專利名稱：純化質(zhì)粒dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸純化的方法。本發(fā)明特別涉及制備高度純化的質(zhì)粒DNA(pDNA)的 方法，特別涉及生產(chǎn)和分離藥物級質(zhì)粒DNA。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)的發(fā)展清楚地說明，基于質(zhì)粒的療法，尤其在疫苗和人類基因治療領(lǐng) 域中，可能支持有效的疾病治療途徑。但是，對于該技術(shù)存在一個顯著的障礙，那就是制備 數(shù)量上和質(zhì)量上都足以用于臨床的質(zhì)粒DNA。通過質(zhì)粒DNA來將正常基因安全而有效地導(dǎo) 入人類細胞是一種有前景的方法。質(zhì)粒DNA是一種閉合環(huán)狀形式的細菌DNA，其中可插入 感興趣的DNA序列?？梢詫?dǎo)入哺乳動物細胞的感興趣的DNA序列的例子包括外源的功能基 因，或突變基因，反義序列，干擾RNA (RNAi)或雙鏈干擾RNA (dsRNAi)，核酶(ribozymes)，例 如在病毒感染，癌癥或血管發(fā)生相關(guān)疾病的治療中。一旦導(dǎo)入到人類細胞中，pDNA就開始 復(fù)制并產(chǎn)生被插入的DNA序列的拷貝。因此，科學(xué)家們把質(zhì)粒DNA看作一種有前景的載體， 用于將感興趣的DNA序列傳送到人類細胞中以治療多種疾病狀態(tài)。
為了在治療中實施基于質(zhì)粒的技術(shù)，需要極大量的質(zhì)粒DNA用于研究和開發(fā)。由 于用于基因治療和其他臨床應(yīng)用的質(zhì)粒DNA通常是用細菌例如大腸桿菌(Escherichia coli)生產(chǎn)的，需要有效地將質(zhì)粒DNA與細菌細胞的基因組DNA(gDNA)及細菌細胞的內(nèi)毒素 和蛋白質(zhì)分離的方法。由此，對于簡單、穩(wěn)健、可放大、可用來從細菌細胞中分離大量的質(zhì)粒 DNA的純化方法，存在著不斷增長的需求。
在任何質(zhì)粒純化方法中都有一個重要的步驟，其包括裂解細菌細胞以釋放細胞 內(nèi)容物，從該內(nèi)容物中可分離pDNA。事實上，首先需要實現(xiàn)細胞重懸、細胞裂解，及宿主污 染物的中和和沉淀這三個步驟。細胞重懸一般使用手動或磁力攪拌器，和勻漿器或轉(zhuǎn)葉 (impeller)混合器將細胞重懸于重懸緩沖液中。細胞裂解可通過手工旋轉(zhuǎn)或磁力攪拌來 將重懸的細胞與裂解溶液(由稀堿和去污劑組成)，然后將該混合物在室溫00-25攝氏度 (degrees Celsius))或冰上保持一段時間，例如5分鐘，來完成裂解。如上面指出的，手工 旋轉(zhuǎn)和磁力攪拌是不可放大的。第三個步驟是宿主污染物的中和和沉淀。第二個步驟生成 的裂解物通常通過溫和的旋轉(zhuǎn)或磁力攪拌與冷的中和溶液混合以酸化該裂解物，然后置于 冰中10-30分鐘以便于高分子量的染色體DNA、宿主蛋白質(zhì)和其他宿主分子變性和沉淀。手 工旋轉(zhuǎn)和磁力攪拌都是不可放大的。
通常，通過短時間溶菌酶處理，或通過堿或醋酸鉀(KOAc)處理來消化細胞壁。一 般還加入RNA酶來降解細菌懸液中的RNA。這些化學(xué)性步驟對小規(guī)模地裂解細胞可能是足 夠的。但是，粘度的增加使得大規(guī)模的加工非常困難。
—種快速而簡單的質(zhì)粒制備的替代方法包括用溶菌酶處理細菌，然后在合適的緩沖液中約100°C左右煮沸20到40秒，生成不溶的基因組DNA、蛋白質(zhì)和碎片的凝結(jié)塊 (clot)，留下質(zhì)粒和作為主要污染物的RNA在溶液中。接著，加入NaOH和十二烷基硫酸鈉 (SDS)來溶解細胞膜。NaOH部分地變性DNA并部分地降解RNA ；SDS起溶解膜和變性蛋白的 作用。接著，加入5N醋酸鉀(pH 4.8)來沉淀SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物和細胞碎片。此時，pH對 于中和上述操作中使用的NaOH和復(fù)性質(zhì)粒都是重要的。此后，離心除去沉淀，得到上清中 的目標質(zhì)粒。但是，該技術(shù)不適合放大到高容量的細菌發(fā)酵，其原本就是用于小于5升的發(fā) 酵的。同時，這一系列的操作要求緩慢和穩(wěn)定地混合以避免細菌染色體DNA被切割成小片 段并聚集，使它們污染質(zhì)粒，并且難以在大規(guī)模加工中實現(xiàn)。
一種常用的裂解細胞的替代方法稱為堿裂解(alkaline lysis)，其包括(consist of)將細菌細胞懸液(溶液1)和堿裂解溶液(溶液幻混合。溶液2包括去污劑，例如十二 烷基硫酸鈉(SDS)，用于裂解細菌細胞并釋放細胞內(nèi)物質(zhì)；和堿，例如氫氧化鈉，用于使細 胞的蛋白和核酸(特別是gDNA和RNA)變性。由于細胞裂解和DNA變性，溶液的粘度急劇升 高。變性后，加入酸性溶液，例如醋酸鉀(溶液幻以中和氫氧化物，導(dǎo)致核酸的變性。gDNA 的長片段隨機地重新結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其以絮凝物的形式沉淀，并捕獲蛋白，脂類及其他 核酸。十二烷基硫酸的鉀鹽也沉淀，并帶走與其結(jié)合的蛋白。pDNA(質(zhì)粒DNA)互相纏繞的 兩條鏈正常地重新組合，恢復(fù)為初始的質(zhì)粒，并保留在溶液中。
