專利名稱：從藻類中獲取生物活性化合物的微藻基因組技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物，尤其涉及其突變與基因工程。
背景技術(shù)：
在世界能源危機的形勢下，藻類尤其是微藻類，由于其低成本、高產(chǎn)出(高生物量)的諸多優(yōu)勢，受到了人們的極大關(guān)注。相同單位面積的藻類能產(chǎn)生比玉米等其它農(nóng)作物多達30倍以上的生物量。大多數(shù)藻類可以在簡單的環(huán)境條件下生存，比如有水、碳源和日光的地方，它可以通過光合作用產(chǎn)生能量以用于其自身的新陳代謝。藻類大有希望成為一種潛在的可再生能源服務(wù)于人類，因為其所含的脂肪酸能被提取出來用于生產(chǎn)生物柴油。另外，藻類還能產(chǎn)生有益于人類的天然產(chǎn)物和生物活性化合物，因此作為可再生的自然資源，藻類同樣受到人們的關(guān)注。微藻可以群集生長在諸如池塘、湖泊和水溝等的開放環(huán)境下，也可生長在像發(fā)酵過程中使用的諸如大腸桿菌和哺乳動物細胞的高度封閉的環(huán)境中。某些微藻特別適合在一些特定的開放環(huán)境下培養(yǎng)，如高鹽或強堿性的池塘或湖泊。這種極端特殊的環(huán)境大大限制了藻類競爭物種的生長，盡管其他種類的有機體仍然能夠?qū)υ摥h(huán)境造成污染。這種開放的藻類培育模式普遍具有投資低、經(jīng)濟有效、附加值高、易操作的優(yōu)勢。從另一方面來看，封閉的培育模式系統(tǒng)所需的投資和運行成本要顯著高于開放模式，但是封閉模式完全不受農(nóng)業(yè)氣候條件的影響，易于得到最佳性能品質(zhì)的產(chǎn)品。藻類產(chǎn)品具有巨大的開發(fā)潛力，能供人們食用、藥用，還可作為能源使用。這些所有開發(fā)的藻類產(chǎn)品將會滿足人類將來對各種產(chǎn)品日益增長的消費需求。據(jù)報道，藻類基因組約有12000萬個核苷酸，與其他有機體能夠共享的基因約有7000個，有超過三分之一的基因與人和顯花植物共享。從藻類中獲得的天然產(chǎn)物可被廣泛用作潛在的新型藥物制劑、保健品、化妝品，甚至是食品。盡管藻類具有廣闊的植物化學(xué)容量，但由于受到某些環(huán)境的約束它并不總能夠展示或發(fā)揮其功能性潛能。目前基因組學(xué)技術(shù)已被成功應(yīng)用于植物和農(nóng)作物?；蚪M學(xué)是研究基因組的結(jié)構(gòu)、功能及表達產(chǎn)物的學(xué)科，也是研究生物體全基因組DNA的序列和屬性的學(xué)科。然而，目前基因組學(xué)技術(shù)很少被應(yīng)用于藻類，尚無基因組方法被應(yīng)用于這些藻類物種以產(chǎn)生新型化合物，因此對此技術(shù)應(yīng)用開發(fā)的潛在的藻類新化合物前景廣闊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種從藻類中獲取生物活性化合物的微藻基因組技術(shù)， 利用微藻基因組技術(shù)(MaGT)來獲取一些化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)可用于新藥研發(fā)、藥物制劑、保健品、農(nóng)藥、營養(yǎng)制品。發(fā)明人所提供的從藻類中獲取生物活性化合物的微藻基因組技術(shù)Microalgae Genomics Technology(MaGT)是將藻類進行誘變處理，誘導(dǎo)大量的微藻細胞產(chǎn)生隨機活化突變反應(yīng)，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的變異微藻細胞；隨后將其置于基因組中，這些細胞形成一個群體的突變克隆，每個克隆體異常表達一個或多個活性基因，其中的部分突變體能夠激活次生代謝產(chǎn)物途徑當中的酶的基因；這些單個克隆體的提取物通過高通量篩選(HTS)來測試其是否具有所需要的生物活性，就能從具有抗菌活性的突變藻類當中獲取新的化合物， 并能提高藻類當中脂肪酸的產(chǎn)量。