專利名稱：一種生物堿的抗癌應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物堿，尤其是涉及一種生物堿Exfoliazone的抗癌應(yīng)用。
背景技術(shù)：
孤兒受體Nur77 (又稱為TR3或NGFI-B)，是核受體超家族的重要成員，它也是一種 立刻早期基因，其表達(dá)可以被血清、生長(zhǎng)因子、十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)以及鈣信號(hào) 迅速誘導(dǎo)(Zhang XK. et. al. , Expert Opin Ther Tar 2007 ；11 69~79 ；Mo 11 UM, et. al., Oncogene 2006 ；25 =4725-4743) 0 Nur77最初被認(rèn)為是一種細(xì)胞存活因子，它可以從介導(dǎo)多 種存活信號(hào)通路，包括蛋白激酶A、蛋白激酶C、MAPK和NF-KB通路。Nur77表達(dá)的促生長(zhǎng)作 用在多種腫瘤中都被證實(shí)(Chen GQ, et. al.，Int J Cancer 2002 ；99 171-8 ；Wu Q，et. al.， Carcinogenesis 2002 ；23 1583-1592)，已有報(bào)道表明，Nur77的mRNA在癌組織中的表達(dá)水 平明顯高于癌旁組織。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明，Nur77同時(shí)也是一種促凋亡分子。Nur77對(duì)凋亡的 作用首先在未成熟的胸腺細(xì)胞和T-細(xì)胞雜交瘤通過(guò)T-細(xì)胞受體信號(hào)的凋亡中被報(bào)道。 Nur77對(duì)細(xì)胞凋亡的作用已在多種類型的癌細(xì)胞中被證實(shí)，它可以對(duì)多種凋亡因子，如鈣 離子載體、依托泊甙(VP-16)、佛波酯、鎘以及 l，l-Bis(3，-indoly)-1-(p-subsatituted phenyl)methanes 做出應(yīng)答(Stasik I，et. al. ,BBA-Mol Cell Res 2007 ； 1773 1483-1490 ； Gennari A, et.al. , Toxicol ApplPharmacol 2002 ；181 :27_31 ；Liu S, et. al. , World J Gastroenterol 2002 ；8 446-450 ；Wilson AJ, et. al.，Cancer Res 2003 ；63 5401-5407 ； Chintharlapalli S, et. al.，J Biol Chem 2005 ；280 :24903_24914·)。Nur77 的凋亡效應(yīng) 具有臨床上的價(jià)值，當(dāng)以環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿對(duì)病人進(jìn)行治療時(shí)，彌漫性大B細(xì)胞 淋巴瘤病人的存活率和Nur77亞家族成員Nor-I的表達(dá)水平相關(guān)(Shipp MA, et. al.，Nat Med 2002；8 :68_74·)。調(diào)控Nur77的增殖作用和凋亡作用的生物活性機(jī)制之一是通過(guò)Nur77的亞細(xì)胞定 位來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Nur77通過(guò)其在細(xì)胞核中的作用實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)促進(jìn)，這一作用需要Nur77與靶基因 DNA反應(yīng)調(diào)控元件相結(jié)合，即Nur77在細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄激活作用具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的功能。 而Nur77的凋亡作用不依賴于轉(zhuǎn)錄，在其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺失時(shí)，這種凋亡誘導(dǎo)作用仍可發(fā) 生。生物堿Exfoliazone是一種從海洋生物中提取的生物堿，Kimai等(KIMAI S. et al. , Isolationand structure of a new phenoxazine antibiotic, ^ ^Μ Exfoliazone, produced by Streptomycesexfoliates. Journal of Antibiotics,1990,43(12) 1606-1607.)的研究表明，從 Streptomycesexfoliatus 中提取的生物堿 Exfoliazone 具
lifi^ffl ‘ M Shinsuke (Shinsuke I. et. al.Exfoliazone and lavanducyanin,
potent growth promoting substances of rat liver cell line, RLN—8, produced by streptomyces exfoliatus and streptomyces aeriouvifer[J]. J Antibiot,1993,46 (8) 1232-1238)的研究表明，生物堿Exfoliazone對(duì)鼠肝細(xì)胞系具有促生長(zhǎng)作用，但未見(jiàn)其對(duì)