該裂解技術(shù)是以分批的模式進行的，S卩，通過順序地將不同的溶液加入容器或槽 中來混合這些溶液。由于堿裂解物是極難于操作的粘彈性流體，這種方法在混合不同溶液 過程中存在困難。由于剪應(yīng)力造成gDNA片段化，片段化的gDNA極難與pDNA分離，因此需 要避免對該流體施加剪應(yīng)力的方法。另外，大PDNA(即大于約10個千堿基對)也對混合過 程中的剪切損傷敏感。當含有細胞懸液的溶液與裂解溶液混合后，粘彈性的堿裂解物與中 和溶液混合。同樣，由于該溶液的粘彈性性質(zhì)，該混合過程也是有問題的。
另外，放大該分批裂解方法的另一個困難包括在試圖限制剪應(yīng)力以避免gDNA片 段化的同時混合不同流體的效率。如前面所述的，片段化的基因組DNA的色譜行為與pDNA 非常相似，因此幾乎不可能使用標準的純化程序來去除gDNA。由此，使用分批方法裂解細菌 細胞明顯地存在幾方面的局限性，例如放大，片段化的gDNA污染導(dǎo)致回收的pDNA的質(zhì)量不 佳，以及所得的PDNA的量相對較低等等。
相對于分批方法，還提出了幾種使用一系列靜態(tài)混合器連續(xù)地混合多種細胞裂解 溶液的方法。根據(jù)這些方法，細胞懸液和細胞裂解溶液被同時加入靜態(tài)混合器。然后，將從 所述第一個靜態(tài)混合器中出來的裂解細胞的溶液與沉淀溶液同時加入第二個靜態(tài)混合器。 從第二個靜態(tài)混合器中出來的溶液含有沉淀的裂解物和質(zhì)粒。其他裂解細胞的連續(xù)模式包 括使用流過式(flow-through)熱交換器，其中懸浮的細胞被加熱到70-100°C。在熱交換器 中裂解細胞后，對出口流進行連續(xù)流式或分批式離心，此過程中細胞碎片和基因組DNA被 沉淀，留下質(zhì)粒DNA在上清中。
因此，從大容量的微生物發(fā)酵中大規(guī)模地分離和純化質(zhì)粒DNA需要開發(fā)改進的質(zhì) 粒制備方法。
盡管目前有多種方法用于裂解細菌細胞，但這些方法都沒有涉及流體的粘彈性質(zhì) 和混合步驟中牽涉的剪切力所引起的問題。因此，本發(fā)明涉及大規(guī)模連續(xù)堿裂解細菌細胞 懸液的新方法，并提供限制剪切力的重要優(yōu)點。
在任何涉及在治療中將核酸引入人或動物的應(yīng)用中，還有重要的一步，就是對大 量高度純化的、藥物級的核酸的需求。這樣的純化核酸必需滿足安全性、效力(potency)和 效能(efficacy)的藥品質(zhì)量標準。另外，還希望有能放大的方法，可以用來生產(chǎn)若干克量 的DNA。因此，希望有這樣的制備高純度核酸的方法，其不需要毒性化學(xué)品，誘變劑，有機溶 劑或者其他可能損害產(chǎn)品核酸的安全性和效力，或使放大變得困難或無法實行的試劑。還 希望能制備沒有內(nèi)毒素污染的核酸，內(nèi)毒素施用于患者后可引發(fā)毒性反應(yīng)。當質(zhì)粒DNA是 從革蘭氏陰性細菌來源純化時，去除內(nèi)毒素是特別重要的革蘭氏陰性細菌具有高水平的 內(nèi)毒素，作為其細胞外膜的必需組分。
從細菌發(fā)酵分離和純化質(zhì)粒DNA的經(jīng)典方法適用于小型或?qū)嶒炇乙?guī)模的質(zhì)粒制 備。含質(zhì)粒的細菌宿主細胞破碎之后，用醋酸鹽中和使得宿主細胞基因組DNA和蛋白質(zhì)沉 淀，并一般通過例如離心而去除。質(zhì)粒含于液相中，通過醇沉淀后，在溴化乙錠存在下使用 CsCl進行等密度離心以分離各種形式，即超螺旋的，缺口環(huán)狀(nicked circle)，和線性化 的質(zhì)粒DNA。需要用丁醇進一步抽提以去除殘余的溴化乙錠，然后用醇沉淀DNA。接著進行 其它去除宿主細胞蛋白質(zhì)的純化步驟。
這些現(xiàn)有的分離質(zhì)粒DNA的方法有幾點局限性。例如，涉及使用大量可燃性有機 溶劑(例如乙醇或異丙醇)和有毒化學(xué)品，例如溴化乙錠、苯酚和氯仿的方法，對于大規(guī)模 分離和純化質(zhì)粒DNA是不理想的。氯化銫離心的替代方法可用于質(zhì)粒DNA純化，例如大小 排阻(size exclusion)色譜，羥基磷灰石色譜和多種基于反相或陰離子交換的色譜方法。 這些替代方法可能足夠用來在實驗室規(guī)模產(chǎn)生少量的研究材料，但一般不易于放大，且不 能產(chǎn)生質(zhì)粒DNA的量。
另外，使用化學(xué)分離方法，分離和純化過程復(fù)雜，必須使用大量的有機溶劑，因此 產(chǎn)生了廢物處理等許多問題。
除了化學(xué)分離純化方法以外，還有用電泳分離質(zhì)粒的方法。電泳方法包括紙電泳 和凝膠電泳，目前凝膠電泳是常用的。但是，電泳方法具有分離時間長，收集困難，載樣量小 等許多問題。
