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      一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達(dá)方法

      文檔序號:586206閱讀:287來源:國知局
      專利名稱:一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法
      一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域,涉及一種血管生長抑制劑的制備方法,尤其涉及一 種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法。
      背景技術(shù)
      全世界每年約有500萬人死于腫瘤。早在20世紀(jì)70年代,F(xiàn)olkman就提出, 腫瘤生長是血管依賴性的。血管的生長有兩個明顯不同的階段,即從無血管的緩慢生長 階段到有血管的快速生長階段。血管的生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì),是促成上 述轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血管的生成主要依賴于血管生成刺激劑和抑制劑的調(diào)節(jié),內(nèi)源性的 血管生成刺激劑的下調(diào)和血管生成抑制劑的上調(diào),引起血管生成平衡失調(diào),可能是血管 生長抑制劑抑制血管活性的機(jī)制。
      在此之前,在腫瘤治療領(lǐng)域一直占主導(dǎo)地位的策略是直接殺傷腫瘤細(xì)胞,即先 進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)或通過放療使原發(fā)瘤消退,然后再進(jìn)行放化療,以消除體內(nèi)殘留的癌 細(xì)胞。這種策略的缺點(diǎn)是特異性不高,對病人的副作用太大,甚至有時(shí)會加速病人的死 亡。而且癌細(xì)胞反復(fù)暴露于化療下會產(chǎn)生抗藥性,嚴(yán)重影響治療的效果。因此,很多腫 瘤專家的注意力就從腫瘤細(xì)胞本身轉(zhuǎn)移到總體腫瘤組織,尤其是血管的生成過程。
      以腫瘤組織血管為靶標(biāo)與直接針對腫瘤細(xì)胞本身相比有兩個顯著的優(yōu)點(diǎn)首 先,由于許多固體瘤(或許還有某些白血病)是血管生成依賴的,因而這種方法不必為 某種特定的腫瘤而制定特定的治療方案;其次,抗血管生成藥物只是阻止新生血管的生 長,不攻擊健康血管,理論上對正常血管無害并且不產(chǎn)生抗藥性。正常成年人體內(nèi)新生 血管的生成處于相對靜息的狀態(tài),只有0.01%左右的內(nèi)皮細(xì)胞處于分裂期,而腫瘤血管 處于分裂周期的內(nèi)皮細(xì)胞比例要高出2-3個數(shù)量級。因此,抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖對正常組 織影響非常小。
      有人從荷瘤的小鼠尿液和血清中分離到血管抑素,它與人纖維蛋白溶酶原 Kringle 1-4區(qū)有高度的同源性。隨后有實(shí)驗(yàn)證明血管抑素能特異性的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞 的增殖,也可以抑制原發(fā)瘤以及轉(zhuǎn)移瘤組織中的血管生成。
      人纖維蛋白溶酶原是一種含有5個Kringle結(jié)構(gòu)域和一個絲氨酸蛋白酶的分泌性 糖蛋白,每個Kringle環(huán)由76-80個氨基酸組成。1996年Cao等人比較了血管抑素中各個 Kringle區(qū)的抗血管增生活性后發(fā)現(xiàn),每個獨(dú)立的Kringle片段都能不同程度地抑制內(nèi)皮細(xì) 胞增殖。Kringle 1、Kringle 2和Kringle 3具有較強(qiáng)的抑制活性而Kringle 4僅僅具有很低 的抑制活性,Kringle 1和Kringle 3的抑制活性要強(qiáng)于Kringle 2,而單獨(dú)的Kringle 5片段 抗血管增殖活性最強(qiáng),它是目前所知道的抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移最有效的纖維蛋白溶 酶原片段,也是目前國際上研究和開發(fā)的最具前途的腫瘤血管生長抑制劑。血管生長抑 制劑Kringle 5被認(rèn)為是目前抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移活性最強(qiáng)的纖溶酶原片段。但 目前血管生長抑制劑Kringle 5制備工藝復(fù)雜,表達(dá)效率低下。

      發(fā)明內(nèi)容
      為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種高活性可溶型血 管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑 Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法,其特殊之處在于所述高活性可溶型血管生長抑制劑 Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法包括以下步驟1)制備Kringle 5基因的上游引物、Kringle 5基因的下游引物、pET15b質(zhì)粒 DNA以及感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)plys ;所述Kringle 5基因的上游引物含有Nco I酶切位 