3癌細(xì)胞作用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于，提供一種生物堿Exfoliazone在制備治療癌癥藥物中 的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于，提供一種孤兒受體Nur77作為作用靶點(diǎn)在篩選海洋生 物資源中的應(yīng)用。所述生物堿Exfoliazone可以誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的凋亡，具體的，生物堿Exfoliazone 可以誘導(dǎo)孤兒受體Nur77的表達(dá)，誘導(dǎo)孤兒受體Nur77出核，并且生物堿Exfoliazone是通 過(guò)CRMl途徑誘導(dǎo)Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)，最后引起肝癌細(xì)胞的凋亡，且生物堿Exfoliazone的 凋亡效應(yīng)依賴于Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。生物堿Exfoliazone在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用，是生物堿Exfoliazone作為 一種靶向Nur77凋亡途徑的調(diào)節(jié)因子。所述癌癥為肝癌、肺癌等。所述治療癌癥藥物以孤 兒受體Nur77作為作用靶點(diǎn)。所述以孤兒受體Nur77作為作用靶點(diǎn)在篩選海洋生物資源中 的應(yīng)用。所述篩選是篩選作用于孤兒受體Nur77誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物堿Exfoliazone 等一類海洋生物資源。所述誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過(guò)誘導(dǎo)孤兒受體Nur77的表達(dá)。所述誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過(guò)誘導(dǎo)孤兒受體Nur77出核且依賴于Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。本發(fā)明提供的作用于Nur77誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可以用于指導(dǎo)篩選其它生物堿，從 中獲取具有抗腫瘤活性的化合物，并可將獲得的藥物進(jìn)而制備可作用于孤兒受體Nur77誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性與功能的藥物。本發(fā)明涉及的是從海洋生物中提取的一種生物堿Exfoliazone，其具有誘導(dǎo)腫瘤 細(xì)胞凋亡，且凋亡效應(yīng)依賴于Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。生物堿Exfoliazone作為一種靶向Nur77 凋亡途徑的新的調(diào)節(jié)因子，將成為一種非常有效的癌癥治療藥物。本發(fā)明根據(jù)海洋藥物資源與核受體的關(guān)系，得到一種生物堿Exfoliazone能夠誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，且凋亡效應(yīng)依賴于Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。


圖1顯示生物堿Exfoliazone對(duì)Nur77mRNA水平的調(diào)控結(jié)果。圖2顯示生物堿Exfoliazone對(duì)肝癌細(xì)胞H印G2中Nur77蛋白的表達(dá)量調(diào)控結(jié)果。 該誘導(dǎo)作用具有良好的時(shí)效和量效關(guān)系。圖3顯示生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)內(nèi)源Nur77出核。圖4顯示生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)外源Nur77的出核(通過(guò)CRMl途徑誘導(dǎo))。圖5顯示生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)外源Nur77的凋亡(通過(guò)CRMl途徑誘導(dǎo))。圖6顯示生物堿Exfoliazone對(duì)肝癌細(xì)胞!fepG2生長(zhǎng)的抑制作用。圖7顯示生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞的凋亡。圖8顯示生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)!tepG2細(xì)胞PARP蛋白切割。圖9顯示Annexin V/PI雙染檢測(cè)生物堿Exfoliazone對(duì)!fepG2細(xì)胞的凋亡。圖10顯示外源Nur77介導(dǎo)生物堿Exfoliazone的凋亡效應(yīng)。圖llNur77敲除的MEF細(xì)胞中生物堿Exfoliazone的凋亡效應(yīng)顯著下降。
圖12顯示生物堿Exfoliazone在!fepG2細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)依賴于Nur77的 出核轉(zhuǎn)運(yùn)。圖13顯示生物堿Exfoliazone對(duì)肺癌細(xì)胞H460生長(zhǎng)的抑制作用。圖14顯示生物堿Exfoliazone對(duì)Nur77mRNA水平的調(diào)控結(jié)果。