上述誘變處理是采用激活標記誘變法(ATM)實現(xiàn)的。發(fā)明人指出微藻基因組技術(shù)(MaGT)可應(yīng)用于藻類如微藻，而并非僅僅限于微藻。它還可應(yīng)用于小球藻，但不僅僅限于小球藻。本發(fā)明的技術(shù)具有以下特點(1)微藻基因組技術(shù)(MaGT)利用隨機活化突變反應(yīng)，通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化膿桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的變異微藻細胞。隨后這些細胞形成一個群體的突變克隆，每個克隆體異常表達一個或多個活性基因，其中的部分突變體能夠激活次生代謝產(chǎn)物途徑當中的酶的基因。(2)MaGT能夠用來產(chǎn)生具有生物活性的新化合物。例如，生成具有抗菌活性的新化合物，再用高通量篩選方法進行篩選，然后把這些克隆體分離開來。(3)MaGT也能用來產(chǎn)生新的脂肪酸或提高ω-3脂肪酸(EPA，DHA，ALA)和ω-6脂肪酸(ARA、GLA)的含量，這些脂肪酸以及它們的甲酯、乙酯衍生物具有新的抗口腔病原體等微生物的活性。(4)MaGT也能用來產(chǎn)生新的脂肪酸，或能提高ω-3脂肪酸(EPA，DHA, ALA)、ω-6 脂肪酸(ARA、GLA)及其甲酯、乙酯衍生物的含量，這些脂肪酸的酯類產(chǎn)品能被作為生物燃料使用。(5)作為一種新方法和新技術(shù)，MaGT能夠用來產(chǎn)生一些新型化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)可用于新藥研發(fā)、藥物制劑、保健品、農(nóng)藥、營養(yǎng)制品，但并不僅限于這些商業(yè)用途。
具體實施例方式本發(fā)明通過下面的實施例予以進一步說明，但實施例并不限定本發(fā)明的范圍。實施例1首先，將微藻種屬的小球藻Chlorella vulgaris采用激活標記誘變法(ATM)進行誘變處理，通過根癌農(nóng)桿菌的DNA轉(zhuǎn)移到藻類基因組中。隨機將病毒增強子序列和具抗生素耐藥性的細菌基因結(jié)合到微藻基因組中。然后篩選能夠在含潮霉素的介質(zhì)中成長的藻類細胞，此時表明經(jīng)標記的DNA(T-DNA)已經(jīng)在這些細胞當中構(gòu)建成功。增強子序列激活毗近結(jié)合點的基因表達，對于小球藻來說， 100，000個突變細胞能夠飽和大部分經(jīng)激活變異的基因組。隨后，將這些細胞在半固化介質(zhì)中培養(yǎng)，形成 100，000個重組克隆體。挑出單個的克隆體來篩選和分離。在一些培養(yǎng)環(huán)境中，通過ATM的一個或多個基因的隨機激活作用會對這些克隆培養(yǎng)物的次級代謝有特定的影響。這個過程是我們微藻基因組技術(shù)(MaGT) 的重要組成部分。實施例2采用高通量篩選方法(HTS)來篩選新化合物，例如采用快速的rezasurin方法 (即Blu-Red 微生物測定法)能夠檢測分析重組藻類克隆體的抗菌活性。用HTS快速方法測定對于口腔細菌的抗菌活性，以rezasurin作為快速比色標記物來分析細菌活性和對于口腔細菌的抗菌活性。例如，將變形鏈球菌(ATCC 25175)接種在tryticase大豆肉湯酵母提取液中(購于Oxoid有限公司)，在37°C的缺氧條件(85%氮氣，10%的氫氣，5%的二氧化碳)下培養(yǎng)。在96孔板中對96種重組小球藻克隆體進行分離和培養(yǎng)，制備每種克隆體的提取物并檢測其對變形鏈球菌的抗菌活性。將重組藻類提取物溶解在100 μ 1的50%乙醇中，從中取5μ 1置于96孔板中測試其生物活性。