專利名稱：利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，屬于生 物技術領域。
背景技術：
蝦青素(3，3' - 二羥基_4，4' - 二酮基_β，β'-胡蘿卜素，C4tlH52O4)是一種在 醫(yī)藥、食品和飼料領域有廣泛應用前景和巨大市場潛力的類胡蘿卜素。與其它類胡蘿卜素 一樣，它有一個很長的共軛雙鍵，但該雙鍵末端還含有不飽和的α -羥基酮，這種結構使得 蝦青素比普通類胡蘿卜素具有一些特殊的生理功能。主要體現(xiàn)在兩個方面首先，具有超強 的抗氧化活性，有研究顯示蝦青素抗氧化活性顯著高于胡蘿卜素(10倍以上)、玉米黃 素、角黃質、維生素C和維生素E (550倍)等常見抗氧化物質；其次，大量研究表明，蝦青素 能大幅提高人和動物的免疫力，還能防治癌癥，有被開發(fā)成為抗腫瘤藥物的潛能。對天然蝦 青素生物學功能和藥理藥效研究表明它是安全健康的天然色素，在日本、美國、、歐盟、加拿 大已被批準為安全的人類食品添加劑，用于食品的著色、保鮮、營養(yǎng)補充及用作珍貴魚類和 甲殼類動物和家禽的飼料添加劑。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)在多種逆境脅迫條件下，如強光、高溫、 營養(yǎng)鹽(氮、磷)饑餓、高鹽等，能夠迅速合成并大量合成積累蝦青素，其積累量最高可達 藻細胞干重的4.0%，遠遠高于從水產品廢棄物(蝦蟹等甲殼)提取和利用紅發(fā)夫酵母 (Phaffiarhodoxyma)發(fā)酵生產蝦青素的產量(0. 15% -0.4% ),因此被公認是目前自然界 中生產天然蝦青素最理想的工具。過去關于刺激雨生紅球藻積累蝦青素的誘導因子研究大多集中在物理因子和 化學因子。植物激素在高等植物中有著廣泛的應用，但在微藻中的應用報道還很少， 同上述誘導因子相比較，植物激素具有用量小、效益高、殘毒少等優(yōu)勢。油菜素內酯 (Brassinosteroids,BR)能調控植物生長發(fā)育，是公認的第六大類植物激素，并且在作用過 程中與其它植物激素如脫落酸、水楊酸、乙烯等有著密切聯(lián)系，BR細胞信號通路是植物學最 前沿的領域之一，如今BR已在農業(yè)上得到應用，但在微藻上的應用卻沒有相關報道。目前，國內市場上已經(jīng)有一些生產蝦青素的相關專利技術，如寧波大學的“大 規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉化蝦青素的裝置及其方法”(200610154678.0)公開了一種大 規(guī)模培養(yǎng)雨生紅球藻和轉化蝦青素的裝置及方法，整個培養(yǎng)裝置由設置在固定架上的 光生物反應器系統(tǒng)、充氣裝置、培養(yǎng)液灌輸裝置和靜細胞收集裝置組成，固定架上設置 浮沉控制裝置；中山大學的“光生物反應器促進雨生紅球藻生長增殖及調控蝦青素合 成和積累的方法”(CN02134387.X)，涉及幾種可調控的全天候封閉式大規(guī)模運行系統(tǒng)光 生物反應器培養(yǎng)和促進雨生紅球藻生長增殖及提高種群密度和調控細胞內次生代謝產 物蝦青素合成和積累的方法?！皬募讱べ|、殼聚糖生產廢水中回收蝦青素和蛋白質的方 法”(CN200510047267. 7)，主要是從甲殼質、殼聚糖生產廢水中回收蝦青素，雖然能變廢為 寶，但是蝦青素的提取效率較低?！爱a蝦青素的藻類和酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵生產蝦青素的方法”(CN03105314. 9)，公開了一種產蝦青素的藻類和酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵生產蝦青素的方法， 屬于生物法生產蝦青素技術。該方法是在裝有特定培養(yǎng)基的反應器內，同時接種包括雨生 紅球藻在內的藻類和包括紅發(fā)夫酵母在內的酵母進行混合培養(yǎng)發(fā)酵生產蝦青素?！耙环N培 養(yǎng)雨生紅球藻生產蝦青素的方法(CN02138827.X)公開了一種培養(yǎng)雨生紅球藻生產蝦青素 的方法，包括培養(yǎng)基配方、一步法生產工藝、培養(yǎng)基的循環(huán)使用和用二氧化碳調節(jié)培養(yǎng)液PH 值誘導紅球藻孢子的形成及蝦青素積累的方法。上述相關專利技術雖然先進，但均涉及光 生物反應器等專業(yè)設施，對設備要求比較高，技術工藝比較復雜，操作有難度，而且費用很 高，這無疑增加了生產成本和技術推廣的難度。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷，技術工藝簡單易行、 廉價高效且能顯著提高雨生紅球藻生產蝦青素效率的利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快 速生產蝦青素的方法。