圖15顯示生物堿Exfoliazone對(duì)肺癌細(xì)胞H460中Nur77蛋白的表達(dá)量調(diào)控結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中使用的試劑脂質(zhì)體2000、Trizol 購(gòu)自 Invitrogen 公司，普霉素 A(LMB)購(gòu)自 sigma ;ECL、山 羊抗兔、山羊抗鼠辣根過(guò)氧化物酶二抗購(gòu)自Thermo公司；Cy3標(biāo)記的山羊抗鼠二抗購(gòu)自 Cheniconinternational ；Nur77 多抗(sc-5569)、PARP (sc-556494)及 FITC 標(biāo)記的山羊抗 兔二抗購(gòu)自Santa Cruz ； β-actin抗體購(gòu)自Sigma公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore0無(wú)特別 注明外，其它化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma公司。所采用的生物堿Exfoliazone為北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部林文翰教授的實(shí)驗(yàn)室分離 和鑒定(有關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)已公開，見(jiàn)參考文獻(xiàn)Journal of Antibiotics，1990，43 (12) 1606-1607)。其結(jié)構(gòu)式如下實(shí)施例1在!fepG2細(xì)胞中生物堿Exfoliazone對(duì)于Nur77表達(dá)的誘導(dǎo)作用1、細(xì)胞培養(yǎng)選擇肝癌細(xì)胞株H印G2 (ATCC)，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C含5% C02 的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)于6孔組織培養(yǎng)板中，24h后換液，饑餓12h后進(jìn)行加藥(不含血清) 處理。生物堿Exfoliazone溶解于DMSO(DMS0終濃度< 0. )中，分別以10 μ mol/L、 20 μ mol/L處理6h，陰性對(duì)照組用同樣濃度的DMSO處理6h，而陽(yáng)性對(duì)照組用佛波酯IOOng/ mL (TPA)處理3h，具體處理如下(1)陰性對(duì)照組(DMSO)(2)陽(yáng)性對(duì)照組(TPA)(3)生物堿 Exfoliazone 組(10 μ mol/L)(4)生物堿 Exfoliazone 組(20 μ mol/L)收集細(xì)胞，以備提取RNA。
2、轉(zhuǎn)錄水平分析Nur77的表達(dá)細(xì)胞以TRIZOL提取RNA，然后進(jìn)行RT-PCR，最后PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖膠進(jìn)行分 析，結(jié)果如圖1所示。由圖1的結(jié)果可知，在H印G2肝癌細(xì)胞中，生物堿Exfoliazone可顯著上調(diào) Nur77mRNA 的表達(dá)。3、蛋白水平分析Nur77的表達(dá)為了確證時(shí)效及量效關(guān)系，用生物堿Exfoliazone處理H印G2細(xì)胞，處理濃度為 10ymol/L，20ymol/L，處理時(shí)間為6，12h，以未以任何處理的!fepG2細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞以改進(jìn)的RIPA裂解緩沖液(50mM Tris_Hcl，pH 7. 4 ； 150mM NaCl ；5mM EDTA ； 1% NP-40,0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS)于冰上裂解30min。以相同上樣量，8% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，以 5 % 脫脂奶粉的 TBST(50mM Tris-HCl (pH 7. 4), 150mM NaCl and 0. 1 % Tween20)室溫封閉lh，于室溫2h或4°C過(guò)夜孵育一抗，室溫孵育二抗lh，ECL顯色，曝光。 結(jié)果如圖2所示。由圖2的結(jié)果可知，在!fepG2細(xì)胞中，以10、20 μ mol/L生物堿Exfoliazone作用 于H印G2細(xì)胞6h后，高濃度的生物堿Exfoliazone (20 μ mol/L)可以誘導(dǎo)Nur77的表達(dá)；當(dāng) 作用細(xì)胞12h后，低濃度的生物堿Exfoliazone (10 μ mol/L)即可誘導(dǎo)Nur77表達(dá)水平的顯 著提高。以上結(jié)果表明，生物堿Exfoliazone可有效誘導(dǎo)H印G2細(xì)胞Nur77蛋白的表達(dá)，且 這種誘導(dǎo)作用是時(shí)間和劑量依賴型的，表明其生物學(xué)功能的發(fā)揮有可能與作用時(shí)間和劑量 呈一定的相關(guān)性。4、生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)內(nèi)源Nur77出核選擇肝癌細(xì)胞H印G2，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Hyclone)，在37°C 含5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)于24孔組織培養(yǎng)板中，24h后換液和進(jìn)行加藥(不含血清) 處理。生物堿Exfoliazone溶解于DMSO(DMS0終濃度< 0. )中，以10 μ mol/L處理6h， 對(duì)照組用同樣濃度的DMSO處理6h，具體處理如下(1)對(duì)照組(DMSO)(2)生物堿 Exfoliazone 組(3)用普霉素A(LMB) (10ng/mL)預(yù)處理后，加入生物堿Exfoliazone組。反應(yīng)板中各孔溶液的總體積均為1ml，生物堿Exfoliazone的濃度均為10 μ mol/ L0細(xì)胞經(jīng)處理6h后，0.5%胰酶消化，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，再用Triton穿 膜，最后加入DAPI (0.01mg/mL)染色。