目前可用的分離兩種形式的質(zhì)粒DNA的方法利用離子交換色譜(Duarte et al.， Journal of Chromatography A, 606 (1998)，31-45)或大小排阻色譜(Prazeres，D. Μ·， Biotechnology Techniques Vol. 1，No. 6，Junel997，ρ 417-420)，結(jié)合使用添加劑例如 聚乙二醇(PEG)、去污劑和其他組分例如六胺鈷(hexamine cobalt)，精胺和聚乙烯吡咯 烷酮(PVP)。但是，現(xiàn)在已知的方法不能充分地且節(jié)約成本地分離超螺旋和缺口(或松環(huán) (relaxed))DNA0而且很多已知方法都有一個缺點其使用PEG或其他添加劑，這在質(zhì)粒DNA 生產(chǎn)中是不希望的，因為它們需要額外的分離、處置和質(zhì)量控制方法，這可能是困難的，且 耗費更多的時間和成本。這些已知的分離超螺旋和松環(huán)形式的質(zhì)粒DNA的方法的替代形式 使用非常昂貴的樹脂，而且加工中還使用溶劑，例如乙腈，乙醇，和其他組分，例如三乙胺和 四丁基磷酸銨。其他分離超螺旋和松環(huán)DNA的方法依靠大小排阻色譜，其涉及基于兩種形 式的質(zhì)粒DNA在大小上的細微差異來分離二者。這些色譜柱傾向于較長，從而導(dǎo)致顯著的 放大問題，使其難以實用于大規(guī)模生產(chǎn)。而且，大小排阻方法需要濃的樣品溶液，由于DNA 的高度粘性，這對質(zhì)粒DNA溶液是難以實現(xiàn)的。
從細菌制備物生產(chǎn)的、經(jīng)常含有松環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA的質(zhì)粒DNA制備物，經(jīng)常需5要去除內(nèi)毒素，如FDA所要求的，因為已知許多細菌宿主產(chǎn)生的內(nèi)毒素會在接受該質(zhì)粒DNA 的宿主中引起炎癥反應(yīng)，例如發(fā)熱或敗血病。這些內(nèi)毒素一般是脂多糖或其片段，存在于宿 主細胞和宿主細胞膜或大分子的制備物中。因此，在用于治療或預(yù)防的質(zhì)粒DNA的純化中 內(nèi)毒素的去除是關(guān)鍵和必要的步驟。從質(zhì)粒DNA溶液中去除內(nèi)毒素主要利用內(nèi)毒素帶負電 的結(jié)構(gòu)。但是，質(zhì)粒DNA也是帶負電的，所以通常純化是這樣實現(xiàn)的使用同時結(jié)合這兩種 分子的陰離子交換樹脂，并在一定的條件下，優(yōu)選地洗脫質(zhì)粒DNA而結(jié)合內(nèi)毒素。這樣的分 離只能實現(xiàn)部分的去除，因為有相當量的內(nèi)毒素和質(zhì)粒DNA —起被洗脫，而且/或者，質(zhì)粒 DNA的回收率很低。
因此，為了從大容量微生物發(fā)酵大規(guī)模分離和純化質(zhì)粒DNA，需要開發(fā)更好的質(zhì)粒 制備方法。同時，也需要一種更簡單、更省時地分離和純化大量質(zhì)粒DNA的方法。對于基于 質(zhì)粒的研究和治療方法而言，還希望核酸的分離和純化能保持核酸相同的結(jié)構(gòu)，并以可重 復(fù)的方式進行，而且，為了避免雜質(zhì)對哺乳動物身體的不良影響，要求核酸已經(jīng)被分離純化 達到高純度。
但是，使用常規(guī)方法存在這樣的問題不能獲得足夠高的純度和足夠大的量的核 酸，尤其是質(zhì)粒。因此，本發(fā)明旨在提供一種使用至少兩個色譜步驟的分離方法，其使得在 更短的時間內(nèi)分離大量的質(zhì)粒DNA成為可能，且達到未預(yù)料到的高純度等級。
發(fā)明概述
本發(fā)明基于產(chǎn)生和分離高度純化的質(zhì)粒DNA的方法的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明產(chǎn) 生和分離的質(zhì)粒DNA含有非常低水平的污染性染色體DNA，RNA，蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。根據(jù)本 發(fā)明生產(chǎn)的質(zhì)粒DNA具有足以用于基于質(zhì)粒的治療的純度。
因此，本發(fā)明包括產(chǎn)生和分離高度純化的質(zhì)粒DNA的方法，包括細胞裂解步驟，該 步驟中存在(a)湍流裝置(a means for turbulent flow)，用于快速地混合細胞懸液和溶 解該細胞的溶液；和(b)層流裝置(ameans for laminar)，其使得(a)中產(chǎn)生的混合物可 以在不受到顯著擾動的條件下溫育，其中(a)中形成的混合物從所述湍流裝置流入所述層流裝置。
在本發(fā)明的一個進一步的實施方式中，所述機構(gòu)還包括加入第二溶液的裝置，所 述第二溶液中和裂解溶液；其中(b)中溫育的混合物從所述層流裝置流入該加入第二溶液 的裝置。
在另一個實施方式中，該機構(gòu)可用于從細胞中分離質(zhì)粒DNA的方法，該方法包括 (a)在所述湍流裝置中將細胞與堿性裂解溶液混合；和(b)加入酸性溶液來中和所述堿性 裂解溶液。
