專利名稱：利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
天然蝦青素(3，3' _ 二羥基_4，4' _ 二酮基_β，β'-胡蘿卜素，C4tlH52O4)是 一種脂溶性的次生類胡蘿卜素，是目前自然界中已發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑。有研究顯示蝦青 素的抗氧化活性顯著高于β-胡蘿卜素(10倍以上)、花青素0PC(17倍)玉米黃素、角黃 質(zhì)、維生素C和維生素E(550倍)等常見抗氧化物質(zhì)。超強(qiáng)的抗氧化活性賦予了蝦青素突 出的生理功能，如提高動物免疫力、抑制腫瘤、清除自由基和活性氧等，不僅可以用作珍貴 水產(chǎn)動物養(yǎng)殖的餌料添加劑、人類的食品添加劑，在藥品、化妝品和高級營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域 也具有非常廣闊的應(yīng)用潛力。目前國際上已具備的蝦青素生產(chǎn)工藝有化學(xué)合成和生物提取 兩種，但化學(xué)合成的蝦青素在結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)用和安全性等方面均較天然蝦青素遜色。動物 和人體實驗的結(jié)果已經(jīng)證明，天然蝦青素?zé)o任何毒副作用，對人體絕對安全。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種雙鞭毛單細(xì)胞綠藻，在多種脅迫 條件下，如強(qiáng)光、高溫、營養(yǎng)鹽(氮、磷)饑餓、高鹽等，能夠迅速合成并大量積累蝦青素，其 積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于從水產(chǎn)品廢棄物(蝦、蟹等甲殼)中提取和利用紅發(fā)夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青 素的產(chǎn)量，因此被公認(rèn)是目前自然界中生產(chǎn)天然蝦青素最理想的工具。美國FDA認(rèn)為從雨 生紅球藻中提取的天然蝦青素使用安全可靠，對動物和人類使用過程中絕對不產(chǎn)生任何毒 副作用，已經(jīng)通過了富含蝦青素的雨生紅球藻安全性論證，并明文禁止化學(xué)合成的蝦青素 進(jìn)入保健品市場。國外已于上世紀(jì)90年代末在美國和瑞典的少數(shù)幾家大公司實現(xiàn)了利用 雨生紅球藻大規(guī)模生產(chǎn)天然蝦青素，并在技術(shù)上形成了壟斷，從而導(dǎo)致天然蝦青素的國際 市場價格居高不下。國內(nèi)對利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的研究始于本世紀(jì)初，目前還處于 實驗室階段，至今尚未具備規(guī)模化生產(chǎn)的相關(guān)技術(shù)和專利，同時存在許多難以解決的技術(shù) 問題。過去關(guān)于刺激雨生紅球藻積累蝦青素的誘導(dǎo)因子研究大多集中在物理因子(如 紫外線、X、Y射線、激光輻射等)和化學(xué)因子(如鹽脅迫、重金屬離子、亞硝基胍、疊氮化合 物等)，同上述誘導(dǎo)因子相比較，植物激素具有用量小、效益高、殘毒少等優(yōu)勢。為一種抗逆 激素，茉莉酸(JA)對植物生長發(fā)育和逆境條件下的抗性起著重要調(diào)節(jié)作用，而雨生紅球藻 正是在逆境脅迫條件下才能大量積累蝦青素。外源應(yīng)用茉莉酸能夠激發(fā)植物防御基因的表 達(dá)，誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御，產(chǎn)生與機(jī)械損傷和昆蟲取食相似的效果，并且在作用過程中與其 它植物激素如脫落酸、水楊酸、乙烯等有著密切聯(lián)系，因此茉莉酸應(yīng)該會促進(jìn)雨生紅球藻大 量積累蝦青素。目前，國內(nèi)市場上已經(jīng)有一些生產(chǎn)蝦青素的相關(guān)專利技術(shù)，如“從甲殼質(zhì)、殼聚糖 生產(chǎn)廢水中回收蝦青素和蛋白質(zhì)的方法”(CN200510047267. 7)，主要是從甲殼質(zhì)、殼聚糖生 產(chǎn)廢水中回收蝦青素，雖然能變廢為寶，但是蝦青素的提取效率較低?！耙环N培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法(CN02138827.X)公開了一種培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，包 括培養(yǎng)基配方、一步法生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)基的循環(huán)使用和用二氧化碳調(diào)節(jié)培養(yǎng)液PH值誘導(dǎo)紅 球藻孢子的形成及蝦青素積累的方法。寧波大學(xué)的“大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素 的裝置及其方法”(200610154678. 0)公開了一種大規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉(zhuǎn)化蝦青素的裝 置及方法，整個培養(yǎng)裝置由設(shè)置在固定架上的光生物反應(yīng)器系統(tǒng)、充氣裝置、培養(yǎng)液灌輸裝 置和靜細(xì)胞收集裝置組成，固定架上設(shè)置浮沉控制裝置；中山大學(xué)的“光生物反應(yīng)器促進(jìn)雨 生紅球藻生長增殖及調(diào)控蝦青素合成和積累的方法”(CN02134387. X)，涉及幾種可調(diào)控的 全天候封閉式大規(guī)模運(yùn)行系統(tǒng)光生物反應(yīng)器培養(yǎng)和促進(jìn)雨生紅球藻生長增殖及提高種群 密度和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物蝦青素合成和積累的方法。“產(chǎn)蝦青素的藻類和酵母混合 培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法”(CN03105314. 9)，公開了一種產(chǎn)蝦青素的藻類和酵母混合培 養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法，屬于生物法生產(chǎn)蝦青素技術(shù)。