甘油封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)，結(jié)果如 圖3所示。根據(jù)圖3的結(jié)果可知，生物堿Exfoliazone作用后的細(xì)胞中，Nur77大多呈胞質(zhì) 分布，而無(wú)生物堿Exfoliazone處理的細(xì)胞，Nur77大多分布在細(xì)胞核中。說(shuō)明生物堿 Exfoliazone能夠有效誘導(dǎo)IfepG2細(xì)胞中內(nèi)源Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。5、生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)外源Nur77出核選擇肝癌細(xì)胞H印G2，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Hyclone)，在 37°C含5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)于24孔組織培養(yǎng)板中，在細(xì)胞密度達(dá)到80%左右，將 GFP-Nur77用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)入H印G2中，24h后換液和進(jìn)行加藥(不含血清)處理。生物 堿Exfoliazone溶解于DMSO (DMS0終濃度< 0. 1 % )中，以10 μ mol/L處理6h，對(duì)照組用同樣濃度的DMSO處理6h，具體處理如下(1)對(duì)照組(DMSO)(2)生物堿 Exfoliazone 組(3)用普霉素A(LMB) (10ng/mL)預(yù)處理后，加入生物堿Exfoliazone組。反應(yīng)板中各孔溶液的總體積均為1ml，生物堿Exfoliazone的濃度均為10 μ mol/ L0細(xì)胞經(jīng)處理6h后，0.5%胰酶消化，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，再用Triton穿 膜，最后加入DAPI (0.01mg/mL)染色。甘油封片，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞根 據(jù)細(xì)胞形態(tài)上典型的細(xì)胞質(zhì)皺縮，膜起泡以及核凝縮、破碎加以識(shí)別。至少300個(gè)細(xì)胞，多 于5個(gè)隨機(jī)視野。結(jié)果如圖4和5所示。根據(jù)圖4的結(jié)果可知，ΙΟμπιοΙ/L生物堿Exfoliazone處理轉(zhuǎn)染后的IfepG2細(xì) 胞6h，發(fā)現(xiàn)GFP-Nur77出核，重新定位于細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)圖5的結(jié)果可知，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入 GFP-Nur77后，用LMB預(yù)先處理!fepG2細(xì)胞，再加入生物堿Exfoliazone共同處理6h，LMB也 可顯著阻斷外源GFP-Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。由此可知，生物堿Exfoliazone通過(guò)CRMl途徑誘 導(dǎo)Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。上述結(jié)果表明生物堿Exfoliazone可以誘導(dǎo)Nur77出核，且是通過(guò)CRMl途徑來(lái) 誘導(dǎo)的。實(shí)施例2生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞IfepG2的凋亡1、生物堿Exfoliazone對(duì)!fepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用H印G2細(xì)胞以5 X IO3/孔接種于96孔板，5% C02、37°C條件下培養(yǎng)24h后，加入濃 度為1、10、20、30和40ymol/L的生物堿Exfoliazone，以等量的DMSO作為對(duì)照組，每組均 設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。藥物分別處理24,48和72h后，加MTT液(5mg/mL，20 μ L/孔)，孵育4h 后加DMS0(150 μ L/孔)，振蕩，顯色。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490nm下讀取吸光度，采用 公式細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值/對(duì)照組吸光度平均值)X 100%，計(jì)算細(xì)胞生 存率。結(jié)果如圖6所示。根據(jù)圖6的結(jié)果可知，生物堿Exfoliazone可顯著抑制!fepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，這種作 用呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性的關(guān)系，在藥物處理24、48和72h后，生物堿Exfoliazone 半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別為35、16和8 μ mol/L。