本發(fā)明還涉及連續(xù)細胞堿裂解裝置，包括第一混合器或注射器，其可以與細胞懸 液相反的方向注射堿性流體，小直徑的第一管，以在所述混合物中產(chǎn)生湍流；大直徑的第二 管，以在所述混合物中產(chǎn)生層流；和第二混合器或注射器，用于將在一端注射中和溶液和收 集裂解物。
本發(fā)明進一步包括生產(chǎn)和分離高度純化的質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA基本上 (essentially)不含污染物，因此是藥物級的DNA。
本發(fā)明的另一個目的是涉及分離和純化核酸和質(zhì)粒DNA的方法。更詳細地說，本 發(fā)明涉及分離核酸和質(zhì)粒DNA的方法，所述核酸和質(zhì)粒DNA為藥品級，可用于研究和基于質(zhì)6粒的治療方法。根據(jù)本發(fā)明的方法分離的質(zhì)粒DNA制備物可經(jīng)歷純化步驟，其至少包含三 螺旋色譜(triple helix chromatography)還可進一步包含陰離子交換色譜和疏水相互作 用色譜。
因此這些方法包括本文所描述的連續(xù)堿裂解步驟及后續(xù)陰離子交換色譜和/或 三螺旋親和色譜和/或進一步疏水相互作用色譜的組合。
因此這些方法還包括此處描述的連續(xù)堿裂解步驟，其與隨后的步驟組合，陰離子 交換色譜，三螺旋色譜，和與疏水性相互作用色譜的組合。裂解物的過濾或其它絮凝物去除 先于第一色譜步驟。
本發(fā)明的一個目的是使從宿主細胞/質(zhì)粒DNA組合中制備質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量最大 化。
本發(fā)明的另一個目的是提供基本上不含細菌宿主RNA的質(zhì)粒DNA制備物。
本發(fā)明的另一個目的是提供基本上不含細菌宿主蛋白質(zhì)的質(zhì)粒DNA制備物。
進一步地，本發(fā)明的另一個目的是提供基本上不含細菌宿主染色體DNA的質(zhì)粒 DNA制備物。
本發(fā)明的另一個目的是提供基本上不含細菌宿主內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA制備物。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備藥物級質(zhì)粒DNA的方法，所述質(zhì)粒DNA是高度純 化的，用于研究和基于質(zhì)粒的治療方法，并且其適于放大到大規(guī)模生產(chǎn)。
因此本發(fā)明包括基本不含污染物、高純度且完整的藥物級質(zhì)粒DNA，該DNA包括載 體骨架，治療基因和相關(guān)的調(diào)控序列。
本發(fā)明還涉及質(zhì)粒DNA液體制劑，該制劑是穩(wěn)定的，在室溫下長期保持不降解，因 此適用于保存用于研究和相關(guān)人類治療方法的質(zhì)粒DNA。
本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點，一部分在下面的描述部分中提出，一部分可以根據(jù)該 描述而顯然自明，或在本發(fā)明的實施中得知。本發(fā)明的目標和優(yōu)點可以借助所附權(quán)利要求 中特別指出的要素和組合來實現(xiàn)和達到。
要理解的是前面的一般性描述和下面的詳細描述都僅僅是例示性和解釋性的，而 并非限制本發(fā)明，如所聲稱的那樣。
被引入并作為本說明書的一部分的


了數(shù)個本發(fā)明的實施方式，并且與描 述部分一起起到解釋本發(fā)明的原則的作用。

圖1是可用于本發(fā)明的連續(xù)式細胞裂解的裝置的示意圖。
圖2是上述連續(xù)細胞裂解裝置的混合器Ml的示意圖。
圖3是比較三種純化方法以gDNA、RNA、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素污染物為指標的純化產(chǎn)率 的表，三種方法分別為單步的陰離子交換色譜(AEC)；陰離子交換色譜步驟和三螺旋親和 色譜步驟(THAC)組合的兩步法；和包括陰離子交換色譜步驟、三螺旋親和色譜步驟和疏水 相互作用色譜的組合的三步法；ND表示未檢測到低靈敏度的分析方法。
圖4是多種分離純化質(zhì)粒DNA方法，例如單獨使用或組合使用的陰離子交換色譜 (AEC)、羥基磷灰石色譜(HAC)，疏水相互作用色譜(HIC)，反相色譜(RPC)，大小排阻色譜 (SEC)和三螺旋親和色譜(THAC)，與本發(fā)明的方法的比較。這里提供了以純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量為指標的結(jié)果。ND表示未檢測到(低靈敏度的分析方法)。
圖5A和5B是顯示質(zhì)粒DNA在+25°C和+5°C貯存到90天的脫嘌呤和缺口率(形 成開環(huán)形式的質(zhì)粒)的圖。
定義
“酸性”表示與酸相關(guān)或含有酸，具有小于7的pH。
“堿性”表示與堿(alkali或base)相關(guān)或含有堿，具有大于7的pH。
“連續(xù)”表示不被間斷，沒有間斷。
“基因組DNA”表示來自或存在于染色體的DNA。
