專利名稱：用于熒光定量pcr定量檢測的質(zhì)粒標準品的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及質(zhì)粒。具體地說，本發(fā)明涉及用于熒光定量PCR定量檢測的質(zhì)粒標準
背景技術(shù)：
熒光定量PCR最早是在1992年由日本科學家Higuchi報告提出的。是指在PCR 反應體系中加入熒光基團，它在光刺激下釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產(chǎn)物的變化，熒光信號變量和擴增產(chǎn)物變量成正比，并用足夠靈敏的自動化儀器實現(xiàn)對熒光的采集和分析，最后通過標準曲線對未知模板進行分析，以達到對原始模板量定量的目的。在實時熒光PCR中，模板的定量有兩種方法絕對定量和相對定量兩大種類 [Walker NJ, J Biochem Mol Toxicol, 2001，15 (3) :121-127]。絕對定量是對未知樣品的絕對量(拷貝數(shù))進行測定的方法；而相對定量，并不是測定基因的絕對量，而是分別測定目的基因和內(nèi)參基因的量，再根據(jù)內(nèi)參的量對目的基因量進行歸一化處理，最后再進行樣品間相對量的比較。絕對定量解析方法是使用已知濃度的標準品制作標準曲線，對未知濃度的樣品進行絕對量(拷貝數(shù))測定的方法。所以，絕對量(拷貝數(shù))已知并含有未知樣品序列的標準品是必要的。為了保持與實際檢測樣品間的擴增效率的一致性，標準品應盡量選擇與實際檢測樣品結(jié)構(gòu)近似的樣品。經(jīng)驗證質(zhì)粒標準分子在GMO鑒定檢測中是很好的標準陽性物質(zhì)替代物。質(zhì)粒分子的優(yōu)點主要是可以通過微生物進行大量培養(yǎng)，DNA易于擴增，所以可提供無限穩(wěn)定量的標準物質(zhì)，并且純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因，經(jīng)濟又高效。甚至有學者將質(zhì)粒標準分子稱為“金標準物質(zhì)”。制作標準曲線首先必須準備4-6個梯度稀釋的標準品，然后將這些標準品作為模板進行Real Time PCR反應，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板濃度的對數(shù)值之間存在的線性關系，就能夠制作出標準曲線。盡管腫瘤發(fā)病的分子機制尚未完全闡明，但相關基因的遺傳學改變的積累是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因，這一點已得到普遍承認。癌基因的表達增加和突變在許多腫瘤早期和良性階段就可出現(xiàn)。熒光定量PCR不但能有效地檢測基因的突變，而且能準確測定表達量， 據(jù)此進行腫瘤早期診斷，治療和預后判斷。對某些癌基因的遺傳學變化的檢測幾乎達到了確診腫瘤的程度。本試驗所用熒光定量PCR質(zhì)粒載體具有以下優(yōu)點1.制作處理過程簡便，實驗周期短，實驗操作易于標準化。2.價格適中，易于推廣。3.定量準確，這是本試劑方法最獨特的優(yōu)點。通過實時熒光PCR擴增曲線參數(shù)，定量測定樣本中基因拷貝數(shù)。4.減少人為實驗誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供可供基因突變檢測、表達量檢測及基因擴增檢測的陽性標準品。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)(1)構(gòu)建一種質(zhì)粒載體，其特征在于包括被檢測的基因序列。(2)上述(1)所述的質(zhì)粒載體，其選自TA克隆載體，優(yōu)選為pMDIS-T。(3)上述(1)所述的質(zhì)粒載體，被檢測的目的基因被整合到載體中。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明實施例2所用質(zhì)粒對照品構(gòu)建方法示意圖。圖2是本發(fā)明實施例2質(zhì)粒圖譜，箭頭所指即為載體中插入基因PCR產(chǎn)物序列的位置。圖3是本發(fā)明實施例2的野生型質(zhì)粒標準品測序結(jié)果圖，其中圖A是EGFR 18外顯子2155G野生型質(zhì)粒測序圖，圖B是EGFR19外顯子22；35_2249位、2236-2250位、2254-2277 位野生型質(zhì)粒測序圖，圖C是EGFR 21外顯子2573位T野生型質(zhì)粒測序圖。圖4是本發(fā)明實施例2的突變型質(zhì)粒標準品測序結(jié)果圖，箭頭所指為堿基突變位點。其中圖A是EGFR 18外顯子2155G —A突變質(zhì)粒測序圖，圖B是EGFR 19外顯子 2235-2249位缺失突變質(zhì)粒測序圖，圖C是EGFR 19外顯子2236-2250位缺失突變質(zhì)粒測序圖，圖D是EGFR 19外顯子22M-2277位缺失突變質(zhì)粒測序圖，圖E是EGFR 21外顯子第 21外顯子2573位T — G突變質(zhì)粒測序圖。圖5是本發(fā)明實施例IRAS野生型質(zhì)粒測序圖。圖6是本發(fā)明實施例3突變型質(zhì)粒標準品測序結(jié)果圖，箭頭所指為堿基突變位點。 其中圖A是KRAS 12密碼子GGT —GTT突變質(zhì)粒測序圖，圖B是KRAS 12密碼子GGT —AGT 突變質(zhì)粒測序圖，圖C是KRAS12密碼子GGT — GAT突變質(zhì)粒測序圖，圖D是KRAS 12密碼子GGT — TGT突變質(zhì)粒測序圖，圖E是KRAS 13密碼子GGC — GAC突變質(zhì)粒測序圖。圖7是本發(fā)明實施例4BCRP野生型質(zhì)粒測序圖。圖8是本發(fā)明實施例4突變型質(zhì)粒標準品測序結(jié)果圖，箭頭所指為堿基突變位點。 其中圖A是BCRP 482密碼子AGG —GGG突變質(zhì)粒測序圖，圖B是BCRP 482密碼子AGG — ACG 突變質(zhì)粒測序圖。圖9是本發(fā)明實施例5BRAF野生型質(zhì)粒測序圖。圖10是本發(fā)明實施例5突變型質(zhì)粒標準品測序結(jié)果圖，箭頭所指為堿基突變位
