專利名稱：：使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法
技術領域：
：本發(fā)明使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，屬于植物組培快繁技術和生物
技術領域：
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背景技術：
：百合是單子葉植物綱百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)的總稱，為多年生宿根草本花卉。百合屬在世界上有90余種，原產我國的約有47種，占世界總數(shù)的51%。百合栽培品種繁多，其花朵碩大，色彩豐富，花姿優(yōu)美，既能作切花、盆花，又能在園林綠地中應用，且大多數(shù)百合可以食用，是上等的滋補佳品。百合素有“百年好合”之意，深受人們的喜愛。百合主要分布在中國、日本、北美和歐洲等溫帶地區(qū)，我國近年來的百合切花生產發(fā)展較快，在昆明、上海、深圳已形成三大生產基地。但其繁殖主要還是采用常規(guī)分球、分珠芽鱗片扦插，鱗片包埋等繁殖的方式。長期的無性繁殖使百合體內逐漸積累大量病毒致使百合患病毒病，影響百合的產量和質量。因此建立簡便易行、脫毒率高的脫毒體系是減少病毒對百合的危害、恢復種性的關鍵問題之一。自Mewart(1896)描述百合的壞死條紋以來，相繼報道了百合的病毒病原14種。其中發(fā)生普遍，危害嚴重的病毒有5種，即百合潛隱病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV),黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、郁金香碎花病毒(Tulipbreakingvirus,TBV)、異名百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)和百合叢簇病毒(Lilyrosettevirus,LRV)；其他9種病毒均在栽培地區(qū)極少發(fā)生，對百合生產構不成普遍危害，如百合X病毒(LilyvirusX，LVX)、百合環(huán)斑病毒(Lilyringspotvirus,LRSV)、水仙花病毒(Narcissusmosaicvirus,NMV)禾口煙草環(huán)斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)。本發(fā)明主要對百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)病毒、百合叢簇病毒(Lilyrosettlevirus,LRV)進行檢測。開展百合脫毒研究最早是Wiillips(1962年)，他利用百合莖尖培養(yǎng)脫毒成功以后，先后又有許多外國學者利用莖尖脫毒成功。目前國際上有幾個國家利用這種方法獲得百合無病毒苗，并在生產上大規(guī)模應用。莖尖脫毒培養(yǎng)的兩個關鍵技術環(huán)節(jié)是莖尖的成活率和脫毒率。莖尖培養(yǎng)成活率低。褐化是降低莖尖培養(yǎng)成活率的首要因素。褐化的發(fā)生與許多因素有關，莖尖大小、取材季節(jié)、培養(yǎng)方式、激素濃度、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物都對莖尖褐化有影響，例如莖尖越小，褐化越嚴重，成活率越低。在莖尖培養(yǎng)時為抑制褐化的發(fā)生，需要優(yōu)化上述各因子。應用抗氧化劑AC和VC也可有效抑制莖尖培養(yǎng)的褐化現(xiàn)象。鑒于此，本發(fā)明采用百合鱗莖作為材料進行脫毒苗的培養(yǎng)。常用脫毒技術有莖尖分生組織培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、熱處理法、化學療法及互相結合的方法。此外，花器官等其他器官培養(yǎng)脫毒也是一種有效的脫毒方法?，F(xiàn)在離體培育無病毒植株已成為花卉生產的重要環(huán)節(jié)。早在1943年White就發(fā)現(xiàn)植物生長點附近的病毒很少甚至無病毒。1962年Wiillips最早進行百合脫毒研究；1966年Mori和Hamaya通過莖尖培養(yǎng)獲得了百合無病毒植株；1993年趙祥云利用0.30.8mm珠芽生長點對淡黃花百合進行離體培養(yǎng)，培育出的幼苗可成功地脫去煙草環(huán)斑病毒；2001年席夢利對宜興百合脫毒培養(yǎng)得出，接種0.30.5mm的莖尖脫毒效果最好，對CMV的脫毒率達到40%，小于0.3mm的莖尖不能培養(yǎng)成活2003年徐品三等發(fā)現(xiàn)脫毒效果因百合品種和病毒種類而有所差異，“卡薩布蘭卡”百合中LSV容易脫去，脫毒率達76%，“魅麗”百合中CMV能全部脫去；2003年屈云慧等直接用莖尖脫去Elle百合CMV病毒，接種0.20.3mm莖尖脫毒率達43%。