“層流”表示溶液水流中的一種流動形式，其中各個顆粒在與每個顆粒平行的方向 上流動。
“裂解物”表示由細胞裂解過程產(chǎn)生的物質(zhì)。術(shù)語“裂解”指通過使用含有裂解劑 的溶液進行化學(xué)處理，使處于緩沖溶液中的細胞(即細胞懸液)的細胞壁和/或細胞膜破 裂的作用。裂解劑包括，例如，堿、去污劑、有機溶劑和酶。在一個優(yōu)選的實施方式中，進行 細胞裂解以從宿主細胞中釋放完整的質(zhì)粒。
“中和”指使(溶液)稱為中性或使(酸或堿(base/alkali))受到中和作用。我 們用這個術(shù)語指中和溶液的某個物質(zhì)將該溶液的PH變?yōu)閜H5-7，優(yōu)選為7左右，更優(yōu)選比先 前更靠近7ο
“牛頓流體”(newtonian fluid)指這樣的流體，其中剪應(yīng)力與速度梯度成比例并 垂直于剪切面。比例常數(shù)被稱為粘度。牛頓流體的例子包括液體和氣體。
“非牛頓流體”(Non-newtonian fluid)指這樣的流體，其中剪應(yīng)力不僅僅與速度 梯度成比例并垂直于剪切面。非牛頓流體可能不具有確定的粘度。非牛頓流體包括塑性固 體(plastic solids)，冪律流體(power-law fluids)，粘彈性流體(viscoelastic fluids) (兼具粘性和彈性)，和時變粘度流體(time-d印endent viscosity fuids)。
“質(zhì)粒DNA”指一類由非染色體的環(huán)狀DNA組成的小的細胞內(nèi)含物，其可能具有讓 非內(nèi)源的DNA片段插入自身的能力。如本文中所使用的，質(zhì)粒DNA也可以是質(zhì)粒DNA的 任何形式，例如被切割、加工或其他被操作過的形式的非染色體DNA，包括，例如，下列的任 一個或任意組合缺口環(huán)狀(nicked circle)質(zhì)粒DNA，線性化的或線性的(linearized or linear)質(zhì)粒DNA，和單鏈質(zhì)粒DNA。構(gòu)建質(zhì)粒的程序包括如Maniatis et al. ,Molecular CloningjA Laboratory Manual, 2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中所描 述的那些。本領(lǐng)域中熟知的一種小量制備質(zhì)粒DNA的操作規(guī)程(Bimboim and Doly,Nucleic Acids Research 7 :1513 (1979))可以用來初步分離質(zhì)粒DNA，以供后面通過本發(fā)明的某些 方面來加工，并且可以和本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的高度純化樣品作比較。優(yōu)選地，該質(zhì)粒DNA 的形式是，或至少在用本發(fā)明的純化方法制備后是，基本上閉合環(huán)狀形式的質(zhì)粒DNA，或大 約80 %，85 %，90 %，95 %，或高于大約99 %為閉合環(huán)狀形式的質(zhì)粒DNA?；蛘?，超螺旋共價 閉合形式的PDNA(ccc)在某些治療方法中可能是優(yōu)選的，在該方法中其可能比開環(huán)，線性 或其他多種形式更為有效。因此，所述藥物級質(zhì)粒DNA可以從一種或多種形式的質(zhì)粒分離 或純化，并且可包含一種或多種希望的形式。
對本發(fā)明而言，術(shù)語“流動”(flowing)指使液體以一定的流速(例如升每分鐘) 通過混合器，通常通過泵的作用。需要指出，通過混合器的流速被認為影響裂解、沉淀和混合的效率。
術(shù)語“缺口的” (nicked)和“松環(huán)的” (relaxed)指非超螺旋的DNA0 “超螺旋 的”(supercoilecODNA是本領(lǐng)域熟知的用于描述特定的分離的質(zhì)粒DNA形式的術(shù)語。質(zhì)粒 DNA的其他形式在本領(lǐng)域中也是已知。
“污染性雜質(zhì)” (contaminating impunty)指希望將DNA與其分開或從其分離的任 何物質(zhì)。污染性雜質(zhì)包括但不限于，宿主細胞蛋白質(zhì)；內(nèi)毒素；宿主細胞DNA，例如染色體 DNA或基因組DNA ；和/或宿主細胞RNA。如人們所理解的，什么是污染性雜質(zhì)，或者可以認 為是污染性雜質(zhì)，可能取決于實施本發(fā)明的方法的具體條件?！拔廴拘噪s質(zhì)”可能是或不是 來自宿主細胞的，即，其可以是也可以不是宿主細胞雜質(zhì)。
“分離”或“純化”第一組分(例如DNA)指將該第一組分從最初與其一起的其他組 分中富集出來。本文提供了所希望的和/或所能達到的純化程度。
術(shù)語“基本上不含有”(essentiallyfree)和“高度純化的”(highlypurified) 定義為大約95%，和優(yōu)選地大于98. 88%純或不含污染物，或含有少于5%，和優(yōu)選地少于 1-2%的污染物。
“藥物級DNA” (pharmaceutical grade DNA)在本文中定義為這樣的DNA制備物， 其含有不多于約5%，和優(yōu)選地不多于大約1-2%的細胞組分，例如細胞膜。