點ο圖11是本發(fā)明實施例6ERCC1表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖12是本發(fā)明實施例7RRM1表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖13是本發(fā)明實施例8BRCA1表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖14是本發(fā)明實施例9TUBB3表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖15是本發(fā)明實施例10ERBB3表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖16是本發(fā)明實施例11T0P2A表達量檢測質(zhì)粒測序圖。
圖17是本發(fā)明實施例12TYMS表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖18是本發(fā)明實施例13RAP-80表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖19是本發(fā)明實施例14VEGFR1表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖20是本發(fā)明實施例15VEGFR2表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖21是本發(fā)明實施例16HER2表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖22是本發(fā)明實施例17EGFR表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖23是本發(fā)明實施例18VEGF表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖M是本發(fā)明實施例19PPN表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖25是本發(fā)明實施例20CCNB2表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖沈是本發(fā)明實施例2IACTB表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖27是本發(fā)明實施例2218S rRNA表達量檢測質(zhì)粒測序圖。圖28是本發(fā)明實施例23HER2基因擴增檢測質(zhì)粒測序圖。圖四是本發(fā)明實施例24ACTB基因擴增檢測質(zhì)粒測序圖。圖30是本發(fā)明實施例25的質(zhì)粒標準品擴增曲線圖其中圖Al是EGFR 18外顯子 2155G野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A2是EGFR 19外顯子2235-2249位、2236-2250位、 2254-2277位野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A3是EGFR 21外顯子2573位T野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A4是EGFR 18外顯子2155G — A突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A5是EGFR 19外顯子2235-2249位缺失突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A6是EGFR 19外顯子2236-2250 位缺失突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A7是EGFR 19外顯子22M-2277位缺失突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A8是EGFR 21外顯子2573位T — G突變質(zhì)粒標準品擴增曲線；圖Bl是 KRAS野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖B2是KRAS 12密碼子GGT — GTT突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖B3是KRAS 12密碼子GGT —AGT突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖B4是KRAS 12密碼子GGT — GAT突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖B5是KRAS 12密碼子GGT — TGT突變質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖B6是KRAS 13密碼子GGC — GAC突變質(zhì)粒標準品擴增曲線；圖Cl是BCRP 野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖C2是BCRP482密碼子AGG — GGG突變質(zhì)粒標準品擴增曲線， 圖C3是BCRP 482密碼子AGG — ACG突變質(zhì)粒標準品擴增曲線；圖Dl是BRAF野生型質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖D2是BRAF 600密碼子GTG — GAG突變質(zhì)粒標準品擴增曲線。