專利名稱：表達(dá)趨化因子受體ccr5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)多發(fā)性硬化癥有治療作用的神經(jīng)干細(xì)胞，具體是涉及一種表達(dá)趨化 因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞及制備方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cell,NSCs)的發(fā)現(xiàn)與成功分離，是20世紀(jì)末神經(jīng)生物 學(xué)領(lǐng)域最重要的進(jìn)展之一(參照參考文獻(xiàn))。成年動(dòng)物與人體內(nèi)的NSCs存在于側(cè)腦室周圍 和海馬齒狀回等區(qū)域，具有自我更新及分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等多 種潛能。多年來(lái)學(xué)者們一直尋求分離、擴(kuò)增這些NSCs的方法，以用于替代、修復(fù)缺損的神經(jīng) 細(xì)胞，治療阿爾茨海默病、帕金森氏病、多發(fā)性硬化和脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，但因取材 困難、損傷較大而降低了臨床治療的可行性；胚胎來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞無(wú)法回避免疫排斥和 道德倫理等問(wèn)題[1_3]。因此，尋找取材方便、來(lái)源豐富、無(wú)免疫排斥、無(wú)道德倫理困擾的神經(jīng) 干細(xì)胞的新來(lái)源具有重要的意義。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和多分化潛能， 在一定條件下可分化為神經(jīng)干細(xì)胞，稱骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(Bone Marrow-NSCs, BM-NSCs) [4_5]。BM-NSCs取材容易，可直接抽取病人骨髓、經(jīng)體外分選而獲得，無(wú)免疫原性，來(lái)源豐富， 是神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)理想的新來(lái)源，因而日漸受到人們的重視。多發(fā)性硬化(multiple sclerosi^MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)?br> 特點(diǎn)的慢性自身免疫性疾病。病灶多發(fā)于腦和脊髓的白質(zhì)，呈多灶性炎性細(xì)胞侵潤(rùn)、脫髓鞘
及神經(jīng)元損傷，可導(dǎo)致感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、意識(shí)和神經(jīng)認(rèn)知等多方面的功能障礙。該病多發(fā)于青壯
年人，復(fù)發(fā)率和致殘率高，是青壯年人非外傷性神經(jīng)殘疾最常見(jiàn)的原因，迄今缺少有效治療
方法[6_7]。近年來(lái)許多學(xué)者用NSCs移植治療MS，取得了一定效果。但移植的NSCs向中樞
炎癥部位的遷移速度較慢，需20-30天才能到達(dá)病變部位[8’9]，因此療效產(chǎn)生緩慢。其重要
原因是NSCs表面缺乏趨化因子受體，不能對(duì)炎癥部位的趨化因子產(chǎn)生有效的趨化反應(yīng)[8’9’ 10,11]
O在MS急性期，CNS炎癥部位產(chǎn)生高水平趨化因子MIP-I α，β，RANTES等，與炎癥 細(xì)胞表面的趨化因子受體CCR5結(jié)合，引起炎細(xì)胞的聚集與激活[1°’"’12]。但NSCs表面只表 達(dá)微量的CCR5，因此不能向炎癥部位快速、大量遷移[8’9 2]。為了加快NSCs的遷移速 度、增強(qiáng)治療效果，我們選擇了趨化因子受體CCR5，將其基因轉(zhuǎn)入BM-NSCs。CCR5的高表達(dá) 使BM-NSCs向CNS病灶區(qū)的遷移速度顯著加快、數(shù)量明顯增多、起效時(shí)間明顯縮短，從而顯 著減輕了 MS發(fā)病早期的脫髓鞘病變，促進(jìn)了髓鞘修復(fù)及神經(jīng)功能的恢復(fù)?？傊?，表達(dá)CCR5的自體骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞不僅可通過(guò)細(xì)胞替代、髓鞘修復(fù)來(lái)治療 MS，而且遷徙能力顯著增強(qiáng)，移植后可快速、有效地發(fā)揮治療作用，成為治療多發(fā)性硬化及 其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種理想的新型干細(xì)胞制劑，具有十分廣闊的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1. Ben-Hur T, Einstein 0, Mizrachi-Kol R, Abramsky 0.2003. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in