本發(fā)明進一步包括生產(chǎn)和分離高度純化的質(zhì)粒DNA的方法，該質(zhì)粒DNA基本上不 含污染物，因此是藥物級的DNA。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)和分離的質(zhì)粒DNA含有極低水平， 即百萬分率(PPm，parts permillion)的污染性染色體DNA、RNA、蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素，且主要 地含有閉合環(huán)狀形式的質(zhì)粒DNA。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的質(zhì)粒DNA具有足夠的純度用于研究和 基于質(zhì)粒的治療方法及可選地用于人類臨床試驗材料和人類基因治療試驗和臨床試驗。
本發(fā)明的“藥物級質(zhì)粒DNA組合物”是指用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的藥物級質(zhì)粒DNA組 合物，和/或這樣的組合物，其至少具有一種被如下定義為“藥物級質(zhì)粒DNA”的純度水平。 優(yōu)選地，本發(fā)明的“藥物級質(zhì)粒DNA組合物”具有這樣的純度水平，其按照至少兩種如下文 提出的標準被定義為“藥物級質(zhì)粒DNA”，例如，少于約0. 00008%的染色體或基因組DNA和 少于約0. 00005%的蛋白質(zhì)污染物，或例如少于約0. 00008%的染色體或基因組DNA和少于 約0. lEU/mg的內(nèi)毒素。其他純度水平的組合也包括在該定義之下。當然，所述藥物級質(zhì)粒 DNA組合物還可以包括或包含添加的組分，其可用于任何特定用途，包括用于組合治療，組 合物和療法。染色體或基因組DNA，RNA，內(nèi)毒素或蛋白質(zhì)指來自基于細胞的質(zhì)粒生產(chǎn)的污 染物或來自純化過程中的其他污染物。
如指出的，“藥物級質(zhì)粒DNA”定義為這樣的DNA制備物，其包含百萬分之一份或 Ippm( < 0. 0001%, BP, < 0. OOOlmg 每 IOOmg 質(zhì)粒 DNA)水平的，或更少的基因組 DNA，RNA 和/或蛋白質(zhì)污染物。
同時，或更準確地，“藥物級質(zhì)粒DNA”在本文中可以指這樣的DNA制備物，其 含有少于約0. 01 %，或少于0. 001 %，且優(yōu)選地少于0. 0001 %，或優(yōu)選地少于0. 00008% (< 0. 00008%, Bp< 0. 00008mg 每 IOOmg 質(zhì)粒 DNA)的染色體 DNA 或基因組 DNA。
“藥物級質(zhì)粒DNA”還可以指這樣的DNA制備物，其含有少于約0. 01 %，或 少于0. 001 %,并優(yōu)選地少于0. 0001 %,或優(yōu)選地少于0. 00002 % ( < 0. 00002 %,即 < 0. 00002mg 每 IOOmg 質(zhì)粒 DNA)的 RNA 污染物。
“藥物級質(zhì)粒DNA”還可以指這樣的DNA制備物，其含有少于約0. 0001%，和最優(yōu)選 地少于0.00005% (< 0.00005%，即< 0.00005mg每IOOmg質(zhì)粒DNA)的蛋白質(zhì)污染物。
“藥物級質(zhì)粒DNA”還可以指這樣的DNA制備物，其含有少于0. lEU/mg的內(nèi)毒素。
“藥物級質(zhì)粒DNA”在本文中指這樣的DNA制備物，其優(yōu)選地主要為環(huán)狀形式，更準 確地說，是指含有多于80 %，85 %，90 %，95 %，或多于99 %的閉合環(huán)狀形式質(zhì)粒DNA的DNA。
“T形管”(T-tube)是指T形的管道構(gòu)造，其中，該構(gòu)造中形成的一條單獨管道構(gòu) 成T形，或者多于一個的管道共同形成此種構(gòu)造。T形管具有三個臂，以及三個臂結(jié)合的中 心區(qū)域。T形管可以用來混合成分，因為兩種流體可以分別流入T的一個臂，在中心區(qū)域匯 合，并從第三臂流出。當該流體合并時就發(fā)生混合。
“湍流”是指流體顆粒在主流方向的橫向上所作的不規(guī)則的隨機運動，其中給定點 上的速度的大小和方向無規(guī)律地變化。
“粘彈性”指兼具粘性和彈性的流體。
發(fā)明詳述
本發(fā)明是基于高產(chǎn)率地生產(chǎn)藥物級質(zhì)粒DNA的可放大方法的發(fā)現(xiàn)。具體地，本發(fā) 明是基于使用連續(xù)堿裂解宿主細胞產(chǎn)生和分離高度純化的質(zhì)粒DNA的方法的發(fā)現(xiàn)。
