專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重pcr試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及蚊媒病原體(乙型腦炎病毒、登革熱病毒、瘧 原蟲(chóng)、絲蟲(chóng))的基因檢測(cè)，特別是一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在我國(guó)流行或曾經(jīng)流行的蚊媒病有瘧疾、絲蟲(chóng)病、乙型腦炎、登革熱等。檢測(cè)蚊媒 攜帶病原體是早期發(fā)現(xiàn)流行、預(yù)防蚊媒病的有效措施之一。蚊蟲(chóng)是瘧疾、絲蟲(chóng)病、乙型腦炎、登革熱等多種傳染病的傳播媒介。蚊媒病的監(jiān)測(cè)， 以往的研究多是針對(duì)單種病原體檢測(cè)，對(duì)于蚊媒病的防治應(yīng)當(dāng)綜合考慮。從蚊媒方面來(lái)監(jiān) 測(cè)病原體，屬于早期監(jiān)測(cè)和發(fā)現(xiàn)傳染病的方法，半巢式多重PCR檢測(cè)蚊媒病原體方法將為 蚊媒病防治提供一種早期的綜合高效的監(jiān)測(cè)方法，對(duì)蚊媒病的有效預(yù)警和控制有較大價(jià)值。目前，世界上仍有100多個(gè)國(guó)家為瘧疾流行區(qū)，約22億人受瘧疾的威脅，每年有 300 500萬(wàn)瘧疾臨床病例，死亡人數(shù)為110 270萬(wàn)。瘧疾也是嚴(yán)重危害我國(guó)人民身體健 康，影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重大寄生蟲(chóng)病。經(jīng)過(guò)多年堅(jiān)持不懈的積極防治，我國(guó)在控制瘧疾流 行、減少危害程度方面取得了顯著成效。由于我國(guó)瘧疾疫區(qū)各類(lèi)流行因素尚未根本改變，流 動(dòng)人口劇增導(dǎo)致傳染源擴(kuò)散與積累，氣候變暖、生態(tài)環(huán)境變化造成媒介按蚊密度增加，惡性 瘧原蟲(chóng)和媒介按蚊對(duì)防治藥物抗性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，這些問(wèn)題嚴(yán)重影響了我國(guó)瘧疾防治工作 的進(jìn)程，近年來(lái)瘧疾發(fā)病數(shù)呈不穩(wěn)定狀態(tài)。國(guó)家衛(wèi)生部已經(jīng)制定了消除瘧疾的計(jì)劃，為保證 該計(jì)劃的實(shí)施，應(yīng)當(dāng)有計(jì)劃、連續(xù)、系統(tǒng)地開(kāi)展瘧疾疫情、監(jiān)測(cè)，掌握瘧疾流行規(guī)律和趨勢(shì)， 為評(píng)價(jià)防治效果和制訂瘧疾防治對(duì)策提供科學(xué)依據(jù)。有效的蚊媒檢測(cè)是加強(qiáng)我國(guó)預(yù)防控制 瘧疾的重要技術(shù)保障，是有效開(kāi)展預(yù)防和控制瘧疾工作的重要內(nèi)容。淋巴絲蟲(chóng)病是嚴(yán)重危害人民健康的寄生蟲(chóng)病之一，在我國(guó)流行的絲蟲(chóng)病有班氏絲 蟲(chóng)病和馬來(lái)絲蟲(chóng)病兩種，分別由班氏吳策線(xiàn)蟲(chóng)和馬來(lái)布魯線(xiàn)蟲(chóng)引起。曾經(jīng)在15個(gè)省(市、 區(qū))流行，受威脅人口達(dá)3. 3億。經(jīng)過(guò)40年的防治，實(shí)現(xiàn)了全國(guó)基本消滅絲蟲(chóng)病?，F(xiàn)有報(bào) 告，在經(jīng)濟(jì)、衛(wèi)生條件較差的邊遠(yuǎn)貧困地區(qū)，以及防治、監(jiān)測(cè)工作中存在薄弱環(huán)節(jié)的地區(qū)，與 鄰國(guó)絲蟲(chóng)病流行區(qū)接壤地帶，外來(lái)流動(dòng)人口聚集地區(qū)，即使只存在個(gè)別的高密度微絲蚴血 癥者就可在當(dāng)?shù)匾鸾z蟲(chóng)新感染。滅病務(wù)盡，防止絲蟲(chóng)病在我國(guó)死灰復(fù)燃，消滅絲蟲(chóng)病地區(qū) 仍需繼續(xù)開(kāi)展監(jiān)測(cè)工作。對(duì)于黃病毒屬病毒，以乙腦、登革熱為例。乙腦是由乙腦病毒引起，由蚊蟲(chóng)傳播的 急性傳染病。乙腦致死率和致殘率高，是威脅人群特別是兒童健康的主要傳染病之一。夏秋 季為發(fā)病高峰季節(jié)，流行地區(qū)分布與媒介蚊蟲(chóng)分布密切相關(guān)，我國(guó)曾是乙腦高度流行區(qū)，在 20世紀(jì)60年代和70年代初期全國(guó)曾發(fā)生大流行，70年代以后隨著大范圍接種乙腦疫苗， 乙腦發(fā)病率明顯下降，近年來(lái)維持在較低的發(fā)病水平，全國(guó)乙腦報(bào)告病例數(shù)每年在5000 10000例之間，但由于疫苗接種的盲區(qū)或其他原因，局部地區(qū)時(shí)有暴發(fā)流行。登革病毒有1 4型，經(jīng)埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。按照《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》的規(guī)定為乙類(lèi)傳染病。