使用人型結核菌(b)作為試樣時可以證實178個堿基對的熒光條帶，可以判斷 為陽性。對此，在使用其他的分枝桿菌屬細菌或其他屬細菌大腸桿菌作為試樣時(a和c s)，沒有觀察到相應的熒光條帶，完全可以判斷為陰性。另一方面，如從比較例1中所得的圖3-1的結果可以明白，使用公知的引物IS_F2、 引物IS_R2進行PCR時，可以判斷人型結核菌作為試樣時為陽性，除此之外，在使用無色分 枝桿菌作為試樣(m)和次要分枝桿菌作為試樣時(ο)，也可以證實具有顯著的條帶，這被判 斷為假陽性。在圖3-1中將使用無色分枝桿菌作為試樣時(m)的條帶以虛線圍成的圓表示。 另外，將使用次要分枝桿菌作為試樣時(ο)的條帶以箭頭指向的虛線圓圈表示。S卩，在比較例1的方法中，判定為難以特異地檢測人型結核菌。因此，從比較例1的電泳結果尤其注意到了被判斷為與人型結核菌的陽性條帶和 擴增片段大小非常相似的次要分枝桿菌試樣(ο)。圖3-1中箭頭處，尤其顯示了該條帶。為 了進一步分析該PCR產(chǎn)物，在切下遷移部分的PCR產(chǎn)物、進行DNA純化后，使用ABI公司的 序列試劑盒根據(jù)PCR-直接序列法進行序列分析。所得的序列如圖3-2所示。圖3-2所示的序列中，部分(b)的人型結核菌衍生的 PCR產(chǎn)物的序列作為第一核苷酸序列(1st NucleotideSequence)，序 列表的上段所示(序 列號12)。另外，由部分(ο)所得的次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)衍生的PCR產(chǎn)物的序列作為第二核苷酸序列(2nd Nucleotide Sequence)，序列表的下段所示(序列號 13)。DNA片段的序列分析結果證實了這是次要分枝桿菌(Mycobacteriumtriviale)衍 生的核酸序列，對于人型結核菌特有的IS6110的核酸序列而言，其僅與比較例1使用的引 物IS_F2和引物IS_R2的序列部位一致。因此，使用該公知的引物IS_F2、引物IS_R2進行 PCR時，發(fā)現(xiàn)人型結核菌以外的核酸序列也擴增，證實了在引物的設計上存在明顯的缺點。
由上可知使用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物，通過PCR進行人型結核菌的檢測，與 使用現(xiàn)有技術的引物進行結核菌的檢測法相比，可以排除假陽性的判斷，在特異地且高精 度地檢測人型結核菌方面，與現(xiàn)有技術的引物和使用它們的人型結核菌的檢測法相比，非 常優(yōu)異。實施例3通過實時PCR擴增體系檢測結核菌(1)合成結核菌檢測用PCR引物使用與實施例1(1)相同的儀器，在同樣的操作下，合成IS_F5和IS_R5的寡核苷酸。(2)制作結核菌檢測用探針由通過使用IS_F5和IS_R5作為引物進行PCR擴增所得的序列號6的寡核苷酸序 列，設計用作探針的序列“ACCGACGCCTACGCTCGCAG”，合成該序列的寡核苷酸(以下稱為IS_ F5R5_FAMTAM。序列號11)。在該寡核苷酸的5'末端結合報告染料FAM，3'末端結合報告消 光體TAMRA，得到標識的寡核苷酸探針(TaqMan fluorescent probe,applied biosystems japan -^WjfjjlJ )。(3)制備PCR用DNA試樣對于實施例1(2)中制備的結核分枝桿菌試樣所得的DNA試樣，通過測定其吸光度 測定試樣中的DNA量。所得的DNA量通過與已知的結核分枝桿菌的基因組DNA量比較，確 定試樣中的基因組DNA量(基因組拷貝數(shù))。得到IO8個拷貝/ μ L的基因組DNA。接著使用IOmM ρΗ8· 9 的 Tris-HCl 緩沖液，制備稀釋成 IO5, IO4, IO3, IO2,10，5，2 個 拷貝/ μ L的稀釋系列的DNA試樣作為PCR用DNA試樣。(4)實時 PCR上述(1)制備的IS_F5用作正向引物，IS_R5用作反向引物，如下所述進行實時 PCR。即，制備含有各IyM的引物IS_F5和引物IS_R5、195nM上述(1)制備的熒光 標識探針 IS_F5R5_FAMTAM、1. 5mM MgCl2,80mM KCl、500y g/mL BSA、0. 1 %膽酸鈉、0. 1 % TritonX-100、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 40 單位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 (株)二 ^ # 乂 ·夕一 乂制)的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 9)作為反應液。向20 μ L反應液中添加1 μ L各稀釋系列的DNA試樣作為PCR用試樣，將其加入到 96孔反應板(微擴增光學96孔反應板、7 7 K 才* ；^〒Λ 1 ” \ ^ V社制)的孔 中，使用TaqMan PCR專用熱循環(huán)檢測器(ABI7000、r U八卜、KJ才〉7歹Λ文” \ V 社制)進行實時PCR。反應在95°C保溫10分鐘后，在95°C反應15秒鐘和60°C反應1分鐘 并循環(huán)進行50個循環(huán)，測定每次循環(huán)的報告染料的發(fā)光量。另外，通過使用測定時所用熱循環(huán)儀將供測定的96孔反應板每一板的相對熒光強度比數(shù)值化的功能求得發(fā)光量。