圖31是根據(jù)圖30繪制的標準曲線圖其中圖Al是EGFR 18外顯子2155G野生型質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A2是EGFR 19外顯子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A3是EGFR 21外顯子2573位T野生型質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A4是EGFR 18外顯子2155G — A突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A5是EGFR19外顯子 2235-2249位缺失突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A6是EGFR 19外顯子2236-2250位缺失突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A7是EGFR 19外顯子22M-2277位缺失突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A8是EGFR 21外顯子2573位T — G突變質(zhì)粒標準品標準曲線；圖Bl是KRAS野生型質(zhì)粒標準品標準曲線，圖B2是KRAS 12密碼子GGT — GTT突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖B3 是KRAS 12密碼子GGT —AGT突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖B4是KRAS 12密碼子GGT —GAT 突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖B5是KRAS 12密碼子GGT — TGT突變質(zhì)粒標準品標準曲線， 圖B6是KRAS 13密碼子GGC — GAC突變質(zhì)粒標準品標準曲線；圖Cl是BCRP野生型質(zhì)粒標準品標準曲線，圖C2是BCRP 482密碼子AGG — GGG突變質(zhì)粒標準品標準曲線，圖C3是BCRP 482密碼子AGG — ACG突變質(zhì)粒標準品標準曲線；圖Dl是BRAF野生型質(zhì)粒標準品標準曲線，圖D2是BRAF 600密碼子GTG — GAG突變質(zhì)粒標準品標準曲線。圖32是本發(fā)明實施例25檢測的組織樣本EGFR 21外顯子2573位野生型(圖Al) 與T —G置換突變型(圖A2)熒光定量PCR擴增曲線圖，組織樣本EGFR 19外顯子野生型 (圖A3)與2235-2M9位缺失突變型(圖A4)熒光定量PCR擴增曲線圖，全血樣本EGFR 19外顯子2236-2250位缺失突變型(圖似)熒光定量PCR擴增曲線圖，全血樣本EGFR 2254-2277 位缺失突變型(圖A6)熒光定量PCR擴增曲線圖，細胞系樣本EGFR 18外顯子2155位野生型(圖A7)與G —A置換突變型(圖A8)熒光定量PCR擴增曲線圖；石蠟包埋組織樣本 KRAS 12密碼子野生型(圖Bi)與GGT —TGT突變型(圖B2)熒光定量PCR擴增曲線圖，新鮮組織樣本KRAS 12密碼子野生型(圖似)與GGT — GTT突變型(圖B4)熒光定量PCR擴增曲線圖，全血樣本13密碼子野生型(圖B5)與GGC — GAC突變型(圖B6)熒光定量PCR 擴增曲線圖，細胞系樣本KRAS 12密碼子野生型(圖B7)與GGT — AGT突變型(圖B8)熒光定量PCR擴增曲線圖；石蠟包埋組織樣本BCRP 482密碼子野生型(圖Cl)與AGG — GGG 突變型(圖以)熒光定量PCR擴增曲線圖，新鮮組織樣本BCRP 482密碼子野生型(圖C3) 與AGG — ACG突變型(圖C4)熒光定量PCR擴增曲線圖，全血樣本BCRP 482密碼子野生型 (圖C5)與AGG —ACG突變型(圖C6)熒光定量PCR擴增曲線圖，細胞系樣本BCRP 482密碼子野生型(圖C7)與AGG —GGG突變型(圖C8)熒光定量PCR擴增曲線圖；石蠟包埋組織樣本BRAF 600密碼子野生型(圖Dl)與GTG — GAG突變型(圖D2)熒光定量PCR擴增曲線圖，新鮮組織樣本BRAF 600密碼子野生型(圖D3)與GTG — GAG突變型(圖D4)熒光定量PCR擴增曲線圖，全血樣本BRAF 600密碼子野生型(圖D5)與GTG — GAG突變型(圖 D6)熒光定量PCR擴增曲線圖，細胞系樣本BRAF 600密碼子野生型(圖D7)與GTG — GAG 突變型(圖D8)熒光定量PCR擴增曲線圖。圖33是本發(fā)明實施例沈的質(zhì)粒標準品擴增曲線圖其中圖Al是ERCCl質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A2是RRMl質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A3是BRCAl質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A4 是TUBB3質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A5是ERBB3質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A6是T0P2A質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A7是TYMS質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖Al是ERCCl質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖 A8是RAP-80質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A9是VEGFRl質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖AlO是VEGFR2 