專利名稱：一種草魚呼腸孤病毒株的s7基因、編碼的重組蛋白及其獲取方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種草魚呼腸孤病毒株的S7基因、編碼 的重組蛋白及其獲取方法和應用。
背景技術(shù)：
草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)隸屬呼腸孤病毒科(Reoviridae) 水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus，ARV) (Franki，1991)，是我國從魚類分離到的第一個 病毒，直徑約70nm，球形顆粒，無囊膜，具雙層衣殼，含有11個雙鏈RNA片段，總分子量 15.46X 103kD。根據(jù)其基因片段大小，將基因組片段按分子量分為3個組，分別命名為 L1-L3，M4-M6，S7-S11。這11個雙鏈RNA片段可以編碼12種多肽，其中有7種結(jié)構(gòu)多肽， 分別命名為VP1-VP7，其余為非結(jié)構(gòu)性多肽，命名為NS1-NS5。由于病毒基因組是分節(jié)段 的，所以會造成不同病毒株的復雜性和高度可變性，草魚出血病病毒目前已經(jīng)報道了 10多 個分離株，包括 GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、H962、ZV-8802、 GCHV-854 等。草魚呼腸孤病毒主要侵染草魚的肝臟、心臟、肌肉、腎臟、脾、鰓、腸道等組織的細 胞，引起草魚出血病，導致化學藥物難于達到治療效果。當水溫在27°C以上時為該病的流行 高峰期，可達80%以上的死亡率，嚴重地威脅草魚的養(yǎng)殖生產(chǎn)。在草魚出血病的免疫預防 中，研究最早并應用最廣的是草魚出血病組織滅活疫苗，但是須含有足夠的病毒才能引起 免疫應答，而大劑量又可引起局部或全身的反應，并且所獲得的免疫性一般是短暫的，須激 發(fā)注射，且疫苗研制受病魚組織來源的限制，難于大批量生產(chǎn)。與其相比，基因疫苗有一些 明顯優(yōu)點，其抗原蛋白成份單一明確，能夠刺激機體產(chǎn)生較強和較持久的免疫應答，并可規(guī) 模化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的草魚出血病滅活疫苗中存在的劑量小不足以引起 免疫應答，劑量大又容易引起局部或全身反應，獲得的免疫性多為短暫，需多次注射，且原 材料來源受限等問題，提供一種可作為基因工程疫苗的草魚呼腸孤病毒株的S7基因。本發(fā)明另一目的在于提供上述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白。本發(fā)明另一目的在于提供含有上述草魚呼腸孤病毒株的S7基因的重組表達載 體。本發(fā)明另一目的在于提供含有上述草魚呼腸孤病毒株的S7基因的重組菌株。本發(fā)明另一目的在于提供上述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白的獲 取方法。本發(fā)明還有一個目的在于提供上述草魚呼腸孤病毒株的S7基因及其編碼的重組 蛋白的應用。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)本發(fā)明所選擇的草魚呼腸孤病毒株GCRVGD108，采自廣東省水產(chǎn)養(yǎng)殖場。將從病 魚體上分離的病毒感染草魚成纖維細胞，提取病毒RNA，以其為模板進行RT-PCR擴增，得 到1500bp的特異條帶，切膠回收目的條帶并連接到PMD19-T載體，并連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (E. coli) DH5 α，挑選陽性重組克隆。本發(fā)明通過對以上重組克隆進行序列測定，得到草魚呼腸孤病毒株GCRVGD108的 S7基因的序列，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，并通過基因工程方法表達出重組蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。新基因編碼512個氨基酸，等電點5. 08，分子量為 56.03kD。本發(fā)明通過設計了一對含有限制性內(nèi)切酶酶切位點的引物，將草魚呼腸孤病毒株 GCRVGD108的S7基因用PCR方法從T載體上擴增出來，克隆到原核表達載體pET30c上，構(gòu) 建原核表達質(zhì)粒PET-S7并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)。此表達載體(pET_S7)以T7為 啟動子，重組蛋白以包涵體的形式在大腸桿菌中表達，載體pET30c上有6XHis結(jié)構(gòu)，便于 利用固定化金屬配體親和層析進行純化。通過對培養(yǎng)時間，誘導時間，溫度等條件的摸索和 優(yōu)化，S7融合蛋白的表達量可以達到10mg/L。本發(fā)明還優(yōu)化了 S7蛋白的純化條件，表達產(chǎn)物的超聲裂解液經(jīng)Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析，得到純度較高的融合蛋白。本發(fā)明還通過間接Elisa法檢測重組蛋白與草魚抗GCRVGD108株抗體的結(jié)合反 應，顯示該蛋白具有較強的抗原性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下效果本發(fā)明獲得的重組蛋白對草魚出血病具有較好的免疫效果。健康草魚經(jīng)S7重組 蛋白免疫后，用草魚呼腸孤病毒株GCRV-GD108進行攻毒試驗，相對成活率達70%以上。