點(diǎn);所述Kringle 5基因的下游引物含有Xho I酶切位點(diǎn);2)根據(jù)步驟1)所得到的Kringle 5基因的上游引物以及Kringle 5基因的下游引 物對Kringle 5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3)利用限制性內(nèi)切酶分別對步驟2)所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及pET15b質(zhì)粒進(jìn) 行雙酶切,分別得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的產(chǎn)物以及pET15b質(zhì)粒經(jīng)酶切后的產(chǎn)物;所 述限制性內(nèi)切酶是Nco I酶以及Xho I酶;4)利用T4 DNA連接酶對步驟3)中所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的產(chǎn)物以及 pET15b質(zhì)粒經(jīng)酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行酶連接,得到重組質(zhì)粒pET15b/K5 ;5)將步驟4)獲取得到的重組質(zhì)粒pET15b/K5轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)plys 中培養(yǎng)并進(jìn)行保存;6)對步驟5)中已經(jīng)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3) plys中的重組質(zhì)粒進(jìn)行低溫誘
      導(dǎo)表達(dá)。上述步驟1)中,所述Kringle 5基因的上游弓丨物是 ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG,其中,CCATGG是Nco I酶切位點(diǎn)所述 Kringle 5 基因的下游引物是 ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG,其中, CTCGAG是Xho I酶切位點(diǎn)。上述步驟2)中對Kringle 5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系是Kringle 5基因的上 游引物和Kringle 5基因的下游引物各1 μ 1,模板1 μ 1,Taq酶25 μ 1,加無菌水至50 μ 1 ; PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是95°C5min預(yù)變性;95°C30s變性,55°C30s退火,72°C 30s延 伸,30個循環(huán);72°C7min延伸。上述步驟3)中利用限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切的反應(yīng)體系是 Nocllyl,Xho I 1 μ 1, IOXM Buffer 4 μ 1,PCR 產(chǎn)物 10 μ 1,BSA 0.4 μ 1,加無菌水至 40μ1 ;酶切溫度37°C,時(shí)間2h;利用限制性內(nèi)切酶對pET15b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切的反應(yīng)體系是Noc I 1 μ 1,Xho I Ιμ , IOXMBuffer 4 μ 1,pET15b 20 μ 1, BSA 0.4 μ 1,加無菌水至 40μ1;酶切溫度
      37°C,時(shí)間 2h。上述步驟4)中對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的產(chǎn)物以及pET15b質(zhì)粒經(jīng)酶切后的 產(chǎn)物進(jìn)行酶連接的反應(yīng)體系是pET15b質(zhì)粒ΙΟμΙ,Kringle 5片段2 μ 1,10XT4DNA Ligase Buffer 2 μ 1,T4DNALigase 1 μ 1,加無菌水到 20 μ 1 ;反應(yīng)條件是16°C保溫過夜,-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 上述步驟幻中的具體實(shí)現(xiàn)方式是將IOyL連接產(chǎn)物加到200yL感受態(tài)細(xì) 胞BL21(DE3)plys的懸液中,混勻,冰浴30_40min,42°C水浴保溫90s,立即置冰上 3min,加入790 μ ILB培養(yǎng)基,180rpm,37°C震蕩培養(yǎng)60min,然后吸取200 μ 1培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
      上述步驟6)的具體實(shí)現(xiàn)方式是選取轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)出的單菌落至含有5ml培養(yǎng)液 的試管中,30°C 220rpm振蕩過夜;吸取50 μ 1培養(yǎng)物以1 100接種于含100 μ g/ml氨卞 的5ml LB培養(yǎng)基中,30°C 220rpm振蕩3小時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG,使其終濃度為ImM, 再于30°C 220rpm振蕩4小時(shí);離心收集菌體,用200 μ 1 O.lMTris-HCl重懸菌體并洗滌, 于5000rpm離心5分鐘,棄去上清液,所述200 μ 1 0.IMTris-HCl的ρΗ是8.0。
      上述步驟5)中感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)plys的制備方法是
