專利名稱：納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種納米技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，特別是一種利用非對(duì)稱二維DNA折紙芯片上所構(gòu)建5nm粒徑的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
納米金(nanogold)是指金的微小顆粒，其直徑為1 lOOnm，一般為分散在水中形 成的膠體溶液，故又稱膠體金。在納米金顆粒表面吸附著某種化學(xué)物質(zhì)，單體納米金顆粒是 非常穩(wěn)定的。金納米粒子電子密度高，具有量子尺寸效應(yīng)，小體積效應(yīng)和表面效應(yīng)，可以通 過(guò)靜電引力、疏水效應(yīng)等多種作用形式與大分子結(jié)合形成穩(wěn)定的膠體金探針。在過(guò)去40多 年來(lái)，納米金顆粒已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)以及生物標(biāo)記等生物技術(shù)中。現(xiàn)有技術(shù)的形成是2006年加州理工大學(xué)的Rothemimd提出、設(shè)計(jì)、并實(shí)現(xiàn)了 DNA 折紙術(shù)[Rothemund Pff. Nature 2006,440,297], Rothemund 在最初的文章中折出了 六種圖形，雖然各具特色，但不難發(fā)現(xiàn)它們?nèi)渴菍?duì)稱圖形；引入分支遷移反應(yīng)(branch migration)，或稱toehold原理，最早是用在構(gòu)造納米器件上的，其實(shí)就是一個(gè)DNA鏈間的 競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制雖然一開(kāi)始局部可能不按設(shè)計(jì)配對(duì)結(jié)合，但經(jīng)過(guò)緩慢降溫的熱動(dòng)力學(xué)過(guò)程，那 些整條鏈都能互補(bǔ)的寡核苷酸鏈將取代其他部分互補(bǔ)的情況，最終達(dá)到完全匹配[Yurke B, Turberfield AJ, Mills Jr AP, etal. Nature 2000，406，605]。另外，前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果所 得，toehold長(zhǎng)度不同，分支遷移反應(yīng)的時(shí)間就不同(兩者成指數(shù)關(guān)系)[Yurke B, Mills A. Genetic Programming and Evolvable Machines 2003,4,111]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿 基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也 可由堿基的插入或缺失所致，目前，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法包括等位基因特異性雜交 法，內(nèi)切酶酶切技術(shù)，引物延伸法，寡核苷酸連接反應(yīng)等。公開(kāi)文獻(xiàn)記載了張釗等在先進(jìn)材料上發(fā)表名為空間可尋址免索引的液相非對(duì)稱 DNA折紙芯片文章中公開(kāi)了 DNA折紙芯片訂書釘鏈序列表[Zhao Ζ, Ying W，et al. Adv Mater2010, 22，1 ]，該文利用仿中國(guó)地圖形狀的非對(duì)稱二維DNA折紙術(shù)為模板，在模板上 設(shè)計(jì)和引出特定的寡核苷酸序列作為連接位點(diǎn)，通過(guò)和修飾了互補(bǔ)序列DNA短鏈的生物 素-親和素系統(tǒng)雜交結(jié)合，把納米粒子結(jié)合到折紙芯片上，同時(shí)，還對(duì)納米粒子的結(jié)合位置 進(jìn)行了比較。在對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的進(jìn)一步檢索中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)“利用在仿中國(guó)地圖形狀的納米折 紙術(shù)結(jié)構(gòu)上連接5nm粒徑膠體金作為標(biāo)記，應(yīng)用toehold原理”的技術(shù)來(lái)檢測(cè)單核苷酸多態(tài) 性相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法。本發(fā)明采用現(xiàn)有技術(shù)相同的DNA折紙芯片訂書釘鏈序列表，方向是從左到右 為5’ _3’，但是，本發(fā)明中模板上設(shè)計(jì)結(jié)合位點(diǎn)的位置和伸出特定的寡核苷酸序列在制備 DNA折紙芯片時(shí)，需將帶伸出寡核苷酸捕獲探針的訂書釘鏈替換列表中相同序列號(hào)的訂書 釘鏈即可。本發(fā)明利用DNA折紙芯片上所構(gòu)建的納米金顆粒，利用toehold長(zhǎng)度不同，分支 遷移反應(yīng)的時(shí)間就不同(兩者成指數(shù)關(guān)系)，從而檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明包括如下步驟第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱二維圖形，制備DNA折紙芯片；所述的非對(duì)稱二維圖形是依靠M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基腳手 架長(zhǎng)鏈光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而圖形則來(lái)自用于綁定的229條短訂書釘鏈。