作為第一步，用質(zhì)粒DNA接種，即轉(zhuǎn)化指數(shù)生長期中的宿主細胞，并將其在含有抗 生素例如四環(huán)素的LB培養(yǎng)基平板上劃線。然后將平板上的單菌落分別接種到單獨的無菌 塑料錐形瓶(Erlenmeyer)中添加了合適的抗生素四環(huán)素的20ml LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)器 中37°C下培養(yǎng)12-16小時。將這些培養(yǎng)物中的一個接種到加有200ml滅菌的LB培養(yǎng)基的 2L錐形瓶中。將其在37°C、200rpm的振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)，并用來接種兩個5L的錐形瓶，將 其在37°C、200rpm的振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)，并在5小時后，0D600nm = 2單位的指數(shù)中期，用 其來接種發(fā)酵容器。
宿主細胞培養(yǎng)和接種是本領(lǐng)域熟知的。一般來說，宿主細胞被培養(yǎng)，直至其達到高 的生物量且細胞處于指數(shù)生長中，以獲得大量的質(zhì)粒DNA?？梢允褂脙煞N不同的方法，即分 批O^atch)和補料分批(fed-batch)發(fā)酵。
分批發(fā)酵使得生長速率可以通過調(diào)節(jié)生長溫度和所用碳源而得以控制。如本文中 所用的，術(shù)語“分批發(fā)酵”是指這樣的細胞培養(yǎng)過程，其中在接種時，所有細胞生長和細胞中 所含質(zhì)粒的生產(chǎn)所需的營養(yǎng)物在發(fā)酵容器中都是大大過量的(例如10倍于現(xiàn)有技術(shù)的濃 度的營養(yǎng)物)，因此在滅菌后加料(post-sterilization additions)之后再不需要對該無 菌容器加料，也不需要復(fù)雜的補料模式和策略。
根據(jù)本發(fā)明，另外一種有用的發(fā)酵是補料分批發(fā)酵，其中通過在細胞生長過程中 對培養(yǎng)物添加營養(yǎng)物而控制細胞生長速度。如本文中使用的，“補料分批發(fā)酵”是指這樣的 細胞培養(yǎng)過程，其中通過在發(fā)酵過程中在仔細監(jiān)控下向培養(yǎng)物添加代謝物，來控制生長速 率。根據(jù)本發(fā)明，補料分批發(fā)酵可以使細胞培養(yǎng)物達到比分批發(fā)酵更高的生物量。
下面描述發(fā)酵過程的示例和示例性的補料速率，其用于50L的制備。但是，其他容 量，例如10L，50L，或高于500L，都可以使用下面描述的示例性補料速率來進行，取決于設(shè) 備的規(guī)模。
高度營養(yǎng)強化的分批培養(yǎng)基和補料分批培養(yǎng)基發(fā)酵適合于產(chǎn)生高細胞密度的培 養(yǎng)物，以使特定的質(zhì)粒產(chǎn)率最大化，并使得還在指數(shù)生長期中便回收高的生物量稱為可能。
補料分批發(fā)酵使用葡萄糖或甘油作為碳源。發(fā)酵以分批模式進行，至少初始的 碳底物(葡萄糖)被耗盡。這個點表現(xiàn)為溶氧(DO)急劇上升，并可通過上述情況發(fā)生后 立即取樣作葡萄糖分析來確認。然后，事先準備好的補料培養(yǎng)基泵開始工作。泵的速率 由Curless等(Bioeng. 38 1082-1090，1991)的模型來確定，上述文獻的全文被引入本 文供參考。該模型被設(shè)計來幫助控制補料分批發(fā)酵的補料階段。在開始的分批過程中， 非抑制性濃度的底物被以其最大比生長速率生長的細胞所消耗，使得接種后生物量水平 快速地提高。由于有毒的代謝物的積累(Fieschio et al. , Fermentation Technology Using RecombinantMicroorganisms. “ In Biotechnology, eds. H. J. Rhem and G. Reed. Weinheim :VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b : 117-140，1989)該培養(yǎng)物不能無限地以該速 率生長。為了實現(xiàn)持續(xù)的對數(shù)生長，該模型根據(jù)操作者的設(shè)定，計算生長限制性碳底物的基 于時間的補料速率，在不需要反饋控制的條件下，達到生長的補料分批階段。該速率選擇為 這樣的水平，其不引起抑制性代謝物的積累，又足以提供高的生物量。
一般而言，在應(yīng)用分批發(fā)酵高水平(例如，比現(xiàn)有技術(shù)高4倍的濃度)的前體存在 于富集的分批培養(yǎng)基中。尤其是分批培養(yǎng)基中的酵母提取物的量從5g/l (as in LB培養(yǎng) 基)富集到20g/l，這樣就提供了極大量的生長因子和核酸前體。培養(yǎng)基還添加了硫酸銨 (5g/l)作為有機氮源。補料分批發(fā)酵設(shè)計為在補料過程中添加前體(硫酸銨形式的有機氮 源)，以避免對質(zhì)粒的質(zhì)量產(chǎn)生有害影響。
