專(zhuān)利名稱(chēng)：一種表達(dá)高活性可溶型血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵方法及其相 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法，尤其涉及一種表達(dá) 高活性可溶型血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)方法以及相應(yīng) 三聚體蛋白的分離純化方法。
背景技術(shù)：
Folkman等于1972年首次提出腫瘤的生長(zhǎng)依賴(lài)于血管的生成，雖然小的瘤體可 以通過(guò)滲透作用從周?chē)M織中獲得營(yíng)養(yǎng)，但它的進(jìn)一步生長(zhǎng)則依賴(lài)于形成新的血管以獲得 充分的營(yíng)養(yǎng)。血管生成是腫瘤組織得以快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。利用高效低毒的血管生成 抑制劑抑制新生血管的形成從而切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給以達(dá)到治療腫瘤的目的，是當(dāng)前腫瘤 治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。1994年，O'Reilly等發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性血管生成抑制劑Angiostatin是由纖溶酶原前四 個(gè)餅環(huán)區(qū)組成。1997年，Cao等發(fā)現(xiàn)纖溶酶原N端的第五個(gè)餅環(huán)區(qū)(plasminogenkringle 5)同樣具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的能力，而且抑制能力比Angiostatin更 強(qiáng)。Kringle5被認(rèn)為是迄今為止動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中抗腫瘤血管生成最有效的藥物之一，而我們?cè)O(shè) 計(jì)和表達(dá)的血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白具有比血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5更高 的抑制血管生成活性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外先后報(bào)道了有關(guān)腫瘤血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5基因的克隆和表 達(dá)，以及Kringlel-4、Kringlel-3和Kringle5基因大腸桿菌的發(fā)酵工藝研究。血管生長(zhǎng)抑 制劑Kringle 5被認(rèn)為是目前抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移活性最強(qiáng)的纖溶酶原片段。目 前用于培養(yǎng)抑制劑Kringle 5工程菌的培養(yǎng)基很多，但所用培養(yǎng)基均不能有效培養(yǎng)可表達(dá) 高活性可溶型血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種適宜于重組工程菌 生長(zhǎng)以及血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白高效表達(dá)的高密度發(fā)酵培養(yǎng)方法及其相 應(yīng)三聚體蛋白的分離純化方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明提供了一種表達(dá)高活性可溶型血管生長(zhǎng)抑制劑 Kringle 5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特殊之處在于所述表達(dá)高活性血管生長(zhǎng) 抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵方法包括以下步驟1)對(duì)重組菌的種子進(jìn)行活化得到重組菌種子液；2)將重組菌種子液接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基進(jìn)行三角搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)；3)將步驟2)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后的重組菌接種于半合成培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；所述 半合成培養(yǎng)基中的碳氮比約為4. 2。上述半合成培養(yǎng)基成分包括酵母提取物、NH4Cl、NaH2PO4, Na2HPO4、MgSO4 · 7H20以及葡萄糖。上述半合成培養(yǎng)基成分還包括KH2PO4或K2HPO4。上述半合成培養(yǎng)基的組成為酵母提取物IOg · L—1、NH4Cl 0. 30g · L—1、 NaH2P042. Og · Γ1、Na2HP045. Og · MgSO4 · 7H20 1. Og · Γ1 以及葡萄糖 6. Og · Γ1。上述步驟1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取_70°C 20%甘油保藏的工程重組菌菌種，以 8%的接種量接種于含LB培養(yǎng)基的試管中，30°C 260r/min培養(yǎng)過(guò)夜，作為重組菌種子液。上述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取重組菌種子液按8%接種量接種于裝有50. OmL 二級(jí)種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C 260r/min培養(yǎng)6h，得到20. OL發(fā)酵罐的菌種。上步驟3)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取20. OL發(fā)酵罐的菌種按8%接種量接種于裝有 半合成培養(yǎng)基的20. OL自控罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，所述20. OL自控罐自動(dòng)流加30%的氨水和 13%的鹽酸控制溶液的pH，通過(guò)攪拌轉(zhuǎn)速的自動(dòng)調(diào)節(jié)和空氣流量的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)節(jié)溶氧量。