專利名稱：：使用無環(huán)鳥苷藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明使用無環(huán)鳥苷藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，屬于植物組培快繁技術(shù)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：百合是單子葉植物綱百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)的總稱，為多年生宿根草本花卉。百合屬在世界上有90余種，原產(chǎn)我國的約有47種，占世界總數(shù)的51%。百合栽培品種繁多，其花朵碩大，色彩豐富，花姿優(yōu)美，既能作切花、盆花，又能在園林綠地中應(yīng)用，且大多數(shù)百合可以食用，是上等的滋補佳品。百合素有“百年好合”之意，深受人們的喜愛。百合主要分布在中國、日本、北美和歐洲等溫帶地區(qū)，我國近年來的百合切花生產(chǎn)發(fā)展較快，在昆明、上海、深圳已形成三大生產(chǎn)基地。但其繁殖主要還是采用常規(guī)分球、分珠芽鱗片扦插，鱗片包埋等繁殖的方式。長期的無性繁殖使百合體內(nèi)逐漸積累大量病毒致使百合患病毒病，影響百合的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此建立簡便易行、脫毒率高的脫毒體系是減少病毒對百合的危害、恢復(fù)種性的關(guān)鍵問題之一。自Stewart(1896)描述百合的壞死條紋以來，相繼報道了百合的病毒病原14種。其中發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重的病毒有5種，即百合潛隱病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV),黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、郁金香碎花病毒(Tulipbreakingvirus,TBV)、異名百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)和百合叢簇病毒(Lilyrosettevirus,LRV)；其他9種病毒均在栽培地區(qū)極少發(fā)生，對百合生產(chǎn)構(gòu)不成普遍危害，如百合X病毒(LilyvirusX，LVX)、百合環(huán)斑病毒(Lilyringspotvirus,LRSV)、水仙花病毒(Narcissusmosaicvirus,NMV)禾口煙草環(huán)斑病毒(Tobaccoringspotvirus,TRSV)。本發(fā)明主要對百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)病毒、百合叢簇病毒(Lilyrosettlevirus,LRV)進(jìn)行檢測。開展百合脫毒研究最早是Phillips(1962年)，他利用百合莖尖培養(yǎng)脫毒成功以后，先后又有許多外國學(xué)者利用莖尖脫毒成功。目前國際上有幾個國家利用這種方法獲得百合無病毒苗，并在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用。莖尖脫毒培養(yǎng)的兩個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)是莖尖的成活率和脫毒率。莖尖培養(yǎng)成活率低。褐化是降低莖尖培養(yǎng)成活率的首要因素。褐化的發(fā)生與許多因素有關(guān)，莖尖大小、取材季節(jié)、培養(yǎng)方式、激素濃度、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物都對莖尖褐化有影響，例如莖尖越小，褐化越嚴(yán)重，成活率越低。在莖尖培養(yǎng)時為抑制褐化的發(fā)生，需要優(yōu)化上述各因子。應(yīng)用抗氧化劑AC和VC也可有效抑制莖尖培養(yǎng)的褐化現(xiàn)象。鑒于此，本發(fā)明采用百合鱗莖作為材料進(jìn)行脫毒苗的培養(yǎng)。常用脫毒技術(shù)有莖尖分生組織培養(yǎng)、珠芽培養(yǎng)、熱處理法、化學(xué)療法及互相結(jié)合的方法。此外，花器官等其他器官培養(yǎng)脫毒也是一種有效的脫毒方法?，F(xiàn)在離體培育無病毒植株已成為花卉生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。早在1943年White就發(fā)現(xiàn)植物生長點附近的病毒很少甚至無病毒。1962年P(guān)hillips最早進(jìn)行百合脫毒研究；1966年Mori和Hamaya通過莖尖培養(yǎng)獲得了百合無病毒植株；1993年趙祥云利用0.30.8mm珠芽生長點對淡黃花百合進(jìn)行離體培養(yǎng)，培育出的幼苗可成功地脫去煙草環(huán)斑病毒；2001年席夢利對宜興百合脫毒培養(yǎng)得出，接種0.30.5mm的莖尖脫毒效果最好，對CMV的脫毒率達(dá)到40%，小于0.3mm的莖尖不能培養(yǎng)成活；2003年徐品三等發(fā)現(xiàn)脫毒效果因百合品種和病毒種類而有所差異，“卡薩布蘭卡”百合中LSV容易脫去，脫毒率達(dá)76%，“魅麗”百合中CMV能全部脫去；2003年屈云慧等直接用莖尖脫去Elle百合CMV病毒，接種0.20.3mm莖尖脫毒率達(dá)43%。1994年Kim研究報道了病毒唑?qū)MV有較強的抑制作用效果。1999年Xu等研究了通過化學(xué)處理(病毒唑或二氫尿嘧啶)和35°C熱處理生產(chǎn)脫去鱗莖中帶有的LSV等病毒，并通過誘導(dǎo)東方百合Georgia品種愈傷組織獲得脫毒鱗莖。2003年屈云慧等對帶有CMV的亞洲百合Elle在40°C下處理5d以后，剝?nèi)?.20.3mm莖尖組織培養(yǎng)時脫毒率可達(dá)67%，而成苗率也達(dá)到48%。