專利名稱：一種適于水稻品種真實性鑒定的issr指紋圖譜構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及種質資源品種真實性鑒定技術，是一種適于水稻品種真實性鑒定的 ISSR指紋圖譜構建方法。
背景技術：
水稻是重要的糧食作物，我國是世界上最大的雜交水稻種子生產(chǎn)國和消費國，具 有龐大的雜交水稻種子市場。水稻種子的真實性和純度是衡量種子質量的重要指標，直接 影響農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質和農(nóng)民的利益。生產(chǎn)上如何快速、準確、簡便、經(jīng)濟地鑒定雜交水稻 種子真實性是一個突出的問題。傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定法依賴于品種表型差異，而形態(tài)性狀的表 現(xiàn)受環(huán)境影響較大，且形態(tài)鑒定法工作量大、鑒定周期長、成本高、受季節(jié)限制，對種子營銷 工作造成不利影響。同工酶和種子貯藏蛋白多態(tài)性不夠豐富，且同工酶有組織和器官特異 性、穩(wěn)定性差。分子標記技術具有多態(tài)性好、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，已開始廣泛應 用于作物品種鑒定與純度檢測中。目前，應用較多的是SSR、RAPD、RFLP和AFLP等分子標 記。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)即簡單序列重復間擴增，是由加拿大蒙特利爾 大學Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種分子標記技術，其基本原理就是在SSR的3’或 5’端錨定1-4個堿基作引物，對兩側具有反向排列SSR的一段序列進行擴增，而不是擴增 SSR本身。錨定堿基避免了 SSR在基因組上的滑動，因而大大提高了 PCR擴增的穩(wěn)定性和 可重復性。ISSR分子標記技術兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的優(yōu)點，與SSR相比， ISSR不需要預先獲知序列信息而使成本降低，且多態(tài)性更豐富；與RAPD相比，ISSR重復性 高，穩(wěn)定性好，同時具備RAPD的簡便、易操作等特點；與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本 較低、DNA用量小、安全性較高。目前，ISSR標記技術在植物種質資源收集和鑒定、遺傳多 樣性和親緣關系、基因定位、遺傳圖譜構建及分子標記輔助選擇等研究中已有廣泛的應用。 在水稻中，應用ISSR分子標記分析雜交水稻的遺傳多樣性已見有報道(王金花等，2005 ；黃 光文等，2006 ；陳兆貴等，2009)，但應用ISSR分子標記技術進行水稻品種真實性鑒定的DNA 指紋圖譜構建方法尚未見報道。常規(guī)的DNA指紋圖譜構建方法大都選擇多條引物擴增譜帶中有代表性的部分條 帶，以“0” “1”矩陣來構建品種或種質資源的指紋圖譜，不適于生產(chǎn)上農(nóng)作物品種真實性簡 便、快速分子標記鑒定。本發(fā)明以單一引物的擴增譜帶構建指紋圖譜表，并引入帶型編號和 擴增譜帶位點編號信息，是一種開放性的，可以隨品種數(shù)目增加和更新?lián)Q代而不斷擴充和 更新的，由一系列若干個指紋圖譜表構成的DNA指紋圖譜構建方法。該方法使品種鑒定過 程中DNA指紋圖譜檢索更簡便快速，更適合在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣應用。本發(fā)明研究利用ISSR分子標記成功構建水稻品種的ISSR指紋圖譜，為ISSR分子 標記技術更廣泛地用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中水稻品種真實性鑒定打下良好的基礎。該方法不僅適合 于水稻品種真實性的ISSR分子標記鑒定中DNA指紋圖譜的構建，也適合于其他農(nóng)作物和其 他分子標記的指紋圖譜構建。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了推進DNA分子標記技術在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中作物種子真實性 鑒定上的廣泛應用與推廣，提供一種鑒定操作簡便快捷、重復性和穩(wěn)定性較好的適于水稻 品種真實性鑒定的ISSR指紋圖譜構建方法。適于水稻品種真實性鑒定的ISSR指紋圖譜構建方法包括DNA提取、ISSR-PCR擴 增及電泳檢測、DNA指紋圖譜構建等內(nèi)容。具體包括以下步驟(I)DNA 提取以不同水稻品種種子為材料，于苗期取幼嫩葉片采用改進的CTAB法提取DNA，取 部分DNA溶液測其濃度，稀釋至20ng/ μ L，于-20°C保存?zhèn)溆茫?(2) ISSR-PCR擴增及電泳檢測采用25 μ L反應體系，Mg2+濃度為2. 5mmol/L,引物濃度為0. 2 μ mol/L, dNTPs的 濃度為0. 2mmol/L, DNA用量為40ng，Taq DNA聚合酶的用量為IU ；PCR擴增程序條件為94°C預變性5min，94°C變性45s，50-56°C退火45s，72°C延伸 90s, 40個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C保存；用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，Gel-Red染色，檢測ISSR-PCR擴增產(chǎn)物，在紫外燈下拍眧.