圖1為RNA提取結(jié)果，其中，1為GCRVGD108的RNA條帶，M為markerIII ；圖2為RT-PCR擴增結(jié)果，其中，1為GCRV⑶108的RT-PCR產(chǎn)物，M為marker III ；圖3為pET-S7表達載體構(gòu)建及酶切鑒定圖，其中，1為pET30c_S7，2為pET-S7BamH I 單酶切，3 為 pET30c-S7Xho I 單酶切，4 為 pET_S7BamH I/Xho I 雙酶切；圖4為誘導表達圖，其中，M為低分子量標準蛋白marker，1為空載pET ；2為未誘 導pET-S7 ；3為誘導后PET-S7 ；4為pET_S7上清；5為pET_S7沉淀；圖5為重組蛋白過柱純化圖，其中，M為低分子量標準蛋白marker ；1為pET空質(zhì) 粒；2為pET-S7未誘導；3為pET-S7誘導超聲破碎上清；4為pET_S7誘導超聲破碎沉淀；5 為蛋白過柱流通液；6為Elute Buffer流通液。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1草魚呼腸孤病毒株GCRVGD108RNA的提取和RT-PCR擴增病毒RNA的提取和cDNA的合成草魚成纖維細胞接種病毒7d后，細胞反復凍融2 3次，4°C，4000rpm,離心30min，取上清再以30，OOOrpm超高速離心沉淀病毒，然后用 Trizol試劑提取病毒dsRNA，步驟參見Trizol說明書。提取的dsRNA經(jīng)SDS-PAGE電泳檢 測可見清晰的11條帶。利用“anchor primer”反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Maan et al，2007)，然后 利用S7特異引物進行擴增。 每20 μ 1 PCR反應體系中加入3 μ 1 cDNA單鏈作為模板，PCR擴增，電泳檢測，發(fā) 現(xiàn)在約1540bp處出現(xiàn)預期的特異性擴增帶，回收此帶(圖1 2)。PCR反應體系
權(quán)利要求
一種草魚呼腸孤病毒株的S7基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.權(quán)利要求1所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。
3.一種重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是將權(quán)利要求1所述草魚呼腸孤 病毒株的S7基因克隆到原核表達載體pET30c上得到。
4.一種重組株，其特征在于所述重組株是將權(quán)利要求3所述重組表達載體轉(zhuǎn)化至大腸 桿菌BL21中得到。
5.權(quán)利要求2所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白的獲取方法，其特征在 于包括如下步驟將草魚呼腸孤病毒株的S7基因克隆到原核表達載體pET30c上，得到重組 表達載體PET-S7，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，經(jīng)誘導表達，得到草魚呼腸孤病毒株的S7基因 編碼的重組蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白的獲取方法，其特 征在于所述誘導為IPTG誘導。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白的獲取方法，其特 征在于所述誘導表達后，所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白以包涵體的形 式表達。
8.權(quán)利 要求1所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因在防治草魚出血病中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因的應用，其特征在于所述草魚呼腸 孤病毒株的S7基因作為基因疫苗，通過重組表達獲得重組蛋白，用于防治草魚出血病。
10.權(quán)利要求2所述草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白在防治草魚出血病中 的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種草魚呼腸孤病毒株的S7基因、編碼的重組蛋白及其獲取方法和應用。本發(fā)明草魚呼腸孤病毒株的S7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，該核苷酸序列編碼的重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。將本發(fā)明草魚呼腸孤病毒株的S7基因克隆到原核表達載體上，構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)誘導表達，所得蛋白為草魚呼腸孤病毒株的S7基因編碼的重組蛋白。該蛋白對草魚出血病具有較好的免疫保護作用。
文檔編號C12N15/46GK101979581SQ20101050586
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者葉星, 江小燕, 田園園, 白俊杰, 白岳強, 遲妍妍, 鄧國成 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所