其中每個小孔中均預(yù)先加有TSBYE介質(zhì)和在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的10%的細菌接種物。孵化16-18個小時后，取8μ 1 rezasurin 溶液加入96孔板中。重組的小球藻克隆體在抗菌活性測試中會呈現(xiàn)陽性反應(yīng)-顯示藍色， 根據(jù)顏色反應(yīng)將其挑選出來，再將其涂于血液瓊脂平皿(Reme 1 )上，在37°c的缺氧條件下孵化48小時。經(jīng)計數(shù)并測定其菌落形成單位，評價藻類克隆體的抑菌活性。與對照組相比， 有兩種克隆體顯示了強大的抗菌活性。實施例3將在96孔板抗菌測試中呈陽性反應(yīng)(由顏色變化判斷)的重組小球藻克隆體挑選出來，進一步在血液瓊脂平皿上對其進行分析。如前所述，這些克隆體之間的抗菌活性差別很大。分離呈陽性反應(yīng)的克隆體并將其接種在24孔板上，收集相應(yīng)的培養(yǎng)物，再次測試其提取物的生物活性。挑選具有最高生物活性的克隆體，將其提取物稀釋10倍并進一步測試其抗菌活性。經(jīng)過3輪試驗篩選，選取了兩個呈陽性反應(yīng)的克隆體(第15號和18號)， 它們顯示了強大的抗菌活性。將15和18號克隆體的提取物經(jīng)連續(xù)稀釋后繼續(xù)測定其抗菌活性，結(jié)果15號克隆體顯示其具有劑量依賴性的生物活性。實施例4用己烷提取重組小球藻克隆體中的脂肪酸，在pH值為3的酸性條件下加入質(zhì)量分數(shù)為75%的乙醇使脂肪酸酯化。采用GC/MS對脂肪酸乙酯進行分析，獲得其化學(xué)特性。GC/ MS數(shù)據(jù)顯示，小球藻的一些克隆體與原先的野生小球藻相比，某些類型的脂肪酸含量有顯著的提高，如ALA。
權(quán)利要求
1.從藻類中獲取生物活性化合物的微藻基因組技術(shù)，其特征在于該技術(shù)是將藻類進行誘變處理，誘導(dǎo)大量的微藻細胞產(chǎn)生隨機活化突變反應(yīng)，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的變異微藻細胞；隨后將其置于基因組中，這些細胞形成一個群體的突變克隆，每個克隆體異常表達一個或多個活性基因，其中的部分突變體能夠激活次生代謝產(chǎn)物途徑當中的酶的基因；這些單個克隆體的提取物通過高通量篩選(HTS)來測試其是否具有所需要的生物活性，就能從具有抗菌活性的突變藻類當中獲取新的化合物，并能提高藻類當中脂肪酸的產(chǎn)量。
2.如權(quán)利要求1所述的微藻基因組技術(shù)，其特征在于所述的藻類包括微藻和小球藻。
3.如權(quán)利要求1所述的微藻基因組技術(shù)，其特征在于所述誘變處理是采用激活標記誘變法(ATM)實現(xiàn)的。
全文摘要
從藻類中獲取生物活性化合物的微藻基因組技術(shù)，該技術(shù)是將藻類進行誘變處理，誘導(dǎo)大量的微藻細胞產(chǎn)生隨機活化突變反應(yīng)，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的變異微藻細胞；隨后將其置于基因組中，這些細胞形成一個群體的突變克隆，每個克隆體異常表達一個或多個活性基因，其中的部分突變體能夠激活次生代謝產(chǎn)物途徑當中的酶的基因；這些單個克隆體的提取物通過高通量篩選(HTS)來測試其是否具有所需要的生物活性，就能從具有抗菌活性的突變藻類當中獲取新的化合物，并能提高藻類當中脂肪酸的產(chǎn)量。而且本技術(shù)能夠用來產(chǎn)生一些新型化學(xué)物質(zhì)，這些化學(xué)物質(zhì)可用于研發(fā)新藥、藥物制劑、保健品、農(nóng)藥、營養(yǎng)制品。
文檔編號C12N15/63GK102443592SQ201010500530
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者周英, 王慧娟, 黃赤夫 申請人:周英