(5)結果和分析按照實時PCR法進行的常規(guī)方法制成校正曲線。即，對各PCR用DNA試樣，相對PCR循環(huán)數(shù)(χ軸)繪制報告染料的發(fā)光量(Rn、y 軸)而制作擴增曲線。接著，選擇發(fā)光量隨指數(shù)函數(shù)擴增的Rn部，引出臨界線(Th)。Th和 各PCR用DNA試樣的發(fā)光量交叉的點為臨界循環(huán)(Ct)值。接著，相對使用的各PCR用DNA 試樣的基因組拷貝數(shù)(χ軸、對數(shù)值)繪制Ct值(y軸)，對各個Ct值，所得的近似曲線為校 正曲線。所得的校正曲線如圖4所示。y = -3. 555x+39. 13R2 = 0.996由以上可知由于通過實時PCP可以檢測發(fā)光，那么在PCR中使用本發(fā)明的寡核苷 酸作為引物，由該擴增區(qū)域的序列設計標識引物，通過進行實時PCR，可以檢測人型結核菌。另外，從可以制作校正曲線看出通過使用本發(fā)明的引物和探針的實時PCR法，可 以進行人型結核菌的定量。另外，從圖4可以看出在使用本發(fā)明的引物和探針的實時PCR 法中，在人型結核菌基因組DNA的初期量為2個拷貝的情況下，也可以進行人型結核菌的檢 測。另外，在利用實時PCR法時，由于實時地監(jiān)視該熒光強度，可以正確地測定模板 DNA的初期量，有效地進行人型結核菌的檢測。實施例4利用使用多個引物對在一支管中同時地擴增多個片段的多重PCROmiltiplex PCR)反應，嘗試進行以人型結核菌、鳥分枝桿菌(M. avium)),胞內(nèi)分枝桿菌 (M. intracellulare))和堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii))為對象的結核病與非結核性抗酸 菌病(non-tuberculosis Mycobacteriosis，NTM 癥)的同時診斷(識別診斷)。(1)引物的合成(i)合成結核菌檢測用PCR引物在與實施例1(1)同樣的操作下，制備IS_F5(序列號1)和IS_R6 (序列號4)，分別 作為正向引物、反向引物。(ii)合成鳥分枝桿菌(M. avium)檢測用PCR引物在與實施例1 (1)同樣的操作下，制備特開平11-69999號公報權利要求5所述的 “鳥19千道爾頓蛋白質(zhì)基因區(qū)域中特異的寡核苷酸引物’MV19KF1 (CGGCTGTTCGAGTGGCAACA AGTC，本發(fā)明說明書中序列號15所示。以下稱為“鳥分枝桿菌(M. avium)檢測用引物_Fw”)， 禾口 MAV19K R1(CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC，本發(fā)明說明書中序列號16所示。以下稱為“鳥 分枝桿菌(M. avium)檢測用引物_Rv”)，分別作為正向引物和反向引物。(iii)合成胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)檢測用PCR引物在與實施例1 (1)同樣的操作下，制備特開平11-69999號公報權利要求6所述的 “胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)si基因區(qū)域中特異的寡核苷酸引物”rpslFl (CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCA AGA，本發(fā)明說明書中序列號17所示。以下稱為“胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)檢測 用引物-Fw)，，，和rpsIRl (GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC，本發(fā)明說明書中序列號18所示。以 下稱為“胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)檢測用引物-Rv”，分別作為正向引物和反向引物。(iv)合成堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)檢測用PCR引物在與實施例1 (1)同樣的操作下，制備特開平11-155589號中所述的由堪薩斯分枝 桿菌(M. kansasii)的KATS2序列所設計的引物即圖1所示引物15的、沿5‘方向移動1堿 基的序列(GTCCCTGGCTGCTCTTGA，本發(fā)明說明書中序列號19所示。以下稱為“堪薩斯分枝 桿菌(M. kansasii)檢測用引物-Fw) ”，和引物(Primer) E3 (GCTGGTGGAGATGGAGATGTT，本發(fā) 明說明書中序列號20所示。以下稱為“堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)檢測用引物-Rv”， 分別作為正向引物和反向引物。(2)制備試樣 使用實施例1(2)中所得的人型結核菌、鳥分枝桿菌(M. avium)、胞內(nèi)分枝桿菌 (M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)的 DNA 試樣。(3) PCR制備含有最終濃度為各ΙμΜ的上述(1)合成的正向引物和反向引物、 IOmM Tris-HCl (ρΗ8. 9) U. 5mM MgCl2、80mM KCl、500yg/mL BSA、0. 1 % 膽酸鈉、0. 