1994年Kim研究報道了病毒唑對CMV有較強的抑制作用效果。1999年Xu等研究了通過化學處理(病毒唑或二氫尿嘧啶)和35°C熱處理生產脫去鱗莖中帶有的LSV等病毒，并通過誘導東方百合Georgia品種愈傷組織獲得脫毒鱗莖。2003年屈云慧等對帶有CMV的亞洲百合Elle在40°C下處理5d以后，剝取0.20.3mm莖尖組織培養(yǎng)時脫毒率可達67%，而成苗率也達到48%。2001年席夢利等以宜興百合為試材，對3種脫毒方法(莖尖培養(yǎng)、熱處理結合莖尖培養(yǎng)、花藥培養(yǎng))進行研究，結果表明，珠芽經50士1°C熱水處理40min，培養(yǎng)30d后，切取0.81.Omm莖尖培養(yǎng)的脫毒效果最好，脫毒率達100%，38士1°C熱空氣處理后切取莖尖培養(yǎng)也能提高脫毒效果。因此，進行病毒脫除處理、推廣無毒化栽培技術對提高百合的觀賞價值和經濟價值有著重要的現(xiàn)實意義。主要參考文獻[1]周曉燕.百合主要病害及其防治[J]·植物保護，2002，28(1)=57-58.[2]鐘景輝，蔡秋錦.百合病害及其持續(xù)治理[J].森林病蟲通訊，2000，19(2)23,28-31.[3]傅玉蘭·花卉學[M],北京中國農業(yè)出版社，2001.216-217.[4]沈淑琳.百合病毒病及其檢驗[J]·1996，10(1)223~226[5]王小菁，李玲.植物生長調節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)的應用[M].北京化學工業(yè)出版社·2002,911-12.[6]趙祥云，程謙，邢尤美，等.百合珠芽組培及脫毒研究[J].園藝學報，1993，20(3)284-288.[7]席夢利，王節(jié)萍，章靜娟，等.宜興百合脫毒技術[J].江蘇農業(yè)學報，2001，17(1)492511.[8]徐品三，欒雨時，劉紀文等.百合不定芽培養(yǎng)脫毒種球生產的研究[J].植物學報，2003，20(3)3012318.[9]洪艷華，殷廣峰，張立軍.百合脫毒及病毒檢測技術進展[J].沈陽農業(yè)大學學報，2003，34(3)2252227.[10]高尚士.花卉病毒病的檢疫及其消除方法[J].植物檢疫，1994，(6)3402341.[IlJKimJY,LeeSY,ChoiJK,etal.Effectofvirazoleoneliminationofviru2ses(LSVandCMV)frominfectedlilyPlants[J].RDAJournalofAgriculturalScience(KoreaRepublic),1994,36:3702374.[12]XuPS,NiimiY.Evaluationofvirus2freebulbetProductionbyantiviraland/orheattreatmentinvitroscaleculturesofLiliumlongiflorum'Georgia，andL.'Casablanca'[J].JournaloftheJapanesesocietyforHorticulturalScience,1999,68:6402647.[13]王小菁，李玲.植物生長調節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)的應用[M].北京化學工業(yè)出版社·2002,9:11-12.[14]劉用生，李友勇.植物組織培養(yǎng)中活性炭的使用[J].植物生理學通訊·1994，30(3):214-217.[15]閻賢偉.甜櫻桃莖尖培養(yǎng)和快速繁殖研究[J].園藝學報，1990，17)275-279.[16]ASJESCJ,BL0M-BARNH00RNGJ.Air-bornefieldspreadoftulipbreakingvirus,lilysymptomlessvirusandlilyvirusXinlilyaffectedbyseasonalincidenceofflyingaphidsandcontrolbyspraysofmineraloil,vegetableoil,insecticideandpheromoneintheNetherlands[J].ActaHorticulture,1994,377:301-324,[17]ASJESCJ.Controlofaphid-borneLilysymptomlessvirusandLilymottlevirusinLiliumintheNetherlands[J].VirusResearch,2000,71(1-2):23-32.