2、生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)!fepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化選擇肝癌細(xì)胞H印G2，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自Hyclone)，在37°C 含5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)于24孔組織培養(yǎng)板中，24h后換液和進(jìn)行加藥(不含血清)處 理。生物堿Exfoliazone溶解于DMSO(DMS0終濃度< 0. 1 % )中，以30 μ mol/L處理24h， 對(duì)照組用同樣濃度的DMSO處理24h。反應(yīng)板中各孔溶液的總體積均為1ml。細(xì)胞經(jīng)處理6h后，0. 5%胰酶消化，PBS洗3 次，4%多聚甲醛固定，再用Triton穿膜，最后加入DAPI (0.01mg/mL)染色。甘油封片， 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)圖7的結(jié)果可知，處理24h，對(duì)照組細(xì)胞界限清晰，胞漿豐富，胞核圓形或橢圓 形，飽滿，染色質(zhì)均勻分布，而30 μ mol -L"1生物堿Exfoliazone處理后，!fepG2細(xì)胞核變圓、 縮小，染色質(zhì)濃縮呈斑塊狀。3、生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)!fepG2細(xì)胞的PARP蛋白降解
選擇肝癌細(xì)胞H印G2，在37°C和5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)于24孔板組織培養(yǎng)板中， 24h后，分別用加有5、10、20 μ M生物堿Exfoliazone的無(wú)血清的DMEM處理24h。細(xì)胞以改 進(jìn)的RIPA裂解緩沖液(50mM Tris_Hcl，pH 7.4 ； 150mM NaCl ；5mM EDTA ；1%ΝΡ-40,0. 5%脫 氧膽酸鈉，0. 1% SDS)于冰上裂解30min。以相同上樣量，8% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以5% 脫脂奶粉的 TBST (50mM Tris-HCl (pH 7. 4)，150mMNaCl and 0. 1 % Tween-20)室溫封閉 lh， 于室溫2h或4°C過(guò)夜孵育一抗anti-PARP(l 1000稀釋)，室溫孵育二抗lh，ECL顯色，曝 光。結(jié)果如圖8所示。如圖8所示，生物堿Exfoliazone可以誘導(dǎo)113kD的PARP蛋白被降解為89kD的 特異性降解產(chǎn)物。隨生物堿Exfoliazone作用濃度的延長(zhǎng)89kD的降解產(chǎn)物量逐漸增多。4、利用Annexin-V/PI雙染檢測(cè)生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)！fepG2的凋亡在無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基(購(gòu)自 Hyclone)中用 1、10、20 μ mol/L 生物堿 Exfoliazone 處理H印G2肝癌細(xì)胞24h，以不加生物堿Exfoliazone的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以紫杉醇 (Taxol) 100nmol/L處理為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞根據(jù)Vybrant Apoptosis Assay Kit#2操作手冊(cè) 染色 PI 和 AnnexinV，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter EPICS ALTRA)分析。用 EXP032ADC 軟件(Beckman Coulter EPICS ALTRA)分析,結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，用lOOnmol/L的紫杉醇處理H印G2細(xì)胞24h，可引起細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞 的早期凋亡率和晚期凋亡率分別為42. 4%和15. 9%。而用生物堿Exfoliazone處理H印G2 細(xì)胞，細(xì)胞主要表現(xiàn)為早期凋亡，并且呈明顯的劑量依賴關(guān)系，1、10和20 μ mol/L分別處理 !fepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞的早期凋亡率分別為1. 1%、10%和44. 2%，而晚期凋亡率分別為 3.4%、4. 9%和9.7%，壞死細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到，這表明生物堿Exfoliazone能夠誘導(dǎo)!fepG2 細(xì)胞凋亡，而不是壞死。上述結(jié)果表明，生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)!fepG2的凋亡。實(shí)施例3生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡依賴于Nur77的表達(dá)水平以 及Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)為了研究Nur77在生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)的凋亡所起的作用，用Nur77的抗體 和DAPI共同染色生物堿Exfoliazone處理后的!fepG2細(xì)胞(細(xì)胞培養(yǎng)同實(shí)施例2. 5)，結(jié)果 如圖10所示。