所述的DNA折紙芯片的制備方法(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ訂書釘鏈，包括形成非對(duì)稱二維圖形的、伸出探針的等 體積混合，再稀釋20倍備用；(2)在96孔板上混合總量為30 μ 1的溶液0. 025 μ M訂書釘鏈22 μ 1 ；1/2濃度 的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 X TAE-Mg2+buffer :7μ 1。第二步，制備膠體金探針；所述的膠體金探針制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時(shí)。②加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。③4°C，15000rpm離心10分鐘，棄上清。④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。⑤加入Ix TE ；IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長(zhǎng)紫外吸收峰測(cè)定。第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交；所述的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比1混合， 50°C水浴雜交1小時(shí)。第四步，粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片連接；所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片摩爾濃度 比2比1混合，37°C水浴雜交1小時(shí)。第五步，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)。第五步中所述的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的步驟在原子力顯微鏡成像前，加入報(bào)告 探針摩爾濃度2倍量的靶核苷酸鏈，取若干時(shí)間點(diǎn)原子力顯微鏡成像。用所述的原子力顯微鏡時(shí)間梯度成像，原本都是有亮點(diǎn)的，在某一時(shí)間后，完全互 補(bǔ)的已沒(méi)有亮點(diǎn)，根據(jù)分支遷移反應(yīng)機(jī)制，加入兩種toehold長(zhǎng)短不同靶核苷酸鏈，單堿基 突變的仍有明顯亮點(diǎn)。本發(fā)明是在折紙圖形特定位置附近伸出三條訂書釘鏈末端修飾寡核苷酸的捕獲 探針(capture probe)，讓它們與同一個(gè)末端修飾5nm粒徑金膠顆粒的報(bào)告探針(importer probe)三對(duì)一雜交，雜交位點(diǎn)在原子力顯微鏡下呈現(xiàn)明顯亮點(diǎn)，從而作為標(biāo)記。
本發(fā)明根據(jù)分支遷移反應(yīng)機(jī)制，加入兩種toehold長(zhǎng)短不同靶核苷酸鏈(target strands)，用原子力顯微鏡時(shí)間梯度成像，原本都是有亮點(diǎn)的，在某一時(shí)間后，完全互補(bǔ)的 已沒(méi)有亮點(diǎn)，單堿基突變的仍有明顯亮點(diǎn)。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，本發(fā)明檢測(cè)單核苷 酸多態(tài)性效率能達(dá)到95%以上。本發(fā)明與傳統(tǒng)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法相比，具有無(wú)需嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和復(fù)雜的酶反應(yīng)，同時(shí)既簡(jiǎn)單，成本又低等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測(cè)條件本實(shí)施例利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造的中國(guó)地圖的形狀，依靠腳手架長(zhǎng)鏈(M13mpl8噬菌 體的單鏈DNA，長(zhǎng)達(dá)7249個(gè)堿基)光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而地案則來(lái)自用于 綁定的229條短訂書釘鏈，此圖形的特點(diǎn)是229條訂書釘鏈就是兩百多個(gè)可尋址的潛在反 應(yīng)位點(diǎn)，模版上的任何一點(diǎn)都可以利用圖形自身作為參照精確定位，無(wú)需索引標(biāo)記，另外， 229條短DNA單鏈中的任意一條都可以伸出核苷酸序列作為捕獲探針與帶納米顆粒標(biāo)記的 互補(bǔ)核苷酸序列進(jìn)行雜交，作為折紙圖形上納米顆粒的標(biāo)記點(diǎn)，在原子力顯微鏡下(Atomic Force Microscope, AFM)呈現(xiàn)突出亮點(diǎn)，以便觀測(cè)。本實(shí)施例以中國(guó)地圖為芯片基底，所有訂書釘鏈，包括形成地圖的、伸出探針的， 全部從上海捷瑞公司訂購(gòu)(PAGE純化)，且統(tǒng)一用二次水稀釋到100 μ M備用。腳手架鏈?zhǔn)?用NEB公司的M13mpl8病毒單鏈，貨號(hào)N4040S。共7249base，濃度為0. 25 μ g/μ 1，總5 μ g。 由于Iyg 0.42pmol，故濃度約0. 1ρΜ/μ 1 = 0. ΙμΜ。實(shí)際稀釋到1/2濃度使用。不用 酶切處理，保持環(huán)鏈狀態(tài)。5nm粒徑膠體金使用Sigma公司，貨號(hào)G1402。使用相同的反應(yīng) buffer 和成像 buffer 在 1 X TAE (Tris，40mM ；乙酸，20mM ;EDTA，2mM)中加入乙酸鎂粉末， Mg2+終濃度為12. 