      冰冷的CaCl2溶液的制備O.lmol/L CaCl2溶液,使用一次性濾器過濾除菌 后,-4°C冰箱存儲備用;0.05mol/L CaCl2甘油溶液30%的甘油+0.1M CaCl2 ;使用一 次性濾器過濾除菌后,_4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> 無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5ml LB液體培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng) 過夜;第二天,倒入250ml的LB液體培養(yǎng)基中,37°C振蕩3.5_4.0h,當(dāng)LB液體培養(yǎng)基的 OD600值介于0.4-0.6時(shí)停止培養(yǎng);將培養(yǎng)液分裝到8個25ml預(yù)冷無菌的聚丙烯管中,于 冰上置5-10分鐘,然后4°C,8000rmp離心8min ;細(xì)胞沉淀用IOml冰冷的CaCl2溶液重 懸,4°C 6000rmp離心5分鐘;棄上清后,加入IOml冰冷的CaCl2溶液重懸細(xì)胞,冰浴半 小時(shí)后,4°C,6000rmp離心5分鐘;棄上清后,加入2ml冰冷的CaCl2溶液重懸細(xì)胞, 按每管200 μ 1量分裝于預(yù)冷的0.5ml離心管中,立即凍存于_75°C冰柜中備用。
      上述步驟1)中pETKb質(zhì)粒DNA的制備方法是
      質(zhì)粒的放大培養(yǎng)在2ml含有l(wèi)OOyg/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基中,接入含有 pET15b質(zhì)粒的ToplO單菌落,于37°C,220rpm振搖下培養(yǎng)過夜;吸取1.5ml培養(yǎng)物于離 心管中,IOOOOg離心30秒,吸去培養(yǎng)液;
      離心柱的活化取750 μ 1 GPS緩沖液加入分離柱中,靜置4min,12000g離心 2min ;
      質(zhì)粒的提取在上述沉淀中加入250 μ 1溶液I,吹吸使沉淀完全分散;加入 250 μ 1溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管5次,以混勻溶液,靜置2min;加入350 μ 1 溶液III,蓋緊管口,溫和振蕩10秒,使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻,靜 置4min; 12000g離心lOmin,吸取上清至分離柱中IOOOOg離心lmin,棄去液體,加 入 500 μ 1 Buffer HB IOOOOg 離心 lmin,棄去液體,加入 500 μ 1 DNA Wash, IOOOOg 離心 lmin,重復(fù)此步驟;換離心管,加入40 μ 1 Elution Buffer放置2min,13600g離心2min, 紫外分光光度計(jì)測含量,27.5ng/ μ 1,Α260/Α280在1.80以上;取5 μ 1做1 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測,剩余儲存于-20°C;所述溶液I和溶液II是指質(zhì)粒小量提取試劑盒中標(biāo)注的溶 液。
      本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
      本發(fā)明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方 法,該方法根據(jù)&"ingle 5基因序列設(shè)計(jì)PCR引物,通過PCR從模板擴(kuò)增出人纖維蛋白溶 酶原Kringle 5非融合單基因,在Nco I和Xho I兩酶切位點(diǎn)分別對Kringle 5和pET15b基因雙酶切后再將二者相連,成功構(gòu)建了 pET15b_K5基因非融合表達(dá)載體;將重組載體導(dǎo) 入BL21 (DE3)plys大腸桿菌細(xì)胞中低溫誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果表明Kringle 5蛋白以可溶型三聚 體形式獲得了高效表達(dá),目標(biāo)蛋白表達(dá)占菌體總蛋白的25%左右;將上清液經(jīng)過一步SP Sepharose Fast Flow介質(zhì)分離純化后可獲得高純度和活性的非融合Kringle 5三聚體蛋白, 經(jīng)高效凝膠排阻色譜和反相色譜分析檢測其純度在96%以上;雞胚尿囊膜刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明,表達(dá)的Kringle5三聚體蛋白的抑制血管生成活性約是Kringle5蛋白的三倍。本發(fā) 明所提供的非融合可溶型高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法,所表 達(dá)的血管生長抑制劑Kringle 5三聚體蛋白比血管生長抑制劑Kringle 5蛋白具有更高的抑 制血管生成活性,在腫瘤治療方面具有巨大的潛在價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。非融合可溶 型高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的設(shè)計(jì)和高效表達(dá)方法為將其開發(fā)成一種新型 抗血管生成藥物奠定了基礎(chǔ)。