是熱帶、亞熱帶地區(qū)的一個(gè)非常重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目 前，世界上約有25億人受到登革病毒感染的威脅，每年發(fā)生登革病毒感染患者超過(guò)1億人， 并且有50萬(wàn)人發(fā)展成為登革出血熱或登革休克綜合征，造成大約25000人死亡。我國(guó)20 世紀(jì)90年代以來(lái)，本病主要在廣東、福建流行，多為小規(guī)模流行或散發(fā)。1999年和2004年 因輸入性病例導(dǎo)致福建和浙江等地發(fā)生暴發(fā)流行，其它省區(qū)近年來(lái)也常有輸入性病例的發(fā) 生。由于登革病毒傳播迅猛、發(fā)病率高，特別是近些年由于人員流動(dòng)頻繁和國(guó)際旅游的迅 猛發(fā)展，使登革病毒的流行范圍及其傳播媒介埃及伊蚊和白紋伊蚊的分布范圍也在相應(yīng)擴(kuò) 大。登革病毒在一個(gè)地區(qū)往往存在不同血清型病毒的交替流行，這更增加了登革出血熱和 登革休克綜合征發(fā)生的威脅。登革出血熱和登革休克綜合征的病死率較高，不僅嚴(yán)重影響 人民的身體健康，而且嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)、貿(mào)易和旅游事業(yè)的發(fā)展。實(shí)施流行性乙型腦炎和 登革熱的蚊媒監(jiān)測(cè)，有助于提前發(fā)現(xiàn)疫情，科學(xué)地預(yù)測(cè)、預(yù)警，及時(shí)采取有效防治措施，降低 發(fā)病率。從蚊媒方面來(lái)監(jiān)測(cè)瘧原蟲(chóng)絲蟲(chóng)黃病毒屬病毒感染，在傳染病監(jiān)測(cè)中屬于早期監(jiān)測(cè) 和發(fā)現(xiàn)傳染病流行的方法，蚊媒檢測(cè)對(duì)于蚊媒病的有效預(yù)警和控制有重要的意義。以往的 研究都是針對(duì)一種病原體檢測(cè)，對(duì)于蚊媒病的防治應(yīng)當(dāng)綜合考慮。簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是發(fā)現(xiàn)蚊傳病原體的重要技術(shù)保障，掌握其流行規(guī)律和趨勢(shì) 為評(píng)價(jià)防治效果和制訂防治對(duì)策提供科學(xué)依據(jù)(Nuchprayoon et al.，2003)。還可用于蚊 傳疾病的臨床檢測(cè)。監(jiān)測(cè)蚊蟲(chóng)感染情況，對(duì)瘧疾和絲蟲(chóng)病控制具有重要影響(Gage et al., 2008)。診斷絲蟲(chóng)病和瘧疾，傳統(tǒng)方法是顯微鏡鏡檢，雖然此方法方便，費(fèi)用低廉并且相對(duì)準(zhǔn) 確，但是往往需要技術(shù)熟練和費(fèi)時(shí)的勞動(dòng)，而且不足以檢測(cè)瘧原蟲(chóng)低密度血樣。為解決這些 不足，發(fā)展了免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫吸附層析(ICT)，用來(lái)精確 評(píng)估血樣和蚊蟲(chóng)群體病原體攜帶情況[Nuchprayoon et al. ,2003, Wirtz et al.，1985]。 以后又發(fā)展了更簡(jiǎn)單，更敏感的診斷方法，即基于更先進(jìn)的免疫免疫吸附層析(ICT)和聚 合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)。如高度敏感的種屬特異性免疫吸附層析(ICT)能夠快速檢測(cè)血檢 陰性血樣中的班氏絲蟲(chóng)(Weil et al. ,1997)；類(lèi)似的技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)人體內(nèi)瘧原蟲(chóng) 和岐體內(nèi)子孢子(Bangs et al. ,2002, Wirtz et al.，1985，Wongsrichanalai，2001)。使用敏感特異的檢測(cè)技術(shù)如PCR可以獲得準(zhǔn)確的疾病流行狀況。檢測(cè)蚊蟲(chóng)體內(nèi)瘧 原蟲(chóng)、絲蟲(chóng)DNA可以間接反映人群的感染情況(Bockarie et al.，2000，Chanteau et al.， 1994, Goodman et al. , 2003, Ramzy et al. , 1997, Rao et al. , 2006, Rougemont et al., 2004,Vasuki et al.，2008，Chansiri and Phantana，2002，F(xiàn)arid et al. ,2001, Williams et al.，2002)。用RFLP-PCR方法以班氏絲蟲(chóng)SspI 188bp重復(fù)DNA序列為靶基因，能檢測(cè)0. Ipg 的班氏絲蟲(chóng)基因組 DNA (Chansiri and Phantana, 2002, Farid et al.，2001，Williams et al. ,2002) ο 以絲蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄間隔 1 區(qū)(internal transcribed spacerl，ITS-1)序列為靶基因 RFLP-PCR可以檢測(cè)多種絲蟲(chóng)(Nuchprayoon et al. ,2005) 使用多重PCR法檢測(cè)蚊蟲(chóng)和血 樣中班氏絲蟲(chóng)和馬來(lái)絲蟲(chóng)(Chansiri etal.，2001，Mishra et al.，2005，Mishra et al.， 2007)。巢式PCR敏感度高，與傳統(tǒng)PCR相比它能檢測(cè)到更微量的絲蟲(chóng)，但目前使用巢式PCR 檢測(cè)絲蟲(chóng)鮮有報(bào)道。隨著班氏絲蟲(chóng)和馬來(lái)絲蟲(chóng)ITS-I基因序列的發(fā)表，可以在這個(gè)高度重 復(fù)序列上設(shè)計(jì)引物，建立基于PCR原理的各種新的檢測(cè)方法。