2001年席夢利等以宜興百合為試材，對3種脫毒方法(莖尖培養(yǎng)、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)、花藥培養(yǎng))進(jìn)行研究，結(jié)果表明，珠芽經(jīng)50士1°C熱水處理40min，培養(yǎng)30d后，切取0.81.Omm莖尖培養(yǎng)的脫毒效果最好，脫毒率達(dá)100%，38士1°C熱空氣處理后切取莖尖培養(yǎng)也能提高脫毒效果。因此，進(jìn)行病毒脫除處理、推廣無毒化栽培技術(shù)對提高百合的觀賞價值和經(jīng)濟價值有著重要的現(xiàn)實意義。主要參考文獻(xiàn)[1]周曉燕.百合主要病害及其防治[J]·植物保護(hù)，2002，28(1)=57-58.[2]鐘景輝，蔡秋錦.百合病害及其持續(xù)治理[J].森林病蟲通訊，2000，19(2)23,28-31.[3]傅玉蘭·花卉學(xué)[M],北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.216-217.[4]沈淑琳.百合病毒病及其檢驗[J]·1996，10(1)223~226[5]王小菁，李玲.植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社·2002,911-12.[6]趙祥云，程謙，邢尤美，等.百合珠芽組培及脫毒研究[J].園藝學(xué)報，1993，20(3)284-288.[7]席夢利，王節(jié)萍，章靜娟，等.宜興百合脫毒技術(shù)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2001，17(1)492511.[8]徐品三，欒雨時，劉紀(jì)文等.百合不定芽培養(yǎng)脫毒種球生產(chǎn)的研究[J].植物學(xué)報，2003，20(3)3012318.[9]洪艷華，殷廣峰，張立軍.百合脫毒及病毒檢測技術(shù)進(jìn)展[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，34(3)2252227.[10]高尚士.花卉病毒病的檢疫及其消除方法[J].植物檢疫，1994，(6)3402341.[ll]KimJY,LeeSY,ChoiJK,etal.Effectofvirazoleoneliminationofviru2ses(LSVandCMV)frominfectedlilyPlants[J].RDAJournalofAgriculturalScience(KoreaRepublic),1994,36:3702374.[12]XuPS,NiimiY.Evaluationofvirus2freebulbetProductionbyantiviraland/orheattreatmentinvitroscaleculturesofLiliumlongiflorum'Georgia，andL.'Casablanca'[J].JournaloftheJapanesesocietyforHorticulturalScience,1999,68:6402647.[13]王小菁，李玲.植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用[M].北京化學(xué)工業(yè)出版社·2002,911-12.[14]劉用生，李友勇.植物組織培養(yǎng)中活性炭的使用[J].植物生理學(xué)通訊·1994，30(3)214-217.[15]閻賢偉.甜櫻桃莖尖培養(yǎng)和快速繁殖研究[J].園藝學(xué)報，1990，17(4)275-279.[16]ASJESCJ,BL0M-BARNH00RNGJ.Air-bornefieldspreadoftulipbreakingvirus,lilysymptomlessvirusandlilyvirusXinlilyaffectedbyseasonalincidenceofflyingaphidsandcontrolbyspraysofmineraloil,vegetableoil,insecticideandpheromoneintheNetherlands[J].ActaHorticulture,1994,377:301_324.[17]ASJESCJ.Controlofaphid-borneLilysymptomlessvirusandLilymottlevirusinLiliumintheNetherlands[J].VirusResearch,2000,71(1-2):23_32.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是尋找更好的適合百合組培苗脫毒的新方法，為以后培育百合無病毒植株，推廣無毒化栽培提供技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)使用無環(huán)鳥苷藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，按如下步驟進(jìn)行(1)材料選取“西伯利亞”(Siberia)、“索邦”(Sorborme)種球；(2)百合種球病毒的檢測選取供試種球的球莖鱗片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后作為模板，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT_PCR)檢測，確定種球鱗片是否攜帶病毒。(3)培養(yǎng)基的配制、備用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；采用正交法研究6-BA和NAA濃度對百合組培的影響，確定可直接分化成芽和無根組培苗的最適6-BA和NAA濃度，配制最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基；采用1，3，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18mg/L的濃度配制含抗病毒藥物的培養(yǎng)基?？共《舅幬锊捎?.2u濾膜過濾除菌。(4)外植體滅菌、接種將檢測被病毒感染的百合鱗莖用自來水沖洗過夜，0.升汞滅菌10分鐘，然后在70%酒精浸泡20秒。取出材料，用無菌水沖洗5-6遍。