質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖All是HER2質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A12是EGFR質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A13是VEGF質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A14是PPN質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A15是 CCNB2質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A16是ACTB質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖A17是18S rRNA質(zhì)粒標準品擴增曲線。圖34是根據(jù)圖33繪制的標準曲線圖其中圖Al是ERCCl質(zhì)粒標準品標準曲線， 圖A2是RRMl質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A3是BRCAl質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A4是TUBB3質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A5是ERBB3質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A6是T0P2A質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A7是TYMS質(zhì)粒標準品標準曲線，圖Al是ERCCl質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A8是RAP-80 質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A9是VEGFRl質(zhì)粒標準品標準曲線，圖AlO是VEGFR2質(zhì)粒標準品標準曲線，圖All是HER2質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A12是EGFR質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A13 是VEGF質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A14是PPN質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A15是CCNB2質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A16是ACTB質(zhì)粒標準品標準曲線，圖A17是18S rRNA質(zhì)粒標準品標準曲線。圖35是本發(fā)明實施例沈檢測的樣本基因擴增曲線圖，從左到右依次是18S rRNA、 ACTB, ERCCl、TYMS, RRMl、BRCAl、TUBB3、T0P2A、PPN、VEGF, EGFR、CCNB2、VEGFRl、RAP-80、 HER2、ERBB3、VEGFR2基因的擴增曲線。圖36是本發(fā)明實施例27的標準品擴增曲線圖，其中圖A是HER2質(zhì)粒標準品擴增曲線，圖B是ACTB質(zhì)粒標準品擴增曲線。圖37是根據(jù)圖36繪制的標準曲線圖，其中圖A是HER2質(zhì)粒標準曲線，圖B是ACTB 質(zhì)粒標準曲線，圖38是本發(fā)明實施例27的樣本基因擴增曲線圖，其中圖A是石蠟包埋組織HER2 擴增曲線圖，圖B是新鮮組織HER2擴增曲線圖；圖C是石蠟包埋組織ACTB擴增曲線圖，圖 D是新鮮組織ACTB擴增曲線圖。
實施例以下的實施例用于為本領域中的普通技術(shù)人員提供有關如何實施和使用本發(fā)明的完整披露和描述，并且這些例子并非意在對發(fā)明人所認為的發(fā)明范圍進行限制，亦非意指下文的實驗是被實施的全部實驗而且是僅可實施的實驗。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南第三版(SambrookJ.)，或按照廠商所建議的條件。糕· 1胞鋼中_織、、外胤血、€__龍_耳沾準
備IDNA 或 RNA 提取可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的核酸提取試劑盒提取樣本核酸，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量測量儀檢測所提核酸濃度與純度DNA :0D260/0D280 = 1. 8士0. 1，0D260/0D230 = 2. 0士0. 1 ；RNA :0D260/0D280 = 2. 0士0. 1，0D260/0D230 = 2. 0士0. 1。2cDNA 合成逆轉(zhuǎn)錄采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行，步驟和反應體系如表1 表1 逆轉(zhuǎn)錄體系(10 μ 1)與步驟
權(quán)利要求