根據(jù)本發(fā)明的方法的一個重要方面是細胞裂解。因此，本發(fā)明包括生產(chǎn)和分離高 度純化的質(zhì)粒DNA的方法，其包括細胞裂解步驟，其中存在(a)湍流裝置，用于快速混合細 胞懸液(圖1中的溶液1)和裂解細胞的溶液(圖1中的溶液2)；和(b)層流裝置，使得(a) 中形成的混合物可以在沒有顯著擾動的狀態(tài)下溫育，其中(a)中形成的混合物從湍流裝置 中流入層流裝置中。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，該機構(gòu)還可包括加入第二溶液(圖1中的溶液3)的 裝置，所述第二溶液中和上述裂解溶液；其中(b)中溫育的混合物從所述層流裝置流入該 加入第二溶液的裝置。
在另一個實施方式中，該機構(gòu)可用于從細胞中分離質(zhì)粒DNA的方法，該方法包括 (a)在所述湍流裝置中將細胞與堿性裂解溶液混合；和(b)加入酸性溶液來中和所述堿性 裂解溶液。
盡管目前有多種方法用于裂解細菌細胞，但這些方法都沒有涉及流體的粘彈性質(zhì) 和混合步驟中牽涉的剪切力所引起的問題。本發(fā)明的一個目的是，使用T形管，在粘彈性流 體出現(xiàn)之前，均勻地且非?？焖俚鼗旌霞毎麘乙?溶液1)和堿溶液(溶液2、。因此，根據(jù) 本發(fā)明的連續(xù)裂解提供了限制剪切力的重要優(yōu)點。T形管一般具有小直徑的管道，通常直徑 小于1cm，優(yōu)選2到8mm左右，更優(yōu)選6mm左右，以增加被混合溶液的接觸時間，但該方法并 沒有利用流過該管而導(dǎo)致的混合。下面的表1顯示了湍流裝置和層流裝置的Bla，Bib, B2 參數(shù)的變化，以及它們的如圖1所示的相應(yīng)流速Si、S2和S3。
表 權(quán)利要求
1.分離自細胞的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其包含少于約0.01 %的染色體DNA或基因組DNA。
2.權(quán)利要求1的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其包含少于約0.001 %的染色體DNA或基因組 DNA。
3.權(quán)利要求1或2的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其包含少于約0.0001%的染色體DNA或 基因組DNA。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其包含少于約0.00008%的染色 體DNA或基因組DNA。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其包含少于約0.01 %的宿主細胞 RNA污染物。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其包含少于約0.0001%的宿主細 胞蛋白質(zhì)污染物。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其基本上不含有可測量到的內(nèi)毒 素污染物。
8.權(quán)利要求7的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其含有少于0.lEU/mg的內(nèi)毒素。
9.權(quán)利要求1-8中任一項所要求保護的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，包括基本上為超螺旋 形式的質(zhì)粒DNA。
10.權(quán)利要求1-9中任一項所要求保護的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，包括大約或多于 99%的閉環(huán)形式的質(zhì)粒DNA。
11.權(quán)利要求1-10中任一項所要求保護的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其中所述質(zhì)粒包括 條件性復(fù)制起點。
12.權(quán)利要求1-10中任一項所要求保護的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其中所述質(zhì)粒編碼 成纖維細胞生長因子。
13.權(quán)利要求1-12中任一項所要求保護的藥物級質(zhì)粒DNA組合物，其中所述質(zhì)粒是名 為NVlFGF的質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明提供連續(xù)的堿裂解細菌懸浮液以收集pDNA的方法。它還給定了可選的附加純化步驟，包括裂解物過濾，陰離子交換色譜，三螺旋親和色譜和疏水相互作用色譜。這些可選的純化步驟可以和所述連續(xù)裂解結(jié)合以提供基本上不含gDNA，RNA，蛋白質(zhì)，內(nèi)毒素和其他污染物的高度純化的pDNA產(chǎn)物。
文檔編號C12N15/11GK102031258SQ20101050344
公開日2011年4月27日 申請日期2005年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者尼古拉斯·梅斯特拉里, 弗朗西斯·布蘭切, 戴維·蓋拉克, 蒂瑞·吉爾明, 邁克爾·庫代爾 申請人:艾文蒂斯藥品公司