專利名稱：一株粘紅酵母及其制備(s)-羥基丙酰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株粘紅酵母以及應(yīng)用該菌種轉(zhuǎn)化 N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生產(chǎn)抗抑郁藥度洛西汀的關(guān)鍵手性中間體(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法。
背景技術(shù)：
度洛西汀是第三代抗抑郁藥，是市場銷售最主要的抗抑郁藥，能有效地抑制5-羥色氨和去甲腎上腺素的再攝取(Wong D T et al. Life ki，1988，43 :2049-2057.)，高效，安全，副作用小，對其他癥狀如全身疼痛和胃腸道紊亂也有療效(Bymaster FP et al. Neuropsychopharmacology,2001,25 :871-880.)。該藥還被批準(zhǔn)用于糖尿病引起的神經(jīng)疼痛以及女性尿失禁的治療(Norton PA et al. Am J Obstet Gynecol，2002，187 :40-48.)。 2007年，其全球銷售額已達到21億美元，較前一年增長60%，2008年，其全球銷售額為30 億美元，市場預(yù)計其銷售額將繼續(xù)大幅增長。度洛西汀含有一個手性中心，研究表明僅⑶構(gòu)型的對映體具有藥物活性。 (S)-度洛西汀的合成關(guān)鍵步驟為(S)構(gòu)型手性醇中間體的獲得。目前對(S)構(gòu)型手性醇中間體的獲得主要通過化學(xué)途徑，但存在諸多問題，如化學(xué)拆分需要使用大量的拆分劑，反應(yīng)步驟長，能耗高以及廢物排放量大等；基于過渡金屬手性配體催化氫化體系，由于產(chǎn)品光學(xué)純度不高以及重金屬殘留等問題，導(dǎo)致其難以應(yīng)用于醫(yī)藥中間體的生產(chǎn)。與化學(xué)方法相比，生物催化過程具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，反應(yīng)條件溫和，后處理容易，能耗較低，是一種環(huán)境友好的合成方法，也是當(dāng)今化工生產(chǎn)和相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展一大潮流。其中生物催化不對稱還原已經(jīng)發(fā)展成為全球各大醫(yī)藥公司研發(fā)部門的重要組成部分(Carballeira JD et al. Biotechnology Advances，2009，27 :686-714.)。如先靈葆雅公司系統(tǒng)研究了 300多種菌株催化的數(shù)十種苯基酮為骨架的底物的不對稱還原；默克公司對含氟苯基酮的不對稱還原研究。然而，迄今為止的絕大部分研究集中于苯基酮為骨架的底物，而以雜芳環(huán)酮為骨架的底物研究較少見，其中與度洛西汀手性中間體合成相關(guān)的更是屈指可數(shù)(Wada M, etal. Biosci Biotechnol Biochem，2004，68 1481-1488 ； Sturmer R, et al. US, 2008,0318288A1)。Soni 等人2005年報道的熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis)催化的(S)-度洛西汀關(guān)鍵醇中間體合成，雖然該生物轉(zhuǎn)化在底物濃度為Ig/ 1時，能以高的轉(zhuǎn)化率以及高的對映體過量得到(S)-度洛西汀關(guān)鍵醇中間體，但是該微生物菌株的轉(zhuǎn)化率和對映體過量均會隨著底物濃度的增加而迅速降低，該弊端嚴重阻礙其在(S)-度洛西汀工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用。使用醇脫氫酶進行不對稱還原，如Exiguobacterium sp. F42中的短鏈脫氫酶以及ThermoanaercAacter中的醇脫氫酶，雖然能有效的獲得-度洛西汀關(guān)鍵醇中間體，但這兩種方法必須外加昂貴的輔酶NADH或NADPH，使得 (S)-度洛西汀關(guān)鍵醇中間體的生產(chǎn)成本大大提高，該弊端阻礙這兩種方法在(S)-度洛西汀關(guān)鍵醇中間體工業(yè)生產(chǎn)的應(yīng)用(ada, M. ；Yoshizumi, A. ；Furukawa, Y. ；Kawabata, H.； Ueda, M. ；Takagi, H. ；Nakamori, S.Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004,68 :1481-1488.；Breuer, M. W02007074060A1)。(S) -N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺是(S)-度洛西汀的一種關(guān)鍵醇中間體，目前，尚未有微生物轉(zhuǎn)化制備該關(guān)鍵手性醇中間體的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種粘紅酵母，該菌于2010年7月16日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2010180，分類命名粘紅酵母Iihodotorula glutinis CY12，并利用該菌具有生產(chǎn)高活力、高對映選擇性的羰基還原酶的特性，還原底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺制備光學(xué)純(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺，該( 型產(chǎn)物是合成抗抑郁藥度洛西汀的關(guān)鍵手性中間體。本發(fā)明粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis CY12, CCTCC M 2010180)的篩選方法 利用休止細胞全細胞生物轉(zhuǎn)化的方法，從中科院成都生物研究所保藏的38株微生物中篩選能夠?qū)⒌孜颪-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺轉(zhuǎn)化為(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的菌株，并將轉(zhuǎn)化率最高且對映體過量值大于99%的菌株進行進一步的鑒定。經(jīng)篩選得到本發(fā)明涉及的粘紅酵母CY12。具體方案見實施例1和2。采用上述粘紅酵母作為生物催化劑，轉(zhuǎn)化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。具體方法如下1.菌株培養(yǎng)斜面保存培養(yǎng)基組分為胰蛋白胨1 % ；酵母提取物0. 5% ；NaCl 1 % ；瓊脂粉2% ；酵母培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨0.5% ；酵母提取物0. 15% ；牛肉膏0. 15% ；NaCl 0.5% ；葡萄糖； 以上含量均為質(zhì)量/體積百分比，溶于去離子水，用NaOH調(diào)pH值為7. 0，105kPAa, 121°C，滅菌20分鐘。斜面培養(yǎng)將篩選得到的紅酵母接種于斜面保存培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48 60小時；種子培養(yǎng)將斜面培養(yǎng)的菌株，無菌條件下用接種環(huán)接種于約IOml液體酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24 36小時，制得種子液；搖瓶培養(yǎng)以0.4% 接種量將種子液接入新鮮的酵母液體培養(yǎng)基中，30°C， 230轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)8 48小時。2.收集菌體取步驟(1)搖瓶培養(yǎng)的菌液在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心5 分鐘，收集菌體，并用磷酸鉀緩沖液或磷酸鈉緩沖液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液 (0. 