      圖1是本發(fā)明所提供的模板PCR電泳圖;圖2是本發(fā)明所提供的Kringle 5和pET15bk5雙酶切電泳圖;圖3是本發(fā)明所提供的重組質(zhì)粒PCR電泳圖;圖4是本發(fā)明所提供的IPTG誘導(dǎo)的菌體蛋白電泳圖;圖5是本發(fā)明所提供的重組蛋白質(zhì)表達(dá)上清和沉淀的電泳圖;圖6是本發(fā)明所提供的重組蛋白的活性檢測示意圖。
      具體實(shí)施例方式本發(fā)明所選擇的試驗(yàn)材料是1、主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、高保真Taq酶均購自Promega公 司,Taq酶購自MBI;質(zhì)粒小量提取試劑盒,DNA凝膠回收試劑盒均購自O(shè)MEGA ;引 物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。2、菌株和質(zhì)粒大腸桿菌BL21(DE3)plys和質(zhì)粒pET15b。3、培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基胰蛋白凍10g,酵母提取物5g,氯化鈉10g,加水至 1000ml, 121°C滅菌20分鐘;瓊脂培養(yǎng)基胰蛋白凍10g,酵母提取物5g,氯化鈉10g, 瓊脂粉15g,加水至1000ml,121°C滅菌20分鐘。本發(fā)明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方 法,該方法包括Kringle 5基因上下游引物的設(shè)計(jì)與合成上游引物ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG,其中CCATGG 是
      Nco I酶切位點(diǎn);下游弓丨物ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG,其中 CTCGAG是Xho I酶切位點(diǎn)。Kringle 5基因的PCR擴(kuò)增,其具體實(shí)現(xiàn)方式是DPCR擴(kuò)增體系是上游引物和下游引物各1 μ 1,模板1 μ 1,Taq酶25 μ 1,加 無菌水至50 μ 1 ; PCR反應(yīng)條件是95°C 5min預(yù)變性;95°C 30s變性,55°C 30s退火,
      872 0C 30s延伸,30個循環(huán);72 0C 7min延伸。
      PCR后,取5ul PCR反應(yīng)產(chǎn)物和5ul marker進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,鑒定產(chǎn)物大小。
      2)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳稱取0.20g瓊脂糖置專用三角瓶,加入20ml蒸 餾水,加熱至沸騰。待冷卻后加入少許Goldview貯存液,混勻后倒入事先插好梳子的 電泳槽中,待其冷卻凝固后加入適量的電泳緩沖液,小心取出梳子;用微量移液槍吸取 PCR產(chǎn)物5 μ 1加入加樣孔中,在旁邊加樣孔中加入DNA Marker做對照;接通電泳池的 電源調(diào)節(jié)電壓至80v,進(jìn)行電泳。之后在凝膠成像儀下觀察。
      參考圖1,該圖是模板PCR電泳結(jié)果,泳道1代表DL2000分子量marker ;泳道2-7是六個平行樣品的模板PCR電泳結(jié)果;泳道8代表陰性對照,其結(jié)果表明,在300bp 處顯示出條帶,與目的基因大小一致,從模板質(zhì)粒中能夠擴(kuò)增出大量的模板DNA分子。
      3)pET15b質(zhì)粒DNA的小量制備,其具體實(shí)現(xiàn)方式是
      (1)質(zhì)粒的放大培養(yǎng)在2ml含有100 μ g/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基中,接入 含有pET15b質(zhì)粒的ToplO單菌落,于37°C,220rpm振搖下培養(yǎng)過夜。吸取1.5ml培養(yǎng) 物于離心管中,IOOOOg離心30秒,盡量吸去培養(yǎng)液。
      (2)離心柱的活化取750 μ IGPS緩沖液加入分離柱中,靜置4min,12000g離 心 2min。
      (3)質(zhì)粒的提取在上述沉淀中加入250 μ 1溶液I,吹吸使沉淀完全分散;加入 250 μ 1溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管5次,以混勻溶液,靜置2min;加入350 μ 1 溶液III,蓋緊管口,溫和振蕩10秒,使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻,靜 置4min。12000g離心lOmin,吸取上清至分離柱中IOOOOg離心lmin,棄去液體,加 入 500 μ 1 Buffer HB IOOOOg 離心 lmin,棄去液體,加入 500 μ 1 DNAWash, IOOOOg 離心 lmin,重復(fù)此步驟。換離心管,加入40 μ IElution Buffer放置2min,13600g離心2min, 紫外分光光度計(jì)測含量,27.5ng/ μ 1,Α260/Α280在1.80以上。取5 μ 1做1 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測,剩余儲存于-20 V。
      4)PCR產(chǎn)物的凝膠回收,其具體實(shí)現(xiàn)方式是