該方法是在裝有特定培養(yǎng)基的反 應(yīng)器內(nèi)，同時接種包括雨生紅球藻在內(nèi)的藻類和包括紅發(fā)夫酵母在內(nèi)的酵母進(jìn)行混合培養(yǎng) 發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素。上述相關(guān)專利技術(shù)雖然先進(jìn)，但均涉及光生物反應(yīng)器等專業(yè)設(shè)施，對設(shè)備 要求比較高，技術(shù)工藝比較復(fù)雜，操作有難度，而且費(fèi)用很高，這無疑增加了生產(chǎn)成本和技 術(shù)推廣的難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷、工藝簡單、成本低且 能顯著提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素效率的利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法。 其具體的技術(shù)方案為—種利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于采用如下步驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞到對數(shù)生長期，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/ L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸終濃度為0. 95 1. 05mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻液在25 28°C、光強(qiáng)4500 50001x、日光燈連續(xù) 光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直至光學(xué)顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細(xì)胞 完全變紅，此時蝦青素產(chǎn)量達(dá)到最高。所述的利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，步驟(1)中，雨生紅球藻 采用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 21 °C，光強(qiáng)1500 18001x，光暗比為12h/12h 的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期，細(xì)胞濃度達(dá)IO8個/mL。所述的利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，茉莉酸采用SIGMA公司生 產(chǎn)的茉莉酸。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點是1、本發(fā)明簡單易行、成本低廉，原材料雨生紅球藻細(xì)胞可以按常規(guī)方法自行培養(yǎng)。2、本發(fā)明能大幅提高雨生紅球藻中蝦青素的積累效率，實驗證明，添加0.95 1.05mg/L茉莉酸處理組比空白對照組雨生紅球藻細(xì)胞完成蝦青素積累的周期縮短了 45. 5 50. 0%，蝦青素產(chǎn)量比空白對照提高了 34. 4 36. 9 %，達(dá)16. 04 16. 35mg/L藻 液。
具體實施例方式實施例1 步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 °C、 15001x光強(qiáng)、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對數(shù) 生長期，細(xì)胞濃度達(dá)IO8個/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸。先用 2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液 添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸濃度為0. 95mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻 液與空白對照組藻液同時在25°C、光強(qiáng)45001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，24天后雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達(dá) 到最高。實施例2:步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度20°C、光強(qiáng) 18001x、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長 期，細(xì)胞濃度達(dá)IO8個/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸。先用 2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液 添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸濃度為1. Omg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻液 與空白對照組藻液同時在26°C、光強(qiáng)48001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條 件下進(jìn)行培養(yǎng)，23天后雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達(dá)到 最尚。實施例3:步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度21°C、光強(qiáng) 16001x、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長 期，細(xì)胞濃度達(dá)IO8個/mL，即獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導(dǎo)雨生紅球藻積累蝦青素茉莉酸采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸。先用 2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液 添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸濃度為1. 05mg/L ；然后將上述添加了茉莉酸的藻 液與空白對照組藻液同時在28°C、光強(qiáng)50001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，22天后雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達(dá) 到最高。采用以下方法對本發(fā)明中含有茉莉酸的藻液及空白對照組藻液定期進(jìn)行顯微觀 察，具體是每天取少量藻液樣品在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞的顏色變化以及蝦青素積累情 況；然后按以下步驟對本發(fā)明含有茉莉酸的藻液及空白對照組藻液中的蝦青素含量進(jìn)行測 定①每三天各取出3ml上述兩種藻液，5000r/min離心5min，棄上清得到藻細(xì)胞沉淀；② 分別向兩種藻細(xì)胞沉淀加入5% KOH和30%甲醇破壞葉綠素5min后，5000r/min離心收集 沉淀；③在收集的沉淀中分別加入3ml 二甲亞砜，利用超聲波破壁后(3次15sec破壁/5sec 間歇，輸出功率40W)，于70°C水浴中處理lOmin，抽提至藻體發(fā)白；④然后lOOOOr/min離心 lOmin，分別取上清于490nm下測定OD值；⑤按公式C(mg/L) = (4. 5AX490XVa)/Vb計算兩種上清中的蝦青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亞砜的體積，Vb表示藻液體積。
結(jié)果表明空白對照組雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅的時間為44天，此時蝦青素含 量為11.94mg/L藻液，茉莉酸處理組比空白對照組雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅的周期縮短了 45. 5 50%，蝦青素產(chǎn)量卻比對照提高了 34. 4 36. 9%，達(dá)16. 04 16. 35mg/L藻液。
權(quán)利要求
一種利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在于采用如下步驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞到對數(shù)生長期，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成濃度為20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液添加到上述已經(jīng)培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸終濃度為0.95～1.05mg/L；然后將上述添加了茉莉酸的藻液在25～28℃、光強(qiáng)4500～5000lx、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直至光學(xué)顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素產(chǎn)量達(dá)到最高。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在 于步驟(1)中，雨生紅球藻采用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 21 °C，光強(qiáng)1500 18001x，光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至培雨生紅球藻細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生 長期，此時細(xì)胞濃度達(dá)IO8個/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，其特征在 于茉莉酸采用SIGMA公司生產(chǎn)的茉莉酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用茉莉酸促進(jìn)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法，采用如下步驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞到對數(shù)生長期，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解茉莉酸，再用超純水配制成濃度為20mg/L的茉莉酸母液，將茉莉酸母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至茉莉酸終濃度為0.95～1.05mg/L；然后將上述添加了茉莉酸的藻液在25～28℃、光強(qiáng)4500～5000lx、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復(fù)合脅迫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，直至光學(xué)顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素產(chǎn)量達(dá)到最高。本發(fā)明簡單易行、成本低廉、能大幅縮短雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅的時間，并顯著增加蝦青素產(chǎn)量，從而大大提高雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的效率。
文檔編號C12R1/89GK101974598SQ20101050595
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者葉乃好, 孟春曉, 王依濤, 羅韜, 高政權(quán) 申請人:山東理工大學(xué)