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是尋找更好的適合百合組培苗脫毒的新方法，為以后培育百合無病毒植株，推廣無毒化栽培提供技術基礎。本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn)使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，按如下步驟進行(1)材料選取“西伯利亞”(Siberia)、“索邦”(Sorborme)種球；(2)百合種球病毒的檢測選取供試種球的球莖鱗片，提取總RNA，反轉錄后作為模板，采用反轉錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT_PCR)檢測，確定種球鱗片是否攜帶病毒。(3)培養(yǎng)基的配制、備用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；采用正交法研究6-BA和NAA濃度對百合組培的影響，確定可直接分化成芽和無根組培苗的最適6-BA和NAA濃度，配制最佳誘導培養(yǎng)基；采用1，3，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18mg/L的濃度配制含抗病毒藥物的培養(yǎng)基。抗病毒藥物采用0.2u濾膜過濾除菌。(4)外植體滅菌、接種將檢測被病毒感染的百合鱗莖用自來水沖洗過夜，0.升汞滅菌10分鐘，然后在70%酒精浸泡20秒。取出材料，用無菌水沖洗5-6遍。將材料切割成2.OmmX2.Omm小方塊，接種于最佳誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(5)外植體培養(yǎng)在溫度22士1°C，光照12h/d，光照強度1500Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)45-50天，百合鱗莖外植體直接分化成鱗莖芽和無根組培苗。進一步將葉片切下，將組培小鱗莖縱切2-4塊分別接種于對照組(誘導培養(yǎng)基)和實驗組(誘導培養(yǎng)基+—定濃度的抗病毒藥物)上，繼續(xù)培養(yǎng)；連續(xù)切割，繼代三次后，RT-PCR檢測病毒苗攜帶病毒的情況。(6)組培苗病毒檢測根據(jù)檢測病毒的種類百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)，黃瓜花葉病毒(CMV)，百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)病毒，百合叢簇病毒(Lilyrosettlevirus,LRV)按照已知基因序列設計特異性引物，經RT-PCR檢測無5擴增為陰性脫毒苗。RT-PCR檢測無擴增條帶樣品苗數(shù)母RT-PCR總檢測苗數(shù)RT-PCR檢測出擴增條帶樣品苗數(shù)RT-PCR總檢測苗數(shù)所述的使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于最佳誘導培養(yǎng)基配方MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0%蔗糖+瓊脂粉6.Og/L(PH5.8)。所述的使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于實驗組所使用的藥劑鹽酸金剛乙胺(RimantadineHydiochloride)的最適濃度10mg/L，脫毒率可達到93%。研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明通過正交法確定使百合直接分化成芽和無根組培苗的最適6-BA和NAA濃度，以及對百合進行脫毒所使用的鹽酸金剛乙胺藥劑的最適濃度，達到脫毒效率高，時間短等優(yōu)點。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其顯著優(yōu)點是極大的提高了組培苗的脫毒效率，為培育百合無病毒植株，推廣無毒化栽培的研究提供了技術基礎。具體實施例方式通過下面的實施例對本發(fā)明進一步的說明。實施例(脫毒組培苗的病毒檢測)(1)植物材料分別以對照組和實驗組的組培苗為材料。(2)病毒RNA的提取采用TRIzoI試劑，分別對每個供試樣品進行總RNA的提取，提取過程中使用的RNase-free水的配制方法將洗凈玻瓶中加滿0.1%(v/v)DEPC超純水，過夜處理后玻瓶高壓滅菌；RNase-free的塑料和玻璃器皿處理方法玻璃器皿可在150°C烘烤6小時；塑料器皿在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用DEPC水徹底清洗，再高壓滅菌。具體操作步驟如下1)供試樣品直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50_100mg植物樣品加入ImlTRIzol。樣品加入TRIzol后，室溫放置5min，使樣品充分裂解；2)4"C，12，OOOrpm離心10分鐘，取上清；3)每ImlTRIzol加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置3-5min使其自然分相；4)40C，12，OOOrpm離心10_15min。將最上層水相轉移到新管中；5)在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置10-20min。4°C，12，OOOrpm離心IOmin,棄上清，RNA沉淀于管底；6)RNA沉淀中加入Iml75%乙醇(用RNase-free水配制)，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；7)4°C，5，000-8，OOOrpm離心l-2min，棄上清；短暫快速離心，用移液器小心吸棄上清，室溫放置1-2分鐘晾干沉淀；8)沉淀中加入50-100μ1RNase-free水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，_70°C保存。(3)病毒各基因序列的擴增a)病毒序列PCR擴增引物的設計根據(jù)已報道的百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)，黃瓜花葉病毒(CMV)，百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)病毒，百合叢簇病毒(Lilyrosettlevirus,LRV)的外殼蛋白基因的序列設計Tm=55°C的PCR反應特異性引物。