上述20. OL自控罐中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)溶氧是40%。上述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成是胰蛋白胨16g/L、酵母提取物10g/L以及氯化鈉 5g/L。上述LB培養(yǎng)基的組成是胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L以及氯化鈉10g/L。一種表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的分離純化方法，其特 殊之處在于所述方法包括以下步驟1)將發(fā)酵好的Kringle 5三聚體工程菌進(jìn)行離心收集菌體；2)將步驟1)所得到的菌體破碎并離心，收集上清液，丟棄沉淀；3)將步驟2)所得到的上清液進(jìn)行等度+梯度方式進(jìn)行洗脫，收集梯度開(kāi)始后的紫 外吸收峰，所述梯度開(kāi)始后的紫外吸收峰為Kringle 5三聚體組分。上述步驟1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是將發(fā)酵好的Kringle 5三聚體工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵培 養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，用0. IM Tris-HCl重懸菌體并洗滌，于5000rpm離心5分鐘，棄去上清液， 所述 0. IM Tris-HCl 的 pH 為 8. 0。上述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是將菌體加入到0. IM Tris-HCl破碎緩沖液中，進(jìn)行超聲波破碎，破碎后于 12000rpm離心10分鐘，收集上清，丟棄沉淀，所述0. IM Tris-HCl的pH為8. 0。上述步驟3)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取破碎后的上清液用5% B液充分平衡過(guò)的SP Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交 換柱上，采用等度+梯度方式進(jìn)行洗脫，所述洗脫程序?yàn)橄扔?% B液沖洗至電導(dǎo)平衡， 等紫外線平穩(wěn)后進(jìn)行梯度洗脫，洗脫方式為5% B液線性變化到100% B液；緩沖液A為 0. 05mol/L HAc-NaAc，緩沖液 B 為 0. 05mol/L HAc-NaAc+1. Omol/L NaCl。所述 HAc-NaAc 的 pH 是 5. 0 ；所述 1. 0mol/L NaCl 的 pH 是 5. 0。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明提供了一種表達(dá)非融合可溶型高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體 工程菌的高密度發(fā)酵方法，該方法通過(guò)改變培養(yǎng)基成分，確定了適宜于重組工程菌生長(zhǎng)和 血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白高效表達(dá)的最佳培養(yǎng)基；采用正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)重組工 程菌生長(zhǎng)和血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體的發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化；通過(guò) 發(fā)酵罐中重組工程菌的分批培養(yǎng)，確定了培養(yǎng)液中的最佳溶氧量；并對(duì)可溶性表達(dá)的血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體采用一步SPS印harose Fast Flow介質(zhì)在梯度洗脫方式下 進(jìn)行了純化。結(jié)果表明經(jīng)高效凝膠排阻色譜和反相色譜分析檢測(cè)其純度在96%以上；經(jīng) 雞胚尿囊膜刺激實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)的血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白具有抑制血管生 成作用，且比血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5具有更高的抑制血管生成活性；采用優(yōu)化后的 發(fā)酵和分離純化工藝，在20L發(fā)酵罐中血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體的表達(dá)量可達(dá) 0. Seg-T10本發(fā)明明顯提高了血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白的表達(dá)量，可以方 便、快速地純化血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白，其純度和生物活性均可達(dá)到藥用 標(biāo)準(zhǔn)?