1.一種熒光定量PCR檢測用的質(zhì)粒標準品，其特征在于，質(zhì)粒的載體為pMDIS-T，并且質(zhì)粒的插入片段，為以下(1)-(4)中任一種待檢測的基因序列，分別用來檢測對應基因的突變情況(1)EGFR18、19、21 外顯子；(2)KRAS 12、13 密碼子；(3)BCRP 482位氨基酸；(4)BRAF 600位氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，質(zhì)粒的插入片段為(1)SEQID NO :209,SEQ ID NO :210、SEQ ID NO :211、SEQ ID NO :212,SEQ ID NO :213, SEQ ID NO :214, SEQ ID NO :215, SEQ ID NO :216 ;(2)SEQID NO :217,SEQ ID NO :218,SEQ ID NO :219,SEQ ID NO :220、SEQ ID NO :221, SEQ ID NO 222 ；(3)SEQID NO :223,SEQ ID NO :224,SEQ ID NO :225 ;(4)SEQID NO :226,SEQ ID NO :227。
3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，制備與檢測質(zhì)粒的引物為(1)SEQID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ IDNO : 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID N0:21、SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23 ;(2)SEQ ID NO :25, SEQ ID NO :26, SEQ ID NO :27, SEQ ID NO :28, SEQ ID NO :29, SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、 SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37, SEQ ID NO :38 ；(3)SEQID NO :40,SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42,SEQ ID NO :43,SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45, SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :49 ；(4)SEQID NO :51、SEQ ID NO :52,SEQ ID NO :53,SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55,SEQ ID NO :56。
4.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，檢測質(zhì)粒的探針為(1)SEQID NO :133,SEQ ID NO 134、SEQ ID NO 135,SEQ ID NO 136,SEQ ID N0:137、 SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ IDNO : 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO :143, SEQ ID NO :144, SEQ ID NO :145, SEQ ID NO :146, SEQ ID NO :147, SEQ ID NO 148 ；(2)SEQID NO :149,SEQ ID NO :150,SEQ ID NO :151,SEQ ID NO :152,SEQ ID NO :153, SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ IDNO : 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO : 159、SEQ ID NO :160 ；(3)SEQID N0:161、SEQ ID NO : 162、SEQ ID NO :163,SEQ ID NO :164,SEQ ID NO :165, SEQ ID NO 166 ；(4)SEQID NO :167,SEQ ID NO :168,SEQ ID NO :169,SEQ ID N0:170。
5.一種熒光定量PCR檢測用的質(zhì)粒標準品，其特征在于，質(zhì)粒的載體為pMD18-T，并且質(zhì)粒的插入片段，為以下(1)-(17)中任一種待檢測的基因序列，分別用來檢測對應基因的表達量情況(1)ERCClmRNA ；(2)RRMlmRNA ；(3)BRCAlmRNA ；(4)TUBB3mRNA ；(5)ERBB3mRNA ；(6)T0P2AmRNA ；(7)TYMSmRNA ；(8)RAP-80mRNA ；(9)VEGFRlmRNA ；(10)VEGFR2mRNA ；(11)HER2mRNA ；(12)EGFRmRNA ；(13)VEGFmRNA ；(14)PPNmRNA (15)CCNB2mRNA ；(16)ACTBmRNA ；(17)18SrRNA。
6.如權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，質(zhì)粒的插入片段為(1)SEQID NO 228 ；(2)SEQID NO 229 ；(3)SEQID NO 230 ；(4)SEQID NO 231 ；(5)SEQID NO 232 ；(6)SEQID NO 233 ；(7)SEQID NO 234 ；(8)SEQID NO 235 ；(9)SEQID NO 236 ；(10)SEQID NO 237 ；(11)SEQID NO 238 ；(12)SEQID NO :239 ；(13)SEQID NO :240 ；(14)SEQID NO :241 ；(15)SEQID NO :242 ；(16)SEQID NO :243 ；(17)SEQID NO :244。