根據(jù)圖10的結(jié)果可以看出，10μmol/L生物堿Exfoliazone處理H印G2細(xì)胞 24h，相對(duì)于對(duì)照組，HepG2細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生顯著的凋亡效應(yīng)；而當(dāng)轉(zhuǎn)入外源GFP_Nur77，再用 10 μ mol/L生物堿Exfoliazone處理!fepG2細(xì)胞24h，細(xì)胞凋亡率提高約60%。說(shuō)明Nur77 介導(dǎo)生物堿Exfoliazone的凋亡效應(yīng)。為了進(jìn)一步證明Nur77的表達(dá)同細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)之間的關(guān)系，將Nur77基因敲除的 MEF細(xì)胞(MEF Nur77+的H印G2細(xì)胞用10、20 μ M的生物堿Exfoliazone處理24h，細(xì)胞根 據(jù) VybrantApoptosis Assay Kit#2 操作手冊(cè)染色 PI 和 AnnexinV，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter EPICSALTRA)分析。用 EXP032ADC 軟件(Beckman Coulter EPICS ALTRA)分析，結(jié) 果如圖11所示。根據(jù)圖11結(jié)果可以看出，10、20 μ mol/L生物堿Exfoliazone處理后，MEF細(xì)胞的 早期凋亡率分別為8%和41. 1%，而同樣濃度生物堿Exfoliazone處理的MEF Nur77+細(xì) 胞，早期凋亡率下降為3. 6%和4. 6%。這一結(jié)果表明生物堿Exfoliazone的凋亡效應(yīng)是由Nur77介導(dǎo)的。如果Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)在生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起作用，抑制 Nur77的出核將可以減少細(xì)胞凋亡。因此，轉(zhuǎn)染GFP-Nur77的H印G2細(xì)胞在LMB存在或是缺 乏的情況下，以生物堿Exfoliazone 10 μ mol/L處理6h。然后AnnexinV/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞 凋亡，結(jié)果見(jiàn)圖12。根據(jù)圖12的結(jié)果表明，10 μ mol/L生物堿Exfoliazone使H印G2細(xì)胞早期凋亡率 為10%，LMB的加入使凋亡率大幅下降為1.8%，細(xì)胞基本不發(fā)生凋亡。以上結(jié)果說(shuō)明，生 物堿Exfoliazone的凋亡效應(yīng)依賴于介導(dǎo)Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。以上的結(jié)果說(shuō)明生物堿Exfoliazone誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡不僅依賴于Nur77的表達(dá)水 平也依賴于其出核轉(zhuǎn)運(yùn)。實(shí)驗(yàn)例4生物堿Exfoliazone對(duì)肺癌細(xì)胞H460的生長(zhǎng)抑制作用及對(duì)Nur77的誘 導(dǎo)作用1、生物堿Exfoliazone對(duì)H460細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用選擇肺癌細(xì)胞株H460(ATCC)，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C含5% C02 的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以5X IO3/孔接種于96孔板，5% C02、37°C條件下培養(yǎng)24h后，加入濃 度為 0,1. 25,2. 5,5,10,20,40,80 μ mol/L 的生物堿 Exfoliazone，以等量的 DMSO 作為對(duì)照 組，每組均設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。藥物處理24h后，加MTT液(5mg/mL，20 μ L/孔)，孵育4h后 加DMSO (150 μ L/孔)，振蕩，顯色。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490nm下讀取吸光度，采用公 式細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度平均值/對(duì)照組吸光度平均值)X 100%，計(jì)算細(xì)胞生存 率。結(jié)果如圖所13示。根據(jù)圖13的結(jié)果可知，生物堿Exfoliazone可顯著抑制H460細(xì)胞的生長(zhǎng)，這種作 用呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，在藥物處理24h后，生物堿Exfoliazone半數(shù)抑制濃度(IC5tl)分別 為 13.6 μ mol/L。2、生物堿Exfoliazone對(duì)Nur77的誘導(dǎo)作用選擇肺癌細(xì)胞株H460，用10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C含5% C02的細(xì)胞 培養(yǎng)箱培養(yǎng)于6孔組織培養(yǎng)板中，24h后換液，饑餓12h后進(jìn)行加藥(不含血清)處理。生 物堿 Exfoliazone 溶解于 DMSO (DMS0 終濃度< 0. 