      采用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將Kringle 5基因的PCR產(chǎn)物按步 驟2)所述方法進(jìn)行凝膠電泳,在紫外燈下切下含有目的DNA的凝膠,凝膠重0.144g,假 設(shè)膠密度為lg/ml,按一個凝膠體積加入等體積Binding Buffer計(jì)算,向其中加入150 μ 1 Binding Buffer,混和均勻后于60°C加熱,間斷混合直至凝膠完全融化。將混合溶液加入 分離柱中,IOOOOg離心lmin,棄去下液,加入300 μ 1 Binding Buffer至分離柱中,IOOOOg 離心lmin。加入700 μ 1 SPW (已經(jīng)用乙醇處理),IOOOOg離心lmin,重復(fù)一遍,棄去 下液,13000g離心2min。將分離柱放入1.5ml離心管中,加入40 μ 1 Elution Buffer,靜 置lmin,13000g離心lmin。紫外分光光度計(jì)測含量為60ng/ μ 1,Α260/Α280為1.80。取 5 μ 1膠回收產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。
      5)雙酶切PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒DNA,其具體實(shí)現(xiàn)方式是
      反應(yīng)體系NocI1 μ 1,Xho I 1 μ 1, 10 XM Buffer 4 μ 1,pET15b 20 μ 1, PCR 產(chǎn) 物ΙΟμΙ,BSA 0.4 μ 1,加無菌水至40μ1;酶切溫度37°C,時(shí)間濁。
      6)pET15b和Kringle 5基因雙酶切產(chǎn)物膠回收,其具體實(shí)現(xiàn)方式是
      具體步驟同4)所述。紫外分光光度計(jì)測含量Kringle 5基因濃度為12.0ng/yl, pET15b濃度為4.5ng/ μ 1。取10 μ 1電泳檢測。參見圖2,該圖表示了尺!^§^5和9£1!551^雙酶切電泳圖,其中,泳道1代表 DNA分子量marker ;泳道2是Kringle 5雙酶切結(jié)果;泳道3_4是pET15b雙酶切結(jié)果; 泳道5是pET15b未酶切。結(jié)果表明,模板質(zhì)粒和pET15b質(zhì)粒均能有效進(jìn)行雙酶切,模 板酶切位點(diǎn)設(shè)置正確。7)重組載體pET15b/K5的制備,其具體實(shí)現(xiàn)方式是反應(yīng)體系組成為回收的pET15b質(zhì)粒10μ1,回收Κ5片段2μ1,10XT4DNA Ligase Buffer 2 μ 1,T4DNALigase 1 μ 1,加無菌水到 20 μ 1。反應(yīng)條件16°C保溫過夜,_20°C保存?zhèn)溆谩?)感受態(tài)細(xì)胞的制備,其具體實(shí)現(xiàn)方式是CaCl2溶液(冰冷)0.1mol/L CaCl2溶液,使用一次性濾器過濾除菌后,_4°C 冰箱存儲備用;0.05mol/L CaCl2甘油溶液30%的甘油+0.1M CaCL2。使用一次性濾器 過濾除菌后,_4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?1)無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5ml LB液體培養(yǎng)基中,37°C培 養(yǎng)過夜。第二天,倒入250ml的LB液體培養(yǎng)基中,37°C振蕩3.5_4.0h (OD6000.4-0.6),
      停止培養(yǎng)。(2)將培養(yǎng)液分裝到8個25ml預(yù)冷無菌的聚丙烯管中,于冰上置5_10分鐘,然 后 4°C,8000rmp 離心 8min。(3)細(xì)胞沉淀用IOml冰冷的CaCl2溶液重懸,4°C 6000rmp離心5分鐘。(4)棄上清后,加入IOml冰冷的CaCl2溶液重懸細(xì)胞,冰浴半小時(shí)后,4°C, 6000rmp離心5分鐘。(5)棄上清后,加入2ml冰冷的CaCl2溶液重懸細(xì)胞,按每管200 μ 1量分裝于預(yù) 冷的0.5ml離心管中,立即凍存于_75°C冰柜中備用。9)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及保存,其具體實(shí)現(xiàn)方式是(1)將10 μ L連接產(chǎn)物加到200 μ L感受態(tài)細(xì)胞懸液中,混勻,冰浴30_40min, 42°C水浴保溫90s,立即置冰上3min,加入790 μ 1 LB培養(yǎng)基,180rpm,37°C震蕩培養(yǎng) 60min,然后吸取200 μ 1培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。(2)將轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌,挑取單菌落于液體培養(yǎng)基,進(jìn)行純化擴(kuò)增培養(yǎng), 37°C劇烈振搖過夜。吸取過夜搖床培養(yǎng)的培養(yǎng)物500 μ 1加入1.5ml的離心管中,再加30% 的甘油500 μ 1混合均勻后于-20或-70°C保藏,定期進(jìn)行活化重保藏,以防菌種退化或質(zhì) 粒丟失。10)重組質(zhì)粒的提取、PCR檢測和序列測定,其具體實(shí)現(xiàn)方式是質(zhì)粒提取方法同步驟3),質(zhì)粒PCR檢測所用程序和反應(yīng)體系同步驟1),然后進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳檢測;序列測定采用T7 Promoter作為起始引物,結(jié)果顯示序列正確。序列測定采用T7 promoter作為起始引物,結(jié)果如下結(jié)果顯示序列正確。ATGGTGCTGCTCCGGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTAAATTTG GGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGC CAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGG TCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCA GTGTGCGGCCCCGTAA,結(jié)果表明,所測定序列與設(shè)計(jì)序列一致。