在瘧原蟲(chóng)檢測(cè)方面，免疫層析試驗(yàn)已作為診斷瘧疾的選擇，但是其靈敏度不足而 不能用于常規(guī)診斷(Humar et al.，1997，Tham et al.，1999)。DNA探針相比鏡檢靈敏度 有所提高(Waters and McCutchan，1989)，但是這種方法不適于大量樣本的篩選。PCR檢測(cè) 多以小核糖體亞基 DNA (SSU rDNA)為靶基因(Li et al.，1995 ；Schindler et al.，2001 ； Snounou et al.，1993)。由于瘧原蟲(chóng)SSU rDNA基因拷貝數(shù)較少，每個(gè)基因組4_8拷貝(Goman et al.，1991)，巢式 PCR 被用來(lái)檢測(cè)微量原蟲(chóng)(Rubio et al. , 1999 ；Schindler et al.， 2001 ；Snounou et al.，1993 ；Zalis et al.，1996)。巢式PCR 比傳統(tǒng)PCR特異性和靈敏度更 高，但巢式PCR是兩次PCR，步驟較為繁瑣(Picken et al. , 1996)；單管半巢式PCR(Single tube hemi-nested PCR, STHN PCR)步驟簡(jiǎn)單，但敏感度不及兩步巢式 PCR (Montenegro et al.，2004)。real-time PCR以18S rDNA為靶基因檢測(cè)人血樣中4種瘧原蟲(chóng)，靈敏度高特異 性強(qiáng)，但real-time PCR成本較高，不適合大量樣本的篩選(Rougemont et al. ,2004) 雖然有許多關(guān)于檢測(cè)蚊媒黃病毒屬特定種或?qū)俚姆肿釉\斷(Chow et al. ,1993, Fulop et al. ,1993,Tanaka,1993,Chang et al. ,1994,Puri et al. ,1994,Pierre et al., 1994，Meiyu et al.，1997，Kuno, 1998)，但迄今為止僅 Scaramozzino 和 Lanciotti 報(bào)道的 屬特異性半巢式PCR具有較高敏感性。Pyke (2004)用TaqMan RT-PCR檢測(cè)了澳大利亞腦炎 病毒，1(01^(2006)用139]\&111儀31-^1116 one-step RT-PCR定量檢測(cè)了登革病毒，Dyer(2007) 用同樣方法建立了檢測(cè)節(jié)肢動(dòng)物傳播的黃病毒屬的方法，國(guó)內(nèi)周曉俊等.(2008)建立了 SYBR Green I Real-time PCR檢測(cè)黃病毒屬的方法，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性別定量 的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等 特點(diǎn)，但缺點(diǎn)則是機(jī)器及反應(yīng)耗材費(fèi)用相對(duì)較高，造成目前在使用上無(wú)法達(dá)到普及?？傊?國(guó)內(nèi)外對(duì)于蚊傳病原體的檢測(cè)大多靈敏度不高，成本較高，且不能同時(shí)檢測(cè)蚊蟲(chóng)攜帶的多 種病原體。本發(fā)明也可用于西尼羅病毒、黃熱病毒的初步鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒及檢測(cè)方法，所述 的這種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒及檢測(cè)方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)蚊傳病原 體的方法靈敏度不高、成本較高、且不能同時(shí)檢測(cè)蚊蟲(chóng)攜帶的多種病原體的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，含有如下引物1)檢測(cè)黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測(cè)黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ IDNO 6所示；4)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，