；诒景l(fā)明所提供的培養(yǎng)基能夠表達(dá)的血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白比血 管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5蛋白具有更高的抑制血管生成活性，在腫瘤治療方面具有巨大的 潛在價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是重組工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5的生長(zhǎng)曲線圖；圖2是重組工程菌BL21(DE3)plys/pET15b-K5在發(fā)酵罐中分批發(fā)酵時(shí)各參數(shù)的變 化示意圖；圖3是經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體蛋白電泳圖；圖4是重組Kringle 5三聚體蛋白表達(dá)的電泳圖；圖5是重組Kringle 5三聚體蛋白分離純化的離子交換層析圖；圖6是離子交換層析分離后各餾分的電泳圖；圖7是純化后重組Kringle 5三聚體在凝膠排阻色譜上的分析檢測(cè)圖；圖8是純化后的重組Kringle 5三聚體在反相色譜上的分析檢測(cè)圖；圖9是重組Kringle 5三聚體在質(zhì)譜上的分子量；圖10是雞胚尿囊膜法檢測(cè)純化后重組Kringle 5三聚體的生物活性圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所選擇的實(shí)驗(yàn)材料是1、主要試劑限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I、T4DNA連接酶、高保真Taq酶均購(gòu)自 Promega公司，Taq酶購(gòu)自MBI ；質(zhì)粒小量提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA ；引 物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。2、菌株和質(zhì)粒大腸桿菌BL21(DE3)plys、質(zhì)粒pET15b以及帶有Kringle 5基因 的 BL21 (DE3)plys/pET 15b_K5 工程菌。3、培養(yǎng)基3. 1試管種子培養(yǎng)基(LB，g/L)胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉IOg/ L03. 2 二級(jí)種子培養(yǎng)基(2YT，g/L)胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，氯化鈉5g/ L03. 3半合成培養(yǎng)基含有酵母提取物、氯化銨、NaH2P04、Na2HPO4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 · 7H20和葡萄糖。以上各培養(yǎng)基中都加入氨芐青霉素100 μ g/mL, 121°C滅菌20分鐘。
4、實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)試劑以及菌株和質(zhì)粒，本發(fā)明提供了一種表達(dá)高活 性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵方法，該方法包括以下步驟4. 1種子的活化取-70°C 20%甘油保藏的工程菌種，以8%的接種量接種于含LB培養(yǎng)基的試管中， 300C 260r/min培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液。4. 2重組菌發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化4. 2. 1培養(yǎng)方法培養(yǎng)基的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化在搖瓶中進(jìn)行，重組菌的分批 培養(yǎng)在德國(guó)B. Braun公司的micro D⑶-400型20. OL自控罐中進(jìn)行。三角搖瓶培養(yǎng)按8% 接種量將種子液接種于裝有50. OmL 2YT培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C 260r/min培養(yǎng)6h， 作為20. OL發(fā)酵罐的菌種；工程菌的分批發(fā)酵在德國(guó)B. Braun公司micro D⑶-400型20. OL 自控罐中進(jìn)行，自動(dòng)流加30%的氨水和13%的鹽酸控制溶液的pH，通過(guò)攪拌轉(zhuǎn)速的自動(dòng)調(diào) 節(jié)和空氣流量的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)節(jié)溶氧量。4. 2. 2培養(yǎng)基成分的選擇根據(jù)培養(yǎng)基中氮源和無(wú)機(jī)鹽的種類(lèi)和含量以及碳氮 比，設(shè)計(jì)了五種發(fā)酵培養(yǎng)基，它們的成份和含量見(jiàn)表1。表1幾種發(fā)酵培養(yǎng)基的成份和含量
權(quán)利要求
一種表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵方法包括以下步驟1)對(duì)重組菌的種子進(jìn)行活化得到重組菌種子液；2)將重組菌種子液接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基進(jìn)行三角搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)；3)將步驟2)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后的重組菌接種于半合成培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；所述半合成培養(yǎng)基中的碳氮比約為4.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高密 度發(fā)酵方法，其特征在于所述半合成培養(yǎng)基成分包括酵母提取物、NH4Cl、NaH2P04、Na2HP04、 MgSO4 · 7H20以及葡萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高密 度發(fā)酵方法，其特征在于所述半合成培養(yǎng)基成分還包括KH2PO4或Κ2ΗΡ04。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的 高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述半合成培養(yǎng)基的組成為酵母提取物IOg · L-U NH4Cl 0. 30g · L-I、NaH2P042. Og · L_l、Na2HP045. Og · L_l、MgSO4 · 7H201. Og · L_1 以及葡萄糖 6.Og · L-I0