1% )中，分別以 10 μ mol/L、20 μ mol/L 處 理6h，陰性對(duì)照組用同樣濃度的DMSO處理6h，而陽(yáng)性對(duì)照組用佛波酯lOOng/mL (TPA)處理 3h，具體處理如下(5)陰性對(duì)照組(DMSO)(6)陽(yáng)性對(duì)照組(TPA)(7)生物堿 Exfoliazone 組(10 μ mol/L)(8)生物堿 Exfoliazone 組(20 μ mol/L)收集細(xì)胞，以備提取RNA。2. 1轉(zhuǎn)錄水平分析Nur77的表達(dá)細(xì)胞以TRIZOL提取RNA，然后進(jìn)行RT-PCR，最后PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖膠進(jìn)行分 析，結(jié)果如圖14所示。由圖14的結(jié)果可知，在肺癌細(xì)胞H460中，生物堿Exfoliazone可顯 著上調(diào)Nur77mRNA的表達(dá)。2. 2蛋白水平分析Nur77的表達(dá)
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用生物堿Exfoliazone處理H460細(xì)胞，處理濃度為10、20 μ mol/L，處理時(shí)間為 12h，以未以任何處理的H460細(xì)胞作為對(duì)照。細(xì)胞以改進(jìn)的RIPA裂解緩沖液(50mM Tris_Hcl，pH 7. 4 ； 150mM NaCl ；5mM EDTA ； 1% NP-40,0. 5%脫氧膽酸鈉，0. 1% SDS)于冰上裂解30min。以相同上樣量，8% SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，以 5 % 脫脂奶粉的 TBST(50mM Tris-HCl (pH 7. 4), 150mM NaCl and 0. 1 % Tween20)室溫封閉lh，于室溫2h或4°C過(guò)夜孵育一抗，室溫孵育二抗lh，ECL顯色，曝光。 結(jié)果如圖15所示。由圖15的結(jié)果可知，在H460細(xì)胞中，以1、10、20 μ mol/L生物堿Exfoliazone作 用于H460細(xì)胞12h后，均能誘導(dǎo)Nur77的表達(dá)；且這種誘導(dǎo)作用是劑量依賴型的，隨著著處 理濃度的增高，其誘導(dǎo)Nur77的蛋白量也增多。這表明其生物學(xué)功能的發(fā)揮有可能與作用 劑量呈一定的相關(guān)性。綜上所述，本發(fā)明的生物堿Exfoliazone通過(guò)誘導(dǎo)Nur77表達(dá)及其出核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此本發(fā)明的生物堿Exfoliazone可以用于制備治療癌癥的以孤兒 受體Nur77作為作用靶點(diǎn)的藥物。另外，孤兒受體Nur77可以作為作用靶點(diǎn)用于篩選生物 堿Exfoliazone等一系列的海洋生物資源。
權(quán)利要求
一種生物堿Exfoliazone在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述癌癥為肝癌或肺癌。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述治療癌癥藥物以孤兒受體Nur77作為作 用靶點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述以孤兒受體Nur77作為作用靶點(diǎn)在篩選 海洋生物資源中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述篩選是篩選作用于孤兒受體Nur77誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞凋亡的海洋生物資源。
6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述海洋生物資源為生物堿。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過(guò)誘導(dǎo)孤兒受體 Nur77的表達(dá)。
8.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過(guò)誘導(dǎo)孤兒受體 Nur77出核且依賴于Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。
全文摘要
一種生物堿的抗癌應(yīng)用，涉及一種生物堿。提供生物堿Exfoliazone在制備治療癌癥藥物應(yīng)用以及孤兒受體Nur77作為作用靶點(diǎn)在篩選海洋生物資源中的應(yīng)用。所述Exfoliazone可誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的凋亡，Exfoliazone可誘導(dǎo)孤兒受體Nur77的表達(dá)，誘導(dǎo)孤兒受體Nur77出核，并且Exfoliazone是通過(guò)CRM1途徑誘導(dǎo)Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)，最后引起肝癌細(xì)胞的凋亡，Exfoliazone的凋亡效應(yīng)依賴于Nur77的出核轉(zhuǎn)運(yùn)。Exfoliazone作為一種靶向Nur77凋亡途徑的調(diào)節(jié)因子，將成為一種非常有效的癌癥治療藥物。所述治療癌癥藥物以孤兒受體Nur77作為作用靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101947225SQ20101029656
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者張曉坤, 曾錦章, 韋楊燁 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)