將材料切割成2.OmmX2.Omm小方塊，接種于最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(5)外植體培養(yǎng)在溫度22士1°C，光照12h/d，光照強度1500Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)45-50天，百合鱗莖外植體直接分化成鱗莖芽和無根組培苗。進(jìn)一步將葉片切下，將組培小鱗莖縱切2-4塊分別接種于對照組(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)和實驗組(誘導(dǎo)培養(yǎng)基+—定濃度的抗病毒藥物)上，繼續(xù)培養(yǎng)；連續(xù)切割，繼代三次后，RT-PCR檢測病毒苗攜帶病毒的情況。(6)組培苗病毒檢測根據(jù)檢測病毒的種類百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)，黃瓜花葉病毒(CMV)，百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)病毒，百合叢簇病毒(Lilyrosettlevirus,LRV)按照已知基因序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)RT-PCR檢測無擴增為陰性脫^權(quán)利要求1.使用無環(huán)鳥苷藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行(1)材料選取“西伯利亞”(Siberia)、“索邦”(Sorborme)種球；(2)百合種球病毒的檢測選取供試種球的球莖鱗片，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后作為模板，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)檢測，確定種球鱗片是否攜帶病毒；(3)培養(yǎng)基的配制、備用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；采用正交法研究6-BA和NAA濃度對百合組培的影響，確定可直接分化成芽和無根組培苗的最適6-BA和NAA濃度，配制最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基；采用1,3,5,6,7,8,9,10，12，14，16，18mg/L的濃度配制含抗病毒藥物的培養(yǎng)基?？共《舅幬锊捎?.2u濾膜過濾除菌。(4)外植體滅菌、接種將檢測被病毒感染的百合鱗莖用自來水沖洗過夜，0.升汞滅菌10分鐘，然后在70%酒精浸泡20秒。取出材料，用無菌水沖洗5-6遍。將材料切割成2.OmmX2.Omm小方塊，接種于最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(5)外植體培養(yǎng)在溫度22士1°C，光照12h/d，光照強度1500Lx的環(huán)境條件下培養(yǎng)45-50天，百合鱗莖外植體直接分化成鱗莖芽和無根組培苗。進(jìn)一步將葉片切下，將組培小鱗莖縱切2-4塊分別接種于對照組(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)和實驗組(誘導(dǎo)培養(yǎng)基+—定濃度的抗病毒藥物)上，繼續(xù)培養(yǎng)；連續(xù)切割，繼代三次后，RT-PCR檢測病毒苗攜帶病毒的情況。(6)組培苗病毒檢測根據(jù)檢測病毒的種類百合無癥病毒(Lilysymptomlessvirus，LSV)，黃瓜花葉病毒(CMV)，百合斑駁病毒(Lilymottlevirus,LMoV)病毒，百合叢簇病毒(Lilyrosettlevirus,LRV)按照已知基因序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)RT-PCR檢測無擴增為陰性脫毒苗。RT-PCR檢測無擴增條帶樣品苗數(shù)脫毒率=陽性率=RT-PCR總檢測苗數(shù)RT-PCR檢測出擴增條帶樣品苗數(shù)RT-PCR總襝測苗數(shù)2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的使用無環(huán)鳥苷藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0%蔗糖+瓊脂粉6.0g/L(PH5.8)。3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的使用無環(huán)鳥苷藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，其特征在于實驗組所使用的藥劑無環(huán)鳥苷(Aciclovir)的最適濃度9mg/L，脫毒率可達(dá)到90%。全文摘要本發(fā)明公開了使用無環(huán)鳥苷藥劑對百合脫毒培養(yǎng)的方法，屬于植物組培快繁技術(shù)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。該方法包括百合種球病毒的檢測、培養(yǎng)基的配制、備用、外植體滅菌和接種、外植體培養(yǎng)、組培苗的病毒檢測等步驟，快速獲得大量脫毒組培苗。本發(fā)明通過正交法獲得百合直接分化成芽和無根組培苗的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，以及通過配制一系列濃度梯度的無環(huán)鳥苷抗病毒藥劑，篩選出最適脫毒濃度，脫毒效率可達(dá)到90％，不僅縮短了誘導(dǎo)培養(yǎng)周期，還具有脫毒率高，增值系數(shù)高等特點，為培育百合無病毒植株，推廣無毒化栽培的研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。文檔編號C12Q1/70GK102440187SQ20101050630公開日2012年5月9日申請日期2010年10月14日優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日發(fā)明者張克,楊凱,王春城,王樹棟,趙祥云申請人:楊凱,王春城,王樹棟