3response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia41 :73-80.2. Pluchino SiQuattrini AiBrambilla EiGritti AiSalani G Martino G. 2003. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature 422 :688_694·3. Yang J，Jiang Z，Rostami A，Zhang GX. Adult neural stem cells expressing IL-IOconfer potent immunomodulation and remyelination in experimental autoimmune encephalitis. J Clin Invest. 2009,119 (12) :3678_369L4. Yang J，Rostami A，Zhang GX.Cellular remyelinating therapy in multiple sclerosis. J Neurol Sci. 2009,276(1-2) :1_5·5. Song S，Song S，Zhang H，Sanchez-Ramos J. . 2007. Comparison of neuron-like cells derived from bone marrow stem cells to those differentiated from adult brain neural stem cells. Stem Cells Devl6 :747_756.6. Rudick，RA. Polman CH. 2009. Current approaches to the identification and management of breakthrough disease in patients with multiple sclerosis. Lancet Neurol 8 :545-559.7. Trapp BD, Ransohoff R, Rudick R. 1999. Axonal pathology in multiple sclerosis-relationship to neurologic disability. Curr Opin Neuroll2 :295_302·8.Pluchino S，A QuattriniiE BrambillaiA GrittiiG SalaniiG Dina，R GalliiU Del Carro,S Amadio,A Bergami，R Furlan,G Comi，AL Vescovi and G Martino. (2003). Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature 422:688-94.9.Pluchino S， L Zanotti, B Rossi， E Brambi11a, L Ottoboni, G Salani, M Martinello,A Cattalini,A Bergami，R Furlan，G Comi,G Constantin and G Martino. (2005). Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature 436:266—71.10. Zhang GX, CM Baker, DL Kolson and AM Rostami. (2000). Chemokines and chemokine receptors in the pathogenesis of multiple sclerosis. Mult Scler 6: 3-13.11. Segal BM. (2005). CNS chemokines，cytokines, and dendritic cells in autoimmune demyelination. J Neurol Sci 228:210—4.12.Aloisi F，S Columba-Cabezas，D Franciotta,B Rosicarelli，R Magliozzi, R Reynolds, E Ambrosini, E Coccia，M Salvetti and B Serafini. (2008). Lymphoid chemokines in chronic neuroinflammation. J Neuroimmunol198 106-12.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，是提供一種來(lái)源于骨髓、可表達(dá)趨化因子受體CCR5的 新型神經(jīng)干細(xì)胞及制備方法，用于治療多發(fā)性硬化癥狀及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。釆用的技術(shù)方案是一種表達(dá)趨化因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞，由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[lineage-/⑶117(c-kit)+]經(jīng)體外誘導(dǎo)分化而來(lái)，轉(zhuǎn)染了可表達(dá)CCR5基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒 質(zhì)粒，為轉(zhuǎn)染了可表達(dá)CCR5、由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，作為基因治療的良好載 體，攜帶并有效表達(dá)外源基因CCR5。上述的骨髓充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于成年小鼠骨髓，表達(dá)Nestin與Sox2。一種表達(dá)趨化因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，包括下列步驟步驟一、小鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與鑒定提取4-6周齡C57BL/6小鼠全骨髓細(xì)胞，用微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞分選儀 (Miltenyi Biotec)篩選出間充質(zhì)干細(xì)胞[lineage_/CD117 (c_kit)+]，體外用 bFGF 和 EGF 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。經(jīng)免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測(cè)，證實(shí)為Nestin與S0X2陽(yáng)性表 達(dá)，可鑒定為未分化神經(jīng)干細(xì)胞。