/、、、 (3) DNA指紋圖譜構建根據(jù)每條引物呈現(xiàn)的條帶信息建立指紋圖譜以水稻品種編號和擴增譜帶帶型為 縱列，以每條譜帶的位點編號為橫行，在每一縱橫交結處，有擴增譜帶用“1”表示，沒有擴增 譜帶用“0”表示，分別制得每條引物對不同品種的DNA指紋圖譜表，以24個水稻品種為例， 引物UBC 815對24個水稻品種構建的指紋圖譜表為多態(tài)性條帶編號
權利要求
一種適于水稻品種真實性鑒定的ISSR指紋圖譜構建方法，該方法包括DNA提取、ISSR PCR擴增及電泳檢測、DNA指紋圖譜構建等內(nèi)容。具體包括以下步驟(1)DNA提取以不同水稻品種種子為材料，于苗期取幼嫩葉片采用改進的CTAB法提取DNA，取部分DNA溶液測其濃度，稀釋至20ng/μL，于 20℃保存?zhèn)溆茫?2)ISSR PCR擴增及電泳檢測采用25μL反應體系，Mg2+濃度為2.5mmol/L，引物濃度為0.2μmol/L，dNTPs的濃度為0.2mmol/L，DNA用量為40ng，Taq DNA聚合酶的用量為1U；PCR擴增程序條件為94℃預變性5min，94℃變性45s，50 56℃退火45s，72℃延伸90s，40個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存；用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，Gel Red染色，檢測ISSR PCR擴增產(chǎn)物，在紫外燈下拍照；(3)DNA指紋圖譜構建根據(jù)每條引物呈現(xiàn)的條帶信息建立指紋圖譜以水稻品種編號和擴增譜帶帶型為縱列，以每條譜帶的位點編號為橫行，在每一縱橫交結處，有擴增譜帶用“1”表示，沒有擴增譜帶用“0”表示，分別制得每條引物對不同品種的DNA指紋圖譜表，以24個水稻品種為例，引物UBC 815對24個水稻品種構建的指紋圖譜表為引物UBC 900對24個水稻品種構建的指紋圖譜表為(4)利用構建的DNA指紋圖譜進行品種真實性鑒定將待鑒定的水稻品種樣品在上述條件下所建立的指紋圖譜與已構建的DNA指紋圖譜相比較，與所建DNA指紋圖譜不同的即為假種子。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述ISSR-PCR擴增中采用的引物是UBC 815 和 UBC 900。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述DNA指紋圖譜是以水稻品種編號、擴 增譜帶帶型編號、每條譜帶位點編號及“1” “0”陣列為基本信息，便于檢索和鑒定。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于每個DNA指紋圖譜表是以單條ISSR引物 的擴增譜帶信息構建的。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于DNA指紋圖譜中，每個水稻品種都有其特異的DNA指紋，能將供試品種逐個鑒別開來。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適于水稻品種真實性鑒定的ISSR指紋圖譜構建方法，提供一種快速、準確的水稻品種的ISSR指紋圖譜構建方法及其應用。該方法包括以下步驟用改進的CTAB法提取水稻幼苗DNA；以幼苗DNA為模板進行ISSR-PCR擴增；對PCR產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測并在紫外光下拍照；構建水稻品種的DNA指紋圖譜，用于水稻品種真實性鑒定。本發(fā)明DNA指紋圖譜是以水稻品種編號、擴增譜帶帶型、每條譜帶的位點編號及“0”“1”陣列為基本信息，該方法具有操作簡單、直觀實用等特點，可以促進ISSR分子標記技術在準確、快速、簡便的水稻品種真實性鑒定中更廣泛地應用。
文檔編號C12Q1/68GK101956016SQ20101050450
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權日2010年10月12日
發(fā)明者關亞靜, 朱巖芳, 祝水金, 胡晉 申請人:浙江大學