7.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，制備與檢測質(zhì)粒的引物為(1)SEQID NO 57,SEQ ID NO58,SEQ ID NO 59,SEQ ID NO 60 ；(2)SEQID NO61,SEQ ID NO62,SEQ ID NO63,SEQ ID NO 64 ；(3)SEQID NO :65,SEQ ID NO66,SEQ ID NO67,SEQ ID NO 68 ；(4)SEQ ID NO 69, SEQ ID NO 70, SEQ ID N0:71、SEQ ID NO :72 ；(5)SEQID NO73,SEQ ID NO74,SEQ ID NO75,SEQIDNO 76 ；(6)SEQID NO77,SEQ ID NO 78,SEQ ID NO79,SEQIDNO 80 ；(7)SEQID NO81,SEQ ID NO 82,SEQ ID NO83,SEQIDNO 84 ；(8)SEQID NO85,SEQ ID NO86,SEQ ID NO 87,SEQIDNO 88 ；(9)SEQ ID NO 89, SEQ ID NO 90, SEQ ID N0:91、SEQ ID NO :92 ；(10)SEQID NO93,SEQ ID NO94、SEQ ID NO95,SEQ ID NO 96 ；(11)SEQID NO97,SEQ ID NO98,SEQ ID NO 99,SEQ ID NO :100 ；(12)SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO :104 ;(13)SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO :108 ;(14)SEQ ID NO :109, SEQ ID NO :110, SEQ ID NO =IlUSEQ ID NO :112 ;(15)SEQID NO :112、SEQ ID NO :114、SEQ ID NO :115、SEQ ID NO :116 ;(16)SEQ ID NO :117、SEQ ID NO :118、SEQ ID NO :119、SEQ ID NO :120 ;(17)SEQ ID NO :121, SEQ ID NO :122, SEQ ID NO :123, SEQ ID NO :124。
8.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，檢測質(zhì)粒的探針為(1)SEQID NO :171, SEQ ID NO :172;(2)SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO :174;(3)SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO :176;(4)SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO :178;(5)SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO :180;(6)SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO :182;(7)SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO :184;(8)SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO :186;(9)SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO :188;(10)SEQID NO: 189、SEQ ID NO :190;(11)SEQID NO: 191、SEQ ID NO :192;(12)SEQID NO: 193、SEQ ID NO :194;(13)SEQID NO: 195、SEQ ID NO :196;(14)SEQID NO: 197、SEQ ID NO :198;(15)SEQID NO: 199、SEQ ID NO :200 ;(16)SEQID NO :201、SEQ ID NO :202 ;(17)SEQID NO :203,SEQ ID NO :204。
9.一種熒光定量PCR檢測用的質(zhì)粒標準品，其特征在于，質(zhì)粒的載體為pMDIS-T，并且質(zhì)粒的插入片段，為以下(1)-(17)中任一種待檢測的基因序列，分別用來檢測對應基因的表達量情況分別用來檢測對應基因的基因擴增情況(1)HER2基因組 DNA (2)ACTB基因組 DNA。
10.如權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，質(zhì)粒的插入片段為(1)SEQID NO 245 ；(2)SEQID NO :246ο
11.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，制備與檢測質(zhì)粒的引物為(1)SEQID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO :128 ;(2)SEQID NO :129,SEQ ID NO :130,SEQ ID NO :131,SEQ ID NO :132。
12.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒標準品，其特征在于，檢測質(zhì)粒的探針為(1)SEQID NO :205,SEQ ID NO :206 ；(2)SEQID NO :207,SEQ ID NO :208。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于熒光定量PCR定量檢測的質(zhì)粒標準品。具體地說，本發(fā)明涉及與基因突變、表達量及擴增檢測相關的熒光定量PCR檢測方法中定量檢測需要的質(zhì)粒標準品。
文檔編號C12N15/11GK102453748SQ20101050952
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月18日
發(fā)明者李雋 , 莫敏俐, 許軍普, 陳釗 申請人:北京雅康博生物科技有限公司