      參見圖3,該圖反應(yīng)了重組質(zhì)粒PCR電泳圖,其中泳道1是DL2000分子量 marker ;泳道2_5是四個平行樣品;泳道6表示陰性對照;結(jié)果表明,重組質(zhì)粒中含有 Kringle 5模板分子,模板分子和載體質(zhì)粒連接正確。
      11)培養(yǎng)和重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),其具體實(shí)現(xiàn)方式是
      挑取上述轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)出的單菌落至含有5ml培養(yǎng)液的試管中,30°C 220rpm振 蕩過夜。吸取50 μ 1培養(yǎng)物以1 100接種于含100 μ g/ml氨卞的5ml LB培養(yǎng)基中, 30°C 220rpm振蕩3小時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG,使其終濃度為ImM,再于30°C 220rpm振蕩 4小時(shí)。離心收集菌體,用200 μ 1 0.1Μ Tris-HCl (ρΗ 8.0)重懸菌體并洗滌,于5000rpm 離心5分鐘,棄去上清液。誘導(dǎo)菌體以及未加誘導(dǎo)的對照菌體分別做SDS-PAGE,染色, 脫色,成像。
      參見圖4,泳道1是蛋白質(zhì)分子量marker;泳道2是未誘導(dǎo)對照;泳道3_5是 IPTG誘導(dǎo)后的結(jié)果;結(jié)果表明,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,重組菌體在分子量約為2.8kD處有明 顯的表達(dá)條帶。這表明它們是以三聚體分子形式存在的,其表達(dá)量約占菌體總蛋白的 25%。
      1 重組蛋白質(zhì)表達(dá)分布位置的鑒定,其具體實(shí)現(xiàn)方式是
      挑取上述轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)出的單菌落至含有5ml培養(yǎng)液的試管中,30°C 220rpm振 蕩過夜。吸取Iml培養(yǎng)物以1 100接種于含100μ g/ml氨卞的100ml LB培養(yǎng)基中, 300C 220rpm振蕩3小時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG,使其終濃度為ImM,再于30°C 220rpm振 蕩4小時(shí)。離心收集菌體,用200 μ 10.IM Tris-HCl (pH8.0)重懸菌體并洗滌,于5000rpm 離心5分鐘,棄去上清液。
      將菌體加入到5ml破碎緩沖液中,進(jìn)行超聲波破碎,破碎后于12000rpm離心10 分鐘,分別收集上清和沉淀部分,沉淀用2.0M尿素洗滌兩次后用7.0M尿素溶解。上清 與沉淀以及未加誘導(dǎo)的對照菌體分別做SDS-PAGE,染色,脫色,成像。
      參見圖5,泳道1是2.0M尿素洗滌沉淀一次電泳圖;泳道2是2M尿素洗滌沉 淀二次電泳圖;泳道3是2M尿素洗滌三次電泳圖;泳道4是沉淀8M尿素溶解;泳道5 是上清電泳圖;泳道6是蛋白marker;泳道7是IPTG誘導(dǎo)裂解液;結(jié)果表明,所表達(dá)的 三聚體Kringle 5不是以包涵體的形式存在的,它們以可溶形式存在于上清中。
      1 重組蛋白質(zhì)的活性檢測,其具體實(shí)現(xiàn)方式是
      采用雞胚絨毛尿囊膜法對獲得的重組kringle 5進(jìn)行生物活性鑒定。選擇表面清 潔、蛋形規(guī)范、氣室、氣孔均勻的雞胚(已孵化7-9天),酒精消毒蛋氣室表面,用牙科 鉆劃刻凹痕,實(shí)驗(yàn)組用微量注射器注入100 μ L純化得到的蛋白溶液,對照組注射等量磷 酸鹽緩沖液,在37.8°C、CO2濃度為5%、相對濕度為50%的條件下繼續(xù)孵育72h,觀察 雞胚絨毛尿囊膜血管生長情況。然后計(jì)數(shù)單位視域面積內(nèi)的一級、二級和三級血管,并 計(jì)算單位視域面積內(nèi)的一級、二級和三級血管所占面積的百分?jǐn)?shù)。
      參見圖6,該圖反應(yīng)了采用雞胚絨毛尿囊膜法測定的重組三聚體kringle 5的生物 活性,其中左圖陰性對照的雞胚絨毛尿囊膜,右圖為加三聚體kringle 5后的雞胚絨毛尿囊膜。結(jié)果表明,所表達(dá)的三聚體Kringle 5具有很強(qiáng)的血管生長抑制活性,且其抑制血 管生成活性約是Kringle 5蛋白的三倍。
      權(quán)利要求