1 % TritonX-100,分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 40 單位 /mL 的 Taq DNA 聚合酶 (二 y 乂夕一 乂制)的溶液，作為PCR反應用溶液。向20 μ L的PCR用反應液中，如下面表1所述分別添加1 μ L (0 1000個拷貝)DNA 試樣，制備PCR用試樣(1) (7)，對于各個試樣，使用與實施例1(3)中使用的儀器相同的 儀器，在同樣的反應條件下進行PCR。另外，在表1中，avium表示鳥分枝桿菌(M. avium)、 intracellulare ^felf lif (Μ. intracellulare)、kansasii ^/j^ifiSif^felflii (Μ. kansasii)。另外，X分別表示不加DNA試樣的情況，0分別表示加入DNA試樣的情況， 0下0內(nèi)的數(shù)字表示加入的DNA試樣的濃度(拷貝數(shù))。[表 1]
權利要求
選自以下的人型結核菌檢測用引物對(1)(i)由序列號1所述的核酸序列或者其互補序列組成的，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的引物；和(ii)由序列號4所述的核酸序列或者其互補序列組成的，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的引物；(2)(i)由序列號2所述的核酸序列或者其互補序列組成的，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的引物；和(ii)由序列號3所述的核酸序列或者其互補序列組成的，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的引物；(3)(i)由序列號2所述的核酸序列或者其互補序列組成的，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的引物；和(ii)由序列號4所述的核酸序列或者其互補序列組成的，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的引物。
2.權利要求1所述的引物對，其通過標識物質(zhì)被標識。
3.權利要求2所述的引物對，其中標識物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物 質(zhì)或生物素。
4.人型結核菌檢測用試劑盒，其包含權利要求1所述的引物對。
5.權利要求4所述的試劑盒，其中引物通過標識物質(zhì)標識。
6.權利要求4所述的試劑盒，所述試劑盒還包含以由序列號1、序列號2、序列號3、序 列號4、序列號7所述的核酸序列、或其互補序列組成的，并且與人型結核菌的IS6110基因 的核酸序列雜交的寡核苷酸作為探針。
7.權利要求6所述的試劑盒，其中探針通過標識物質(zhì)標識。
8.權利要求4所述的試劑盒，所述試劑盒由以下的任一組合組成(1)由序列號1所述的核酸序列或其互補序列組成的引物、由序列號4所述的核酸序列 或其互補序列組成的引物、和由能夠預測在使用該引物組合的核酸擴增反應中的擴增的核 酸序列或者其互補序列組成的探針；(2)由序列號2所述的核酸序列或其互補序列組成的引物、由序列號3所述的核酸序列 或其互補序列組成的引物、和由能夠預測在使用該引物組合的核酸擴增反應中的擴增的核 酸序列或者其互補序列組成的探針；(3)由序列號2所述的核酸序列或其互補序列組成的引物、由序列號4所述的核酸序列 或其互補序列組成的引物、和由序列號7所述的核酸序列或者其互補序列組成的探針。
9.權利要求4所述的試劑盒，所述試劑盒由以下的任一組合組成(1)由序列號1所述的核酸序列或其互補序列組成的引物、由序列號4所述的核酸序列 或其互補序列組成的引物、和由能夠預測在使用該引物組合的核酸擴增反應中的擴增的核 酸序列或者其互補序列組成的寡核苷酸的5’末端以報告色素標識的，3’末端以猝滅劑染料 色素標識的標識探針；(2)由序列號2所述的核酸序列或其互補序列組成的引物、由序列號3所述的核酸序列 或其互補序列組成的引物、和由能夠預測在使用該引物組合的核酸擴增反應中的擴增的核 酸序列或者其互補序列組成的寡核苷酸的5’末端以報告色素標識的，3’末端以猝滅劑染料色素標識的標識探針；(3)由序列號2所述的核酸序列或其互補序列組成的引物、由序列號4所述的核酸序列 或其互補序列組成的引物、和由序列號7所述核酸序列或者其互補序列組成的寡核苷酸的 5’末端以報告色素標識的，3’末端以猝滅劑染料色素標識的標識探針。
全文摘要
本發(fā)明以提供排除診斷上的假陽性的新穎的結核菌檢測用引物和探針，以及提供使用它們簡便、迅速并且高靈敏度地檢測人型結核菌的方法為課題，涉及含有序列號1、序列號2、序列號3、序列號4、序列號5、序列號6、序列號7或序列號8所述的核酸序列的部分或全部，或其互補序列的部分或全部，并且與人型結核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸；含有所述寡核苷酸的人型結核菌檢測用引物和探針；以及以使用該引物和探針為特征的人型結核菌的檢測方法。
文檔編號C12N15/09GK101935709SQ201010295270
公開日2011年1月5日 申請日期2005年4月22日 優(yōu)先權日2004年4月26日
發(fā)明者石川友一 申請人:和光純藥工業(yè)株式會社