下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。進(jìn)一步的，所述的黃病毒屬病毒包括乙型腦炎病毒、或者登革熱病毒1型、或者登 革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒4型、西尼羅病毒和黃熱病毒。進(jìn)一步的，所述的瘧原蟲(chóng)屬包括惡性瘧原蟲(chóng)、或者間日瘧原蟲(chóng)、或者諾氏瘧原蟲(chóng)、 或者卵形瘧原蟲(chóng)、或者三日瘧原蟲(chóng)。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。進(jìn)一步的，所述的陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為滅菌ddH20。進(jìn)一步的，所述的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為乙型腦炎cDNA、或者登革熱病毒cDNA、或者間日 瘧原蟲(chóng)DNA、或者惡性瘧原蟲(chóng)DNA。進(jìn)一步的，所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑中各組份為1) 10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液；2)四種脫氧核糖核苷酸，四種脫氧核糖核苷酸的濃度均為25mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的濃度為5mg/ml ；4) EXTaq 酶，EXTaq 酶的濃度為 5U/ μ L ；5)滅菌雙蒸水。進(jìn)一步的，所述的10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中的所有的引物的濃度均為ΙΟμΜ。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)蚊傳病原體的方法，包括一個(gè)提取蚊蟲(chóng)核酸的步驟，還 包括一個(gè)將提取的核酸在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增的步驟，還包括一個(gè)將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電 泳檢測(cè)的步驟，還包括確定蚊傳病原體具體種類(lèi)的測(cè)序步驟。進(jìn)一步的，在一個(gè)將提取的核酸在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增的步驟中，1)檢測(cè)黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測(cè)黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第一輪PCR的引物
7
上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ IDNO 13所示。本發(fā)明還提供了上述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒在檢測(cè)乙型腦炎 病毒、或者登革熱病毒1型、或者登革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒 4型、或者西尼羅病毒和黃熱病毒/惡性瘧原蟲(chóng)、或者間日瘧原蟲(chóng)、或者諾氏瘧原蟲(chóng)、或者卵 形瘧原蟲(chóng)、或者三日瘧原蟲(chóng)/馬來(lái)絲蟲(chóng)、或班氏絲蟲(chóng)中的應(yīng)用。本發(fā)明和已有技術(shù)相比較，其效果是積極和明顯的。本發(fā)明建立了一種對(duì)上述蚊 媒病原體的快速有效分子鑒定方法，為蚊媒病的早期有效預(yù)警提供可靠的信息資料。本發(fā) 明建立了半巢式多重PCR檢測(cè)蚊傳病原體(瘧原蟲(chóng)、絲蟲(chóng)、黃病毒)的方法，將為我國(guó)蚊媒 病防治工作提供一種低廉高效的早期監(jiān)測(cè)和發(fā)現(xiàn)傳染病流行的方法。半巢式多重PCR檢測(cè) 蚊媒病原體方法將為我國(guó)蚊媒病防治提供一種早期的綜合高效的監(jiān)測(cè)方法，對(duì)蚊媒病的有 效預(yù)警和控制有較大價(jià)值。本發(fā)明可以應(yīng)用于多種樣品的檢測(cè)，如蚊蟲(chóng)、病人血液、組織液等。使用本發(fā)明 的試劑盒可快速、靈敏、同時(shí)檢測(cè)蚊蟲(chóng)攜帶的多種病原體包括乙型腦炎病毒、登革熱病毒 1-4型、黃熱病毒、惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、諾氏瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)、馬來(lái)絲 蟲(chóng)等多種病原體。從而為我國(guó)蚊媒病防治工作提供一種低廉高效的早期監(jiān)測(cè)和發(fā)現(xiàn)蚊媒病 流行的方法，對(duì)預(yù)防蚊媒病提供有效預(yù)警資料。


圖1是采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)蚊傳瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、諾氏瘧原 蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)和馬來(lái)絲蟲(chóng))的結(jié)果圖；M :DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker I ；K 陰性對(duì)照(ddH20PCR產(chǎn)物)；1 蚊蟲(chóng)內(nèi)馬來(lái)絲蟲(chóng)與約 氏瘧原蟲(chóng)DNA模板PCR產(chǎn)物；2 海南病人血樣惡性瘧原蟲(chóng)DNA模板PCR產(chǎn)物；3 淮北病人 濾紙血跡瘧原蟲(chóng)DNA模板PCR產(chǎn)物；4 淮北病人濾紙血跡瘧原蟲(chóng)DNA模板PCR產(chǎn)物；5 馬 來(lái)絲蟲(chóng)DNA模板PCR產(chǎn)物；6 馬來(lái)絲蟲(chóng)DNA模板PCR產(chǎn)物(當(dāng)?shù)谝惠哖CR循環(huán)次數(shù)過(guò)多，在 第二輪PCR產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)第一輪PCR的條帶431bp)。