      1.一種高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法,其特征在于所述 高活性血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法包括以下步驟1)制備Kringle5基因的上游引物、Kringle 5基因的下游引物、pET15b質(zhì)粒DNA以 及感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)plys ;所述Kringle 5基因的上游引物含有Nco I酶切位點(diǎn);所 述Kringle 5基因的下游引物含有Xho I酶切位點(diǎn);2)根據(jù)步驟1)所得到的Kringle5基因的上游引物以及Kringle 5基因的下游引物對 Kringle 5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3)利用限制性內(nèi)切酶分別對pET15b質(zhì)粒以及步驟2)所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙 酶切,分別得到pET15b質(zhì)粒經(jīng)酶切后的產(chǎn)物以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的產(chǎn)物;所述限 制性內(nèi)切酶是Nco I酶以及Xho I酶;4)利用T4DNA連接酶對步驟3)中所得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的產(chǎn)物以及 pET15b質(zhì)粒經(jīng)酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行酶連接,得到重組質(zhì)粒pET15b/K5 ;5)將步驟4)獲取得到的重組質(zhì)粒pET15b/K5轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)plys中 培養(yǎng)并進(jìn)行保存;6)對步驟5)中已經(jīng)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)plys中的重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效 表達(dá)方法,其特征在于所述步驟1)中,所述Kringle5基因的上游引物是 ATCATGCCATGGTGCTGCTCCCGGATGTAG,其中 CCATGG 是 Nco I 酶切位點(diǎn);所述 Kringle 5 基因的下游弓丨物是 ACTTGCCTCGAGTTACGGGGCCGCACACTGAGG,其中 CTCGAG是Xho I酶切位點(diǎn)。
      3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達(dá)方法, 其特征在于所述步驟2)中對Kringle 5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系是Kringle 5基 因的上游引物和Kringle 5基因的下游引物各1 μ 1,模板1 μ 1,Taq酶25μ1,加無菌水 至50 μ 1 ; PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是95°C 5min預(yù)變性;95°C 30s變性,55°C 30s退火, 72 °C 30s延伸,30個循環(huán);72 0C 7min延伸。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達(dá)方法, 其特征在于所述步驟3)中利用限制性內(nèi)切酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切的反應(yīng)體系是NocI 1 μ 1, XhoIl μ 1,10 XM Buffer 4 μ 1,PCR 產(chǎn)物 10 μ 1,BSA 0.4 μ 1,加無菌水至 40 μ 1 ; 酶切溫度37 °C,時(shí)間2h;利用限制性內(nèi)切酶對pET15b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切的反應(yīng)體系是NocI Ιμ ,XhoI Ιμ , IOXMBuffer 4 μ 1,pET15b 20 μ 1, BSA 0.4 μ 1,加無菌水至 40μ1;酶切溫度 37°C,時(shí)間 2h。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達(dá)方法, 其特征在于所述步驟4)中對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的產(chǎn)物以及pET15b質(zhì)粒經(jīng)酶切后 的產(chǎn)物進(jìn)行酶連接的反應(yīng)體系是pET15b質(zhì)粒10 μ 1,Kringle 5片段2 μ 1,10XT4DNA Ligase Buffer 2 μ 1, T4DNA Ligase 1 μ 1,力口無菌7jC至Ij 20 μ 1 ;反應(yīng)條件是16°C保溫過夜,-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達(dá)方法,其特征在于所述步驟5)中的具體實(shí)現(xiàn)方式是將10 μ L連接產(chǎn)物加到200 μ L感受態(tài) 細(xì)胞BL21(DE3)plys的懸液中,混勻,冰浴30_40min,42°C水浴保溫90s,立即置冰上 3min,加入790 μ ILB培養(yǎng)基,180rpm,37°C震蕩培養(yǎng)60min,然后吸取200 μ 1培養(yǎng)液轉(zhuǎn) 移到加有抗生素氨芐的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達(dá)方法, 其特征在于所述步驟6)的具體實(shí)現(xiàn)方式是選取轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)出的單菌落至含有5ml 培養(yǎng)液的試管中,30°C 200 250rpm振蕩過夜;吸取50 μ 1培養(yǎng)物以1 100接種于 含100yg/ml氨卞的5ml LB培養(yǎng)基中,30°C 220rpm振蕩3小時(shí),加入誘導(dǎo)劑IPTG, 使其終濃度為ImM,再于30°C 200 250rpm振蕩4小時(shí);離心收集菌體,用200 μ 1 0.IM Tris-HCl重懸菌體并洗滌,于5000rpm離心5分鐘,棄去上清液,所述200μ10.1Μ Tris-HCl 的 ρΗ 是 8.0。