其具體的技術方案為利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，其特征在于采用如下步 驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細胞到對數(shù)生長期，獲得誘導培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解油菜素內酯，再用二甲亞砜配制成 濃度為lmg/mL的油菜素內酯母液，將油菜素內酯母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至油 菜素內酯終濃度為4. 95 5. 05mg/L ；然后將上述添加了油菜素內酯的藻液在25 28°C、 光強4500 50001χ、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養(yǎng)，直至光學 顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素產量達到最高。所述的利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，步驟(1)中，雨 生紅球藻采用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 21 °C，光強1500 18001x，光暗比為 12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至培雨生紅球藻細胞達到對數(shù)生長期，此時細胞濃度 達 IO8 個 /mL。所述的利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，油菜素內酯采用 中科瑞泰(北京)生物科技有限公司生產的油菜素內酯。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其優(yōu)點是1、本發(fā)明簡單易行、成本低廉，原材料雨生紅球藻細胞可以按常規(guī)方法自行培養(yǎng)。2、本發(fā)明能大幅提高雨生紅球藻中蝦青素的積累效率，實驗證明，添加4. 95 5. 05mg/L油菜素內酯處理組比空白對照組雨生紅球藻細胞完成蝦青素積累的周期縮短了 63. 6 68. 2%，蝦青素產量為空白對照組的94. 2 95. 7%，達11. 25 11. 43mg/L藻液。
具體實施例方式實施例1 步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19°C、 15001x光強、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細胞達到對數(shù) 生長期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素油菜素內酯采用中科瑞泰(北京)生物科
4技有限公司生產的油菜素內酯。先用2倍體積的無水乙醇溶解油菜素內酯，再用二甲亞砜 配制成濃度為1. Omg/mL的油菜素內酯母液，將油菜素內酯母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻 液中至油菜素內酯終濃度為4. 95mg/L;然后將上述添加了油菜素內酯的藻液與空白對照 組藻液同時在25°C、光強45001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培 養(yǎng)，16天后雨生紅球藻細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達到最高。實施例2:步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度20°C、光強 18001x、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細胞達到對數(shù)生長 期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素油菜素內酯采用北京中科瑞泰生物科技有 限公司生產的油菜素內酯。先用2倍體積的無水乙醇溶解油菜素內酯，再用二甲亞砜配制 成濃度為1. Omg/mL的油菜素內酯母液，將油菜素內酯母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中 至油菜素內酯終濃度為5. Omg/L ；然后將上述添加了油菜素內酯的藻液與空白對照組藻液 同時在26°C、光強48001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養(yǎng)，15 天后雨生紅球藻細胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達到最高。實施例3:步驟1、制備藻液雨生紅球藻選用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度21°C、光強 16001x、光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至雨生紅球藻細胞達到對數(shù)生長 期，細胞濃度達IO8個/mL，即獲得誘導培養(yǎng)的藻液；步驟2、誘導雨生紅球藻積累蝦青素油菜素內酯采用中科瑞泰(北京)生物科 技有限公司生產的油菜素內酯。