專利名稱：一種高效轉(zhuǎn)化棘白菌素b的基因工程菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別涉及一種高效轉(zhuǎn)化棘白菌素B的基因工程菌及其制備方法。
背景技術(shù)：
在過去的二十多年時(shí)間里嚴(yán)重危害人類生命健康的真菌感染，無論是在死亡率以及感染的種類方面都在不斷的增加，特別是在免疫抑制病人中。目前用于治療臨床深部真菌感染的主要藥物是唑類抗真菌藥物和兩性霉素B，雖然這兩類藥物對(duì)控制臨床深部真菌感染起到了重要的作用，但由于這些藥物由于選擇性差、耐藥真菌的出現(xiàn)、對(duì)諸如曲霉和白念珠菌等真菌的敏感性不強(qiáng)等不足，使深部真菌感染疾病的死亡率居高不下。棘白菌素(Echinocandin)類抗真菌抗生素是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一組天然產(chǎn)物，由相似的環(huán)狀多肽核心和不同的脂肪酸側(cè)鏈組成，是臨床治療系統(tǒng)性真菌感染的重要藥物。這類抗生素能夠非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制真菌細(xì)胞壁β-1，3-葡聚糖合成酶的活性。其作用機(jī)制獨(dú)特，毒副作用低，且對(duì)一些唑類和兩性霉素B耐藥的真菌具有很強(qiáng)的抗菌活性，尤其是對(duì)諸如曲霉和白念珠菌等呈現(xiàn)上升趨勢(shì)的真菌具有獨(dú)特的療效，是目前臨床治療深部真菌感染的“王牌抗生素”。棘白菌素類抗生素主要有三種類型B，C和D，其中棘白菌素 B (Echinocandin B, ECB)是最主要的類型。ECB，是于1974年NyfelerR.等人發(fā)現(xiàn)由曲霉菌屬Aspergilus nidulans和Aspergilu rugulosus發(fā)酵產(chǎn)生的，但由于?；鶄?cè)鏈的存在， 使其具有一定的溶血毒性。以ECB為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，可以得到一些具有臨床應(yīng)用前景的化合物，如西洛芬凈(Cilofungin)、卡帕芬凈(Caspofungin，MK991)、米卡芬凈 (Micafungin, FK463)、阿尼芬凈(Anidulafungin, LY303366)。西洛芬凈由于毒性和劑型問題終止了研究開發(fā)，但后三者已分別先后在美國(2001年)、日本(2002年)、美國(2006 年)首次上市。對(duì)ECB進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，用戊氧-三苯羧基取代亞油酰基側(cè)鏈即可得到阿尼芬凈，而其中ECB的去?；雌淠负说闹苽涫顷P(guān)鍵步驟。目前對(duì)于ECB母核的制備方法中，因化學(xué)制備成本較高，因此主要是通過微生物轉(zhuǎn)化——猶他游動(dòng)放線菌NRRL12052發(fā)酵產(chǎn)生的去酰化酶對(duì)ECB進(jìn)行催化的方式得到。微生物轉(zhuǎn)化具有以下優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物單一、 高度的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和對(duì)映體選擇性、易于純化、不污染環(huán)境且能完成一些化學(xué)合成難以進(jìn)行的反應(yīng)。但是猶他游動(dòng)放線菌野生菌株的ECB去?；傅漠a(chǎn)量很低，對(duì)ECB 的生物轉(zhuǎn)化效率不高。
權(quán)利要求
1.一種高效轉(zhuǎn)化棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于，其是在猶他游動(dòng)放線菌 Actinoplanes utahensis野生菌株的基因組中整合有棘白菌素B去?；富虻谋磉_(dá)盒的工程菌。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的棘白菌素B去?；富虻谋磉_(dá)盒依次含有啟動(dòng)子、棘白菌素B去?；富蚓幋a區(qū)和終止子。
3.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的表達(dá)盒在猶他游動(dòng)放線菌 Actinoplanes utahensis野生菌株的基因組中的整合位點(diǎn)是attB位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的猶他游動(dòng)放線菌 Actinoplanes utahensis 野生菌株是猶他游動(dòng)放線菌Actinoplanesutahensis NRRL 12052。
5.一種重組載體，其特征在于，其在多克隆位點(diǎn)插入有棘白菌素B去?；富虻牡谋磉_(dá)盒。
6.如權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體的骨架是pSET152。
7.一種轉(zhuǎn)化子，其特征在于，其含有權(quán)利要求5或6所述的重組載體。
8.一種制備如權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的高效轉(zhuǎn)化棘白菌素B的基因工程菌的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化子與猶他游動(dòng)放線菌Actinoplanes utahensis接合，挑選接合子即得。
9.一種制備棘白菌素B母核的方法，其特征在于，包括采用如權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的基因工程菌，以靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化棘白菌素B為棘白菌素B母核。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法包括將如權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的基因工程菌置于緩沖溶液中，以棘白菌素B為前體物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，從所得轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中即可分離獲得ECB母核。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效轉(zhuǎn)化棘白菌素B的基因工程菌及其制備方法。該基因工程菌是在猶他游動(dòng)放線菌Actinoplanes utahensis野生菌株的基因組中整合有棘白菌素B去?；富虻谋磉_(dá)盒的工程菌。通過棘白菌素B轉(zhuǎn)化驗(yàn)證，該基因工程菌的轉(zhuǎn)化效率較野生菌株提高1.8倍。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102443560SQ201010505198
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者劉愛娟, 李繼安, 邵雷, 陳代杰, 陳繼業(yè) 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院