      8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5 三聚體的高效表達(dá)方法,其特征在于所述步驟1)中感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)plys的制備 方法是冰冷的CaCl2溶液的制備O.lmol/L CaCl2溶液,使用一次性濾器過濾除菌后,_4°C 冰箱存儲備用;0.05mol/L CaCl2甘油溶液30%的甘油+0.IM CaCL2 ;使用一次性濾器 過濾除菌后,_4°C冰箱保存?zhèn)溆?;無菌條件下接種大腸桿菌BL21菌株單菌落入5ml LB液體培養(yǎng)基中,37°C培養(yǎng)過 夜·’將過夜培養(yǎng)BL21菌株單菌液倒入250ml的LB液體培養(yǎng)基中,37°C振蕩3.5_4.0h,當(dāng) LB液體培養(yǎng)基的OD600值介于0.4-0.6時(shí)停止培養(yǎng);將培養(yǎng)液分裝到8個25ml預(yù)冷無菌 的聚丙烯管中,于冰上置5-10分鐘,然后4°C,8000rmp離心8min ;細(xì)胞沉淀用IOml冰 冷的CaCl2溶液重懸,4°C 6000rmp離心5分鐘;棄上清后,加入IOml冰冷的CaCl2溶液 重懸細(xì)胞,冰浴半小時(shí)后,4°C,6000rmp離心5分鐘;棄上清后,加入2ml冰冷的CaCl2 溶液重懸細(xì)胞,按每管200 μ 1量分裝于預(yù)冷的0.5ml離心管中,立即凍存于_75°C冰柜中 備用。
      9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高活性血管生長抑制劑Kringle5三聚體的高效表達(dá)方法, 其特征在于所述步驟1)中pET15b質(zhì)粒DNA的制備方法是質(zhì)粒的放大培養(yǎng)在2ml含有l(wèi)OOyg/ml氨卞抗生素的LB培養(yǎng)基中,接入含有 pET15b質(zhì)粒的ToplO單菌落,于37°C,220rpm振搖下培養(yǎng)過夜;吸取1.5ml培養(yǎng)物于離 心管中,IOOOOg離心30秒,吸去培養(yǎng)液;離心柱的活化取750μ1 GPS緩沖液加入分離柱中,靜置4min,12000g離心 2min ;質(zhì)粒的提取在上述沉淀中加入250 μ 1溶液I,吹吸使沉淀完全分散;加入250 μ 1 溶液II,蓋緊管口,快速顛倒離心管5次,以混勻溶液,靜置2min;加入350 μ 1溶液 III,蓋緊管口,溫和振蕩10秒,使溶液III在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻,靜置4min; 12000g離心lOmin,吸取上清至分離柱中IOOOOg離心lmin,棄去液體,加入500μ1 Buffer HB IOOOOg 離心 lmin,棄去液體,加入 500 μ 1 DNA Wash, IOOOOg 離心 lmin,重 復(fù)此步驟;換離心管,加入40 μ IElution Buffer放置2min,13600g離心2min,紫外分光 光度計(jì)測含量,27.5ng/ μ 1,A260/A280在1.80以上;取5 μ 1做1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,剩余儲存于_20°C ;所述溶液I和 溶液II是指質(zhì)粒小量提取試劑盒中標(biāo)注的溶液。
      全文摘要
      一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法,方法包括1)制備Kringle 5基因的上、下游引物、pET15b質(zhì)粒DNA以及感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)plys;2)對Kringle 5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3)分別PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及pET15b質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切;4)利用T4DNA連接酶對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后的產(chǎn)物以及pET15b質(zhì)粒經(jīng)酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行酶連接,得到重組質(zhì)粒pET15b/K5;5)將重組質(zhì)粒pET15b/K5轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)plys中培養(yǎng)并進(jìn)行保存;6)對重組質(zhì)粒進(jìn)行低溫誘導(dǎo)表達(dá)。本發(fā)明提供了一種高活性可溶型血管生長抑制劑Kringle 5三聚體的高效表達(dá)方法。
      文檔編號C12N15/70GK102021192SQ20101029877
      公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
      發(fā)明者妙亮, 邊六交 申請人:西北大學(xué)
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