步驟二、構(gòu)建CCR5和EGFP共表達(dá)的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞及CCR5表達(dá)的 檢測(cè)?？寺⌒∈驝CR5基因、構(gòu)建共表達(dá)CCR5和EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，由CMV啟動(dòng)子 驅(qū)動(dòng)；以293T細(xì)胞包裝病毒；用病毒上清轉(zhuǎn)染BM-NSCs ；對(duì)照組轉(zhuǎn)染只表達(dá)EGFP的逆轉(zhuǎn)錄 病毒質(zhì)粒。以免疫組化法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR5的表達(dá)，證實(shí)被轉(zhuǎn)染的BM-NSCs可有效表 達(dá) CCR5 禾口 GFP。步驟三、CCR5轉(zhuǎn)基因骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的趨化性實(shí)驗(yàn)微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)是根據(jù)靶細(xì)胞能夠趨化性主動(dòng)遷移，穿過(guò)一定孔徑的濾膜 而設(shè)計(jì)的。濾膜將小室分隔成上下兩部分，BM-NSCs在上面，趨化因子RANTES在下面，并通 過(guò)濾膜形成一定濃度梯度。BM-NSCs則沿著梯度穿過(guò)膜孔，粘附在膜的下面。遷移5h后取 出濾膜染色，并計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果證實(shí)CCR5-BM-NSCs的遷移率顯著高于對(duì)照 組 GFP-BM-NSCs。本發(fā)明提供了一種制備神經(jīng)干細(xì)胞的簡(jiǎn)捷而有效的方法，制備的神經(jīng)干細(xì)胞為MS 患者提供了一種全新的治療方法，也為其它多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來(lái)了新的希望。


圖1為骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(BM-NSCs)的生成與鑒定示圖。圖2為構(gòu)建CCR5與GFP共表達(dá)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染BM-NSCs及CCR5表達(dá)的檢測(cè)示圖。圖3為CCR5轉(zhuǎn)基因骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的趨化性實(shí)驗(yàn)示圖。圖4為CCR5的表達(dá)增強(qiáng)了骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)EAE的治療作用示圖。圖5為CCR5的表達(dá)增強(qiáng)了 BM-NSCs在CNS的遷移能力示圖。圖6為BM-NSCs在CNS的分化與修復(fù)髓鞘作用示圖。圖1是從成年小鼠的腓骨中提取全骨髓細(xì)胞，用微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞分選儀 篩選出 lineage-/CD117(c-kit)+細(xì)胞，以 1. 0X105/ml 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20 μ g/ ml+EGF 20 μ g/ml+2% Β27中培養(yǎng)，每隔3天換液一次。3_5周后誘導(dǎo)形成神經(jīng)干細(xì)胞球。 免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測(cè)，結(jié)果顯示BM-NSCs細(xì)胞球(A)及打散的單個(gè)細(xì)胞(B)都為 Nestin (綠色)和S0X2(紅色)陽(yáng)性，可鑒定為未分化NSCs。藍(lán)色細(xì)胞核DAPI染色。放 大倍數(shù)神經(jīng)球10 X，單細(xì)胞85 X。圖2為是(A)共表達(dá)CCR5與GFP (Lv. CCR5)及只表達(dá)GFP (Lv. GFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒
5載體結(jié)構(gòu)圖，由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；(B)免疫組化法檢測(cè)CCR5的表達(dá)用293T細(xì)胞包裝病毒、 收集72小時(shí)內(nèi)病毒上清液；用濃縮的病毒上清轉(zhuǎn)染BM-NSCs，3天后以免疫組化染色、熒光 顯微鏡檢測(cè)，顯示兩組BM-NSCs都顯著表達(dá)GFP (綠色)，說(shuō)明兩組BM-NSCs都被病毒質(zhì)粒有 效轉(zhuǎn)染，但CCR5 (紅色)只在CCR5-BM-NSCs中顯著表達(dá)，在對(duì)照組BM-NSCs中幾乎不表達(dá)。 放大倍數(shù)85X ； (C)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR5的表達(dá)轉(zhuǎn)染3天后取兩組BM-NSCs，分散成單 細(xì)胞，PBS洗3次，分別加入anti-nestin和anti_CCR5抗體，4°C孵育20min后用流式細(xì)胞 儀檢測(cè)CCR5的表達(dá)。結(jié)果顯示在CCR5-BM-NSCs組中，nestin+/CCR5+細(xì)胞數(shù)高達(dá)82. 5%， 而在對(duì)照組只有7. 1 %，說(shuō)明CCR5轉(zhuǎn)基因BM-NSCs能有效表達(dá)CCR5。圖3為趨化小室中的微孔濾膜將小室分隔成上下兩部分。(A)將轉(zhuǎn)染后5天的 CCR5-BM-NSCs置于趨化小室的上部，以GFP_BM_NSCs為對(duì)照，趨化因子RANTES置于下部， 并形成一定濃度梯度。BM-NSCs則沿著梯度穿過