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體 工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取-70°C 20%甘 油保藏的工程重組菌菌種，以8%的接種量接種于含LB培養(yǎng)基的試管中，30°C 260r/min培 養(yǎng)過(guò)夜，作為重組菌種子液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高 密度發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取重組菌種子液按8%接種量 接種于裝有50. OmL 二級(jí)種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30°C 260r/min培養(yǎng)6h，得到20. OL 發(fā)酵罐的菌種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高密 度發(fā)酵方法，其特征在于所述步驟3)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取20. OL發(fā)酵罐的菌種按8%接 種量接種于裝有半合成培養(yǎng)基的20. OL白控罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，所述20. OL自控罐自動(dòng)流 加30%的氨水和13%的鹽酸控制溶液的pH，通過(guò)攪拌轉(zhuǎn)速的自動(dòng)調(diào)節(jié)和空氣流量的調(diào)節(jié) 來(lái)調(diào)節(jié)溶氧量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高密 度發(fā)酵方法，其特征在于所述20. OL自控罐中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)溶氧是40%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高 密度發(fā)酵方法，其特征在于所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成是胰蛋白胨16g/L、酵母提取物 10g/L以及氯化鈉5g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的高 密度發(fā)酵方法，其特征在于所述LB培養(yǎng)基的組成是胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L以 及氯化鈉10g/L。
11.一種表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的分離純化方法，其特 征在于所述方法包括以下步驟21)將發(fā)酵好的Kringle5三聚體工程菌進(jìn)行離心收集菌體；2)將步驟1)所得到的菌體破碎并離心，收集上清液，丟棄沉淀；3)將步驟2)所得到的上清液進(jìn)行等度+梯度方式進(jìn)行洗脫，收集梯度開(kāi)始后的紫外吸 收峰，所述梯度開(kāi)始后的紫外吸收峰為Kringle 5三聚體組分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的分 離純化方法，其特征在于所述步驟1)的具體實(shí)現(xiàn)方式是將發(fā)酵好的Kringle 5三聚體 工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)后，用0. IM Tris-HCl重懸菌體并洗滌，于5000rpm離心5 分鐘，棄去上清液，所述0. IM Tris-HCl的pH為8. 0。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的分 離純化方法，其特征在于所述步驟2)的具體實(shí)現(xiàn)方式是將菌體加入到0. IM Tris-HCl破碎緩沖液中，進(jìn)行超聲波破碎，破碎后于12000rpm離 心10分鐘，收集上清，丟棄沉淀，所述0. IM Tris-HCl的pH為8. 0。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的表達(dá)高活性血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle5三聚體工程菌的分 離純化方法，其特征在于所述步驟3)的具體實(shí)現(xiàn)方式是取破碎后的上清液用5% B液充分平衡過(guò)的SP Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換柱 上，采用等度+梯度方式進(jìn)行洗脫，所述洗脫程序?yàn)橄扔?% B液沖洗至電導(dǎo)平衡，等紫外 線平穩(wěn)后進(jìn)行梯度洗脫，洗脫方式為5% B液線性變化到100% B液；緩沖液A為0. 05mol/ L HAc-NaAc,緩沖液 B 為 0. 05mol/L HAc-NaAc+1. Omol/L NaCl 所述 HAc-NaAc 的 pH 是 5. 0 ； 所述 1. Omol/L NaCl 的 pH 是 5. 0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)高活性可溶型血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體工程菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)方法以及相應(yīng)三聚體蛋白的分離純化方法，該方法包括以下步驟1)對(duì)重組菌的種子進(jìn)行活化得到重組菌種子液；2)將重組菌種子液接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基進(jìn)行三角搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)；3)將步驟2)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后的重組菌接種于半合成培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；半合成培養(yǎng)基中的碳氮比約為4.2。本發(fā)明提供了一種適宜于重組工程菌生長(zhǎng)以及血管生長(zhǎng)抑制劑Kringle 5三聚體蛋白高效表達(dá)的高密度發(fā)酵培養(yǎng)方法及其相應(yīng)三聚體蛋白的分離純化方法。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101974505SQ20101029851
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者冀旭, 邊六交, 馬麗娜 申請(qǐng)人:西北大學(xué)