1M，pH 6. 0 8. 0)充分洗滌2次，得到濕菌體作為生物催化劑。3.生物轉(zhuǎn)化實驗將步驟( 中的生物催化劑濕菌體以上述緩沖液配成粘紅酵母細胞濃度為50 300g/l的菌懸液，加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺(底物制備詳見實施例1，底物溶于二甲亞砜)，終濃度為1 30g/l，添加的葡萄糖作為輔酶再生底物。轉(zhuǎn)化條件為20 40°C，轉(zhuǎn)速為200 280轉(zhuǎn)/分，轉(zhuǎn)化時間為4 44小時。4.分離樣品用一倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，用無水硫酸鈉干燥后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸餾去除溶劑乙酸乙酯，最后用2 IOml異丙醇(HPLC^l)充分溶解即為備用檢測樣品。5. HPLC檢測取步驟⑷中1 3μ 1樣品進樣，用普通色譜柱測定N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺及N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的含量，利用手性色譜柱測定(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺及(R)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的含量，最后計算出轉(zhuǎn)化率和ee值。在上述方法中，檢測轉(zhuǎn)化率時色譜柱為hertsil SIL-100A 250X4. 6mm，流動相 正己烷異丙醇=70 30，流速lml/min，N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺和N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滯留時間分別為8. 921和13. 022min ；檢測ee值時手性色譜柱為Daicel Chiralcel 0J-H250 X 4. 6mm，流動相正己烷異丙醇=90 10，流速 0. 5ml/min, (S)-N-甲基_3_羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺和(R)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的滯留時間分別為22. 808和24. 176min。本發(fā)明的催化劑粘紅酵母菌體易于制備，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物收率在90%以上，ee 值99%以上，產(chǎn)物濃度高達27g/l，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。


圖1是N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺標(biāo)樣手性HPLC圖譜。1號峰為 (S) -N-甲基-3-羥基-3- (2-噻吩基)丙酰胺，2號峰為(R) -N-甲基-3-羥基-3- (2-噻吩基)丙酰胺。圖2是實施例25利用粘紅酵母菌體轉(zhuǎn)化底物N-甲基_3_羥基_3_ (2_噻吩基) 丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺時，體系擴大到50ml，轉(zhuǎn)化后的普通HPLC圖譜。1號峰為N-甲基-3-氧-3- (2-噻吩基)丙酰胺，2號峰為N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。圖3是實施例25利用粘紅酵母菌體轉(zhuǎn)化底物N-甲基_3_羥基_3_ (2_噻吩基)丙酰胺生成(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺時，體系擴大到50ml時，轉(zhuǎn)化后的手性HPLC圖譜。1號峰為⑶-N-甲基-3-羥基-3- (2-噻吩基)丙酰胺，2號峰為(R) -N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
具體實施例方式實施例1底物合成
權(quán)利要求
1.一種粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)CY12，保藏號為CCTCC M 2010180。
2.權(quán)利要求1所述粘紅酵母制備(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法， 其特征在于30°C培養(yǎng)粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)CY12CCTCC M 2010180，至 8 48h，離心收集菌體，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌2次后，獲得濕菌體作為生物催化劑，重懸于磷酸鹽緩沖液制成菌懸液，轉(zhuǎn)化體系中加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，并加入的葡萄糖作為輔酶再生底物，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)物(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法， 其特征是所述磷酸鹽緩沖液為磷酸鉀緩沖液或磷酸鈉緩沖液或磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，濃度為0. 1M，pH為6. O 8. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法， 其特征是生物轉(zhuǎn)化的溫度為20 40°C，轉(zhuǎn)速為200 280轉(zhuǎn)/分，轉(zhuǎn)化時間為4 44小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法，其特征是轉(zhuǎn)化體系中粘紅酵母細胞濃度以濕重計為50 300g/l，底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺濃度為1 30g/l。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株粘紅酵母以及應(yīng)用該菌種轉(zhuǎn)化N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺生產(chǎn)抗抑郁藥度洛西汀的關(guān)鍵手性中間體(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺的方法。本發(fā)明粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)CY12，保藏號為CCTCCM2010180。用本發(fā)明粘紅酵母在30℃溫度下培養(yǎng)8~48小時，離心收集菌體，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌2次后，獲得濕菌體作為生物催化劑，重懸于磷酸鹽緩沖液制成菌懸液，轉(zhuǎn)化體系中加入底物N-甲基-3-氧-3-(2-噻吩基)丙酰胺，并加入1%的葡萄糖作為輔酶再生底物，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化獲得產(chǎn)物(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺。本發(fā)明粘紅酵母菌體易于制備，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物收率高，易于工業(yè)化。
文檔編號C12P13/02GK102443547SQ20101050982
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者劉章琴, 吳中柳, 張超, 楊濤, 林暉, 湯傳根 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所