圖2是采用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)黃病毒屬病毒(乙型腦炎病毒、登革熱病毒1-4 型、黃熱病毒)；M =DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker I ；K 陰性對(duì)照(ddH20PCR產(chǎn)物)；1 乙型腦炎病毒cDNA 模板PCR產(chǎn)物(當(dāng)?shù)谝惠哖CR循環(huán)次數(shù)過(guò)多，在第二輪PCR產(chǎn)物中會(huì)出現(xiàn)第一輪PCR的條
8帶260bp) ；2 乙型腦炎病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；3 乙型腦炎病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；4 乙型腦炎病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；5 登革熱I型病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；6 登革熱II型 病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；7 登革熱III型病毒cDNA模板PCR產(chǎn)物；8 登革熱IV型病毒cDNA 模板PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式下面實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。下面實(shí)施例中采用的樣本、動(dòng)物及試劑如下感染馬來(lái)絲蟲(chóng)的蚊蟲(chóng)樣品來(lái)自中國(guó)疾控中心寄生蟲(chóng)研究所，蚊蟲(chóng)黃病毒屬病毒培 養(yǎng)液來(lái)自第二軍醫(yī)大學(xué)流行病教研室，斯氏按蚊第二軍醫(yī)大學(xué)原生物教研室飼養(yǎng)，惡性瘧 原蟲(chóng)樣本為本教研室采自云南和海南的瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)品，間日瘧原蟲(chóng)樣本為本教研室采自淮 北間日瘧病人濾紙血樣，約氏瘧原蟲(chóng)為第二軍醫(yī)大學(xué)原生物教研室液氮保存的約氏瘧原蟲(chóng) 樣品，小鼠由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的昆明小白鼠。分子生物學(xué)試劑組織DNA提取試劑盒、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker I (北京天根)，脫 氧核苷三磷酸(dNTP)、ExTaq DNA 聚合酶、Loading buffer (TaKaRa), Quant cDNA 第一鏈合 成試劑盒(QIAGEN)，瓊脂糖(西班牙)，小牛血消蛋白BSA、核酸染料GoodView(北京索萊 寶)，雙蒸水(上海生工)，引物由上海生工合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(50 μ L體系)試劑含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液(含 MgCl2)、特異引物均為10 μ M、dNTP (2. 5mM each)、小牛血清蛋白BSA(5mg/ml)和滅茵雙蒸 水，EXTaq 酶。10倍PCR Buffer的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。實(shí)施例1本發(fā)明一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，含有如下引物1)檢測(cè)黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測(cè)黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第一輪PCR的引物
上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。進(jìn)一步的，所述的黃病毒屬病毒包括乙型腦炎病毒、或者登革熱病毒1型、或者登 革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒4型、西尼羅病毒和黃熱病毒。進(jìn)一步的，所述的瘧原蟲(chóng)屬包括惡性瘧原蟲(chóng)、或者間日瘧原蟲(chóng)、或者諾氏瘧原蟲(chóng)、 或者卵形瘧原蟲(chóng)、或者三日瘧原蟲(chóng)。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中還含有陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。進(jìn)一步的，所述的陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為滅菌ddH20。