5mM, pH8. 0。使用美國(guó)Veeco/Digital Instruments公司的多模式原子 力顯微鏡(Multimode AFM)觀測(cè)。J-scanner，NP-S針尖，共振頻率在7_10kHz之間。本實(shí)施例實(shí)施檢測(cè)步驟如下第一制備仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片1.把所有要用的訂書釘鏈(100μΜ)包括形成地圖的、伸出探針的等體積混合，再 稀釋20倍備用。2.在96孔板上按照以下體系混合溶液(以下是最“節(jié)省”的體系，實(shí)際做時(shí)可以 整體翻倍，或單獨(dú)把腳手架鏈翻倍)訂書釘鏈(0.025 μ Μ) 22 μ 1 ；M13mpl8 (1/2 濃度)1 μ 1 ；1X TAE-Mg2+buffer 7 μ 1 ；Total30 μ 1 ；3.放在 PCR 儀(ABI 9700)上退火，95°C 降溫至 20°C，0. 1°C /IOs = 0. 6°C /min =rc /ioos。 第二 制備5nm粒徑膠體金探針1.寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時(shí)。2.加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)。3. 4°C，15000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。4.加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。5.加入 Ix TEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。6. 5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長(zhǎng)紫外吸收峰測(cè)定。第三IOnt DNA短鏈與5nm粒徑膠體金探針雜交5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比1混合，50°C水浴雜交1小 時(shí)。第四5nm粒徑膠體金探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片連接5nm粒徑膠體金探針與仿中國(guó)地圖形狀DNA折紙芯片摩爾濃度比2比1混合，37°C 水浴雜交1小時(shí)。第五單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)在原子力顯微鏡成像前，加入報(bào)告探針摩爾濃度2倍量的靶核苷酸鏈，取幾個(gè)時(shí) 間點(diǎn)(加前、加后15分鐘、加后1小時(shí)，加后3小時(shí)等)原子力顯微鏡成像。DNA折紙芯片訂書釘鏈伸出寡核苷酸探針如下(直體部分是訂書釘鏈，斜體部分 是伸出寡核苷酸探針，橫線部分是toehold，加框部分是SNP檢測(cè)位點(diǎn)，從左到右為5’ -3’， 制備DNA折紙芯片時(shí)，替換相同序列號(hào)訂書釘鏈)44 CGCCTAGnGGACMCGACACCTCCA^ATACk GTTAATGCGTCATACATGGCTTTTAAAGCCA45 CGCCTAGnGGACMCGACACCTCCA^ATA(L TCTGAATTTACCGTTCCAGTAAG60 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATA(R AATGGAAAGAGCCGCCGCCAGCAGATTTGTA61 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATACiG TGTCGACACCAGAACCACCACCAGCGCAGT81 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATACi CATCGCCAAGGCTTGCCCTGACGGTTTACCA83 CGCCTAGnGGACAACGACACCTCCA^ATACK CCTGCTCATCAACGTAACAAAGCGAGAGGCT101 CGCCTAGTTGGACAACGACACCTCCA^ATACRkC, GACGAAAGATTAAGAGGAAGCTAGTTTGA102 CGCCTAGTTGGACMCGACACCTCCA^ATAOX. AAATGGAGCGGATTGCATCAAATAAAAACC103 CGCCTAGTTGGACAACGACACCTCCA^ATAm TGCAAATTATAGTCAGAAGCAATCAATAAC121 CGCCTAGTTGGACMCGACACCTCCA^ATAOC￡k TTAGATTATTTCAACGCAAGGGGAGCAAA
122 CGCCTAGTTGGACAACGACACCTCCA^ATAOC,^ TAATCTTTGCGGGAGAAGCCTTACATTTC123 CGCCTAGTTGGACMCGACACCTCCA^ATA(L TGTTTAGATGACCCTGTAATACTGTAAAACTIOnt DNA短鏈序列(從左到右為5，-3，)CGCCTAGTTG巰基基團(tuán)修飾報(bào)告探針序列(從左到右為5’ -3’ )