先用2倍體積的無水乙醇溶解油菜素內酯，再用二甲亞砜 配制成濃度為1. Omg/mL的油菜素內酯母液，將油菜素內酯母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻 液中至油菜素內酯終濃度為5. 05mg/L ；然后將上述添加了油菜素內酯的藻液在28°C、光強 50001x、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養(yǎng)，14天后雨生紅球藻細 胞完全變紅，即完成蝦青素積累，此時蝦青素含量達到最高。采用以下方法對本發(fā)明中含有油菜素內酯的藻液及空白對照組藻液定期進行顯 微觀察，具體是每天取少量藻液樣品在光學顯微鏡下觀察藻細胞的顏色變化以及蝦青素積 累情況；然后按以下步驟對本發(fā)明含有油菜素內酯的藻液及空白對照組藻液中的蝦青素含 量進行測定①每三天各取出3ml上述兩種藻液，5000r/min離心5min，棄上清得到藻細胞 沉淀；②分別向兩種藻細胞沉淀加入5% KOH和30%甲醇破壞葉綠素5min后，5000r/min離 心收集沉淀；③在收集的沉淀中分別加入3ml 二甲亞砜，利用超聲波破壁后(3次15sec破 壁/5sec間歇，輸出功率40W)，于70°C水浴中處理lOmin，抽提至藻體發(fā)白；④然后IOOOOr/ min離心lOmin，分別取上清于490nm下測定OD值；⑤按公式C(mg/L) = (4. 5A X 490 X Va)/ Vb計算兩種上清中的蝦青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亞砜的體積，Vb表示藻液 體積。結果表明空白對照組雨生紅球藻細胞完全變紅的時間為44天，此時蝦青素含量 為11. 94mg/L藻液，油菜素內酯處理組比空白對照組的雨生紅球藻細胞完全變紅的周期縮 短63. 6 68. 2%，蝦青素 量為空白對照組的94. 2 95. 7%，達11. 25 11. 43mg/L藻 液。
權利要求
一種利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，其特征在于采用如下步驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細胞到對數(shù)生長期，獲得誘導培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解油菜素內酯，再用二甲亞砜配制成濃度為1mg/mL的油菜素內酯母液，將油菜素內酯母液添加到上述已經(jīng)培養(yǎng)好的藻液中至油菜素內酯終濃度為4.95～5.05mg/L；然后將上述添加了油菜素內酯的藻液在25～28℃、光強4500～5000lx、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養(yǎng)，直至光學顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，即雨生紅球藻細胞完成積累蝦青素，此時蝦青素產量達到最高。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，其 特征在于步驟(1)中，雨生紅球藻采用712藻株，采用MCM培養(yǎng)基，在溫度19 21°C，光 強1500 18001x，光暗比為12h/12h的條件下培養(yǎng)，日光燈下培養(yǎng)至培雨生紅球藻細胞達 到對數(shù)生長期，此時細胞濃度達IO8個/mL。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，其 特征在于油菜素內酯采用北京中科瑞泰生物科技有限公司生產的油菜素內酯。全文摘要
本發(fā)明提供一種利用油菜素內酯刺激雨生紅球藻快速生產蝦青素的方法，采用如下步驟(1)制備藻液培養(yǎng)雨生紅球藻細胞到對數(shù)生長期，獲得誘導培養(yǎng)的藻液；(2)積累蝦青素先用2倍體積的無水乙醇溶解油菜素內酯，再用二甲亞砜配制成濃度為1mg/mL的油菜素內酯母液，將油菜素內酯母液添加到上述已培養(yǎng)好的藻液中至油菜素內酯終濃度為4.95～5.05mg/L；然后將上述添加了油菜素內酯的藻液在25～28℃、光強4500～5000lx、日光燈連續(xù)光照及營養(yǎng)鹽饑餓的復合脅迫條件下進行培養(yǎng)，直至光學顯微鏡下觀察到雨生紅球藻細胞完全變紅，此時蝦青素產量達到最高。本發(fā)明簡單易行、成本低廉、并能大幅縮短雨生紅球藻細胞完全變紅的時間，從而大大提高雨生紅球藻生產蝦青素的效率。
文檔編號C12R1/89GK101974599SQ20101050596
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權日2010年10月14日
發(fā)明者葉乃好, 孟春曉, 王依濤, 羅韜, 胡百文, 高政權 申請人:山東理工大學