進(jìn)一步的，所述的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為乙型腦炎cDNA、或者登革熱病毒cDNA、或者間日 瘧原蟲(chóng)DNA、或者惡性瘧原蟲(chóng)DNA。進(jìn)一步的，所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑中各組份為1) 10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液；2)四種脫氧核糖核苷酸，四種脫氧核糖核苷酸的濃度均為2. 5mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的濃度為5mg/ml ；4) EXTaq 酶，EXTaq 酶的濃度為 5U/μ L ；5)滅菌雙蒸水。進(jìn)一步的，所述的10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。進(jìn)一步的，所述的試劑盒中的所有的引物的濃度均為ΙΟμΜ。實(shí)施例2本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)蚊傳病原體的方法，包括一個(gè)提取蚊蟲(chóng)核酸的步驟，還 包括一個(gè)將提取的核酸在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增的步驟，還包括一個(gè)將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電 泳檢測(cè)的步驟，還包括確定蚊傳病原體具體種類(lèi)的測(cè)序步驟。進(jìn)一步的，在一個(gè)將提取的核酸在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增的步驟中，1)檢測(cè)黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測(cè)黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，0137]下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；
0138]4)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第二輪PCR的引物
0139]上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，
0140]下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；
0141]5)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第一輪PCR的引物
0142]上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，
0143]下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；
0144]6)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第二輪PCR的引物
0145]上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，
0146]下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。
0147]實(shí)施例3檢測(cè)蚊蟲(chóng)攜帶瘧原蟲(chóng)屬(惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、諾氏瘧原蟲(chóng)、卵形瘧 原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)和馬來(lái)絲蟲(chóng))的步驟如下描述
0148]a.提取核酸取單只蚊蟲(chóng)(斯氏按蚊)放入1. 5ml離心管中研磨至其被完全碾成 粉末，使用天根DNA提取試劑盒DP304 (北京天根)，按說(shuō)明提取DNA。
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158]
0159]
0160] 0161] 0162] 0163]
b. PCR擴(kuò)增
第一輪PCR條件
IOXBuffer
dNTP (2. 5mM)
BSA(5mg/ml)
FP(IOyM)
RP(IOyM)
DNA模板
EXTaq
ddH20
PCR循環(huán)參數(shù) 1. 94 0C
5 μ L 4μ L 1 μ L
各IyL(絲蟲(chóng)瘧原蟲(chóng)第-各IyL(絲蟲(chóng)瘧原蟲(chóng)第-1. 5μ L 0. 4μ L(2U) 34. 1 μ L
“輪PCR引物) -輪PCR引物)
0164] 5
94 0C 56 0C 72 0C
4Min 25Sec 20Sec 50Sec
go to step 2 29_33times
5Min
0165]6. 72 °C
0166]第二輪PCR條件
0167]IOXBuffer
0168]dNTP (25mM)
0169]BSA(5mg/ml)
0170]FP(IOyM)
0171]RP(IOyM)
0172]DNA模板(第一輪PCR產(chǎn)物)
0173]EXTaq
5 μ L 4μ L 1 μ L