b)cDNA第一鏈的合成采用病毒外殼蛋白基因PCR下游引物作為反轉錄第一鏈的起始引物，反轉錄合成反應體系如下將Iyg總RNA置于離心管中，置于70°C水浴中l(wèi)Omin，短暫離心后馬上轉移到冰中。將反應液與變性后總RNA混合，反應體系如下ReversetranscriptionIOXbuffer2.0μ1dNTPmixture,IOmM2.0μ1MgC12,25mM4.0μ1RecombinantRNasinRibonucleaseinhibitor0.5μ1AMVreversetranscriptase(HighCone.)1.5uViruscoatproteingenePCRreverseprimers,IOmM1.0μ1TotalRNAl.OygNuclease-Freewatertoafinalvolumeof20μ1反轉錄反應在42°C下進行15min，反應完成后95°C，5min失活反轉錄酶，轉入4°C保溫5min。_20°C保存?zhèn)溆?。c)逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以反轉錄cDNA產物為模板，設置不加模板cDNA的PCR反應為陰性對照，按如下體系進行10XPCRreactionbuffer(Mg2+plus)2μ1dNTPmixture,IOmM1μ1ViruscoatproteingenePCRforwardprimer,IOmM1μ1ViruscoatproteingenePCRreverseprimer,IOmM1μ1ReversetranscriptioncDNAproductslugTaq,5U/μ10.2μ1Nuclease-Freewatertoafinalvolumeof20μ1PCR程序94°C，5min；94°C，30s,55°C，30s,72°C，lmin,30個循環(huán)；72°C，10min。PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳，SYBRGreen染色，紫外燈下觀察，檢測有無目標擴增片段，照相記錄。(4)RT-PCR產物檢測當不加模板cDNA的陰性對照PCR反應無目標擴增產物時，有目標擴增條帶的個體為病毒感染植株，無目標擴增條帶的個體為無病毒感染植株，即脫毒植株。權利要求1.使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于按如下步驟進行(1)材料選取“西伯利亞”(Siberia)、“索邦”(Sorborme)種球；(2)百合種球病毒的檢測選取供試種球的球莖鱗片，提取總RNA，反轉錄后作為模板，采用反轉錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)檢測，確定種球鱗片是否攜帶病毒；(3)培養(yǎng)基的配制、備用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；采用正交法研究6-BA和NAA濃度對百合組培的影響，確定可直接分化成芽和無根組培苗的最適6-BA和NAA濃度，配制最佳誘導培養(yǎng)基；采用1,3,5,6,7,8,9,10，12，14，16，18mg/L的濃度配制含抗病毒藥物的培養(yǎng)基。抗病毒藥物采用0.2u濾膜過濾除菌。(4)外植體滅菌、接種將檢測被病毒感染的百合鱗莖用自來水沖洗過夜，0.升汞滅菌10分鐘，然后在70%酒精浸泡20秒。取出材料，用無菌水沖洗5-6遍。將材料切割成2.OmmX2.Omm小方塊，接種于最佳誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(5)外植體培養(yǎng)在溫度22士1°C，光照12h/d，光照強度1500Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)45-50天，百合鱗莖外植體直接分化成鱗莖芽和無根組培苗。進一步將葉片切下，將組培小鱗莖縱切2-4塊分別接種于對照組(誘導培養(yǎng)基)和實驗組(誘導培養(yǎng)基+—定濃度的抗病毒藥物)上，繼續(xù)培養(yǎng)；連續(xù)切割，繼代三次后，RT-PCR檢測病毒苗攜帶病毒的情況。(6)組培苗病毒檢測根據(jù)檢測病毒的種類百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)，黃瓜花葉病毒(CMV)，百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)病毒，百合叢簇病毒(Lilyrosettlevirus,LRV)按照已知基因序列設計特異性引物，經RT-PCR檢測無擴增為陰性脫毒苗。RT-PCR檢測無擴增條帶樣品苗數(shù)貺母車RT-PCR總檢測苗數(shù)RT-PCR檢測出擴增條帶樣品苗數(shù)RT-PCR總檢測苗數(shù)2.根據(jù)權利要求書1所述的使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于最佳誘導培養(yǎng)基配方MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0%蔗糖+瓊脂粉6.0g/L(PH5.8)。3.根據(jù)權利要求書1所述的使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于實驗組所使用的藥劑鹽酸金剛乙胺(RimantadineHydiochloride)的最適濃度10mg/L，脫毒率可達到93%。全文摘要本發(fā)明公開了使用鹽酸金剛乙胺藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，屬于植物組培快繁技術和生物
技術領域：
。該方法包括百合種球病毒的檢測、培養(yǎng)基的配制、備用、外植體滅菌和接種、外植體培養(yǎng)、組培苗的病毒檢測等步驟，快速獲得大量脫毒組培苗。本發(fā)明通過正交法獲得百合直接分化成芽和無根組培苗的最佳誘導培養(yǎng)基配方，以及通過配制一系列濃度梯度的鹽酸金剛乙胺抗病毒藥劑，篩選出最適脫毒濃度，脫毒效率可達到93％，不僅縮短了誘導培養(yǎng)周期，還具有脫毒率高，增值系數(shù)高等特點，為培育百合無病毒植株，推廣無毒化栽培的研究提供了技術基礎。文檔編號C12Q1/68GK102440183SQ201010506259公開日2012年5月9日申請日期2010年10月14日優(yōu)先權日2010年10月14日發(fā)明者安利清,張克,楊凱,王樹棟,胖鐵良,趙祥云申請人:安利清,楊凱,胖鐵良