GTGGAGGTGTCGTTGTCCAACTAGGCG-SH兩種toehold長(zhǎng)短不同靶核苷酸鏈(橫線部分是toehold，加框部分是SNP檢測(cè)位 點(diǎn)，從左到右為5’ -3’ )GTAi|g TGGAGGTGTCGTTGTCCAACTAGGCG(full-matched)GTAT@G TGGAGGTGTCGTTGTCCAACTAGGCG本實(shí)施例通過(guò)原子力顯微鏡成像的結(jié)果可以驗(yàn)證，本實(shí)施例的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，檢 測(cè)成本又低等優(yōu)點(diǎn)，而且無(wú)需嚴(yán)格的檢測(cè)的條件和復(fù)雜的酶反應(yīng)。驗(yàn)證時(shí)，吸取2. 5 μ 1樣品(實(shí)際2-5 μ 1均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后 即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)一使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，采用本實(shí)施例所述方法，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性效率 能達(dá)到95%以上
權(quán)利要求
一種納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱二維圖形，制備DNA折紙芯片；第二步，制備膠體金探針；第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交；第四步，粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片連接；第五步，單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，第一步 中所述的DNA折紙芯片的制備方法(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ訂書釘鏈，包括形成非對(duì)稱二維圖形的、伸出探針的等體積 混合，再稀釋20倍備用；(2)在96孔板上混合總量為30μ 1的溶液0. 025 μ M訂書釘鏈22 μ 1 ；1/2濃度的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 XTAE-Mg2+buffer :7μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，第二步 中所述的膠體金探針制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時(shí)；②加入終濃度0.IM NaCl，室溫300rpm搖48小時(shí)；③40C，15000rpm離心10分鐘，棄上清；④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.IM NaCl清洗兩次；⑤加入Ix TE ；IOmM Tris-HCl，ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存；⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長(zhǎng)紫外吸收峰測(cè)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，第三步 中所述的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比1混合，50°C水 浴雜交1小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，第四步 中所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片摩爾濃度比2比1 混合，37°C水浴雜交1小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，第五步 中所述的單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)的步驟在原子力顯微鏡成像前，加入報(bào)告探針摩爾濃度2 倍量的靶核苷酸鏈，取若干時(shí)間點(diǎn)原子力顯微鏡成像。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，所述的 原子力顯微鏡成像，原本都是有亮點(diǎn)的，在某一時(shí)間后，完全互補(bǔ)的已沒(méi)有亮點(diǎn)，根據(jù)分支 遷移反應(yīng)機(jī)制，加入兩種toehold長(zhǎng)短不同靶核苷酸鏈，單堿基突變的仍有明顯亮點(diǎn)。
全文摘要
一種納米技術(shù)領(lǐng)域的納米金顆粒檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的方法。包括如下步驟利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個(gè)非對(duì)稱二維圖形，制備DNA折紙芯片；制備膠體金探針；DNA短鏈與膠體金探針雜交；粒徑膠體金探針與非對(duì)稱二維圖形DNA折紙芯片連接；單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)。本發(fā)明具有無(wú)需嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件和復(fù)雜的酶反應(yīng)，同時(shí)既簡(jiǎn)單，又低成本等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)本發(fā)明可以在納米尺度、液相反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)DNA雜交過(guò)程，實(shí)現(xiàn)高靈敏的生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101956015SQ20101050306
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者馮曉錄, 李璨, 賀林, 陳培華 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué);上海佰真生物科技有限公司