各IyL(絲蟲(chóng)瘧原蟲(chóng)第: 各IyL(絲蟲(chóng)瘧原蟲(chóng)第:
1 μ L 0. 4μ L(2U)輪PCR引物) 輪PCR引物)
11
dNTP (2. 5mM)4 μ LBSA(5mg/ml)1 μ LFP :malm(10yM)1 μ LRP :Rcfm9279-9301(10yM)1 μ LcDNA 模板l.OyLEXTaq0. 3μ L(l. 5U)ddH2036. 7μ LPCR循環(huán)參數(shù)1. 94 °C4Min2. 94 °C25Sec3. 53 °C25Sec4. 72 °C30Sec5. go to step 225_30times6. 72 °C5Min第二輪PCR條件IOXBuffer5μ LdNTP (25mM)4 μ LBSA(5mg/ml)1 μ LFP :R9102-9123(10uM)1 μ LRP :Rcfm9279-9301(10yM)1 μ L模板(第一輪PCR產(chǎn)物)IyLEXTaq0. 3μ L(l. 5U)ddH2036. 7 μ Ltotal50 μ LPCR循環(huán)參數(shù)1. 94 °C4Min2. 94 °C25Sec3. 53 °C20Sec4. 72 °C30Sec5. go to step 2 32_34times6. 72 °C5Min上面所述的引物具體為黃病毒屬病毒的第一輪PCR引物特異引物malm 5' -AACATGTTGGGRAARAGAGAGAA-3‘特異弓丨物Rcfm9279-9301:5'-GTGTCCCAKCCKGCKGTRTCATC-3 ‘黃病毒屬病毒的第二輪PCR引物特異引物R9102-9123 :5' -ATYTGGTWYATGTGGYTTGGAG-3‘
特異弓丨物 Rcfm9279-9301:5'-GTGTCCCAKCCKGCKGTRTCATC-3 ‘c.電泳和觀(guān)察配制1. 5-2%的瓊脂糖凝膠，取5-10μ L擴(kuò)增后的樣品，在紫外燈
13下觀(guān)察，檢測(cè)是否有一條約200bp的核酸條帶，如果有一 200bp的核酸條帶，說(shuō)明蚊蟲(chóng)攜帶 黃病毒屬病毒(乙型腦炎病毒、登革熱病毒1-4型、黃熱病毒)，反之則沒(méi)有。若要確定黃病 毒屬病毒的類(lèi)型，割膠純化，以第二輪PCR上游引物測(cè)序(此片斷測(cè)序易成功)，對(duì)于多重黃 病毒屬病毒同時(shí)感染不宜直接測(cè)序的情況，可克隆測(cè)序解決。如圖2所示。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于含有如下引物1)檢測(cè)黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO2所示；2)檢測(cè)黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO4所示；3)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO6所示；4)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO7所示或如SEQ ID NO8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO9所示；5)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第一輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO11所示；6)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO13所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 黃病毒屬病毒包括乙型腦炎病毒、或者登革熱病毒1型、或者登革熱病毒2型、或者登革熱 病毒3型、或者登革熱病毒4型、西尼羅病毒和黃熱病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 瘧原蟲(chóng)屬包括惡性瘧原蟲(chóng)、或者間日瘧原蟲(chóng)、或者諾氏瘧原蟲(chóng)、或者卵形瘧原蟲(chóng)、或者三日 瘧原蟲(chóng)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中還含有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑。
5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中還含有陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。
6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中還含有陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。
7.如權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為滅菌ddH20。
8.如權(quán)利要求6所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品為乙型腦炎cDNA、或者登革熱病毒cDNA、間日瘧原蟲(chóng)DNA、惡性瘧原蟲(chóng)DNA。
9.如權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑中各組份為1)10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液；2)四種脫氧核糖核苷酸，四種脫氧核糖核苷酸的濃度均為2.5mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的濃度為5mg/ml；4)EXTaq 酶，EXTaq 酶的濃度為 5U/ μ L ；5)滅菌雙蒸水。
10.如權(quán)利要求9所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。
11.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，其特征在于所述的 試劑盒中的所有的引物的濃度均為10 μ M。
12.—種檢測(cè)蚊傳病原體的方法，其特征在于包括一個(gè)提取蚊蟲(chóng)核酸的步驟，還包括 一個(gè)將提取的核酸在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增的步驟，還包括一個(gè)將擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢 測(cè)的步驟，還包括確定蚊傳病原體具體種類(lèi)的測(cè)序步驟。
13.如權(quán)利要求12所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的方法，其特征在于 在一個(gè)將提取的核酸在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增的步驟中，1)檢測(cè)黃病毒屬病毒第一輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID Ν0:1所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)檢測(cè)黃病毒屬病毒第二輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 3所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第一輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 5所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)檢測(cè)瘧原蟲(chóng)第二輪PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第一輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID N0:10所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)檢測(cè)馬來(lái)絲蟲(chóng)第二輪PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 12所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO: 13所示。
14.權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒在檢測(cè)乙型腦炎病毒、 或者登革熱病毒1型、或者登革熱病毒2型、或者登革熱病毒3型、或者登革熱病毒4型、或 者西尼羅病毒和黃熱病毒/惡性瘧原蟲(chóng)、或者間日瘧原蟲(chóng)、或者諾氏瘧原蟲(chóng)、或者卵形瘧原 蟲(chóng)、或者三日瘧原蟲(chóng)/馬來(lái)絲蟲(chóng)、或班氏絲蟲(chóng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)蚊傳病原體的多重PCR試劑盒，所述的試劑盒中包括六對(duì)特異的引物，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)蚊傳病原體的方法，采用PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，通過(guò)PCR擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度來(lái)檢測(cè)和鑒定是否存在乙型腦炎病毒、登革熱病毒、黃熱病毒、惡性瘧原蟲(chóng)、惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、諾氏瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)、馬來(lái)絲蟲(chóng)、班氏絲蟲(chóng)等病原體。本發(fā)明能同時(shí)檢測(cè)各種已報(bào)道的蚊傳病原體，以及可能從境外輸入的黃熱病毒和西尼羅病毒，而且快速、準(zhǔn)確、靈敏，本發(fā)明可以應(yīng)用于多種樣品的檢測(cè)，如蚊蟲(chóng)、病人血液、組織液等。本發(fā)明為我國(guó)蚊媒病防治工作提供一種低廉高效的早期監(jiān)測(cè)和發(fā)現(xiàn)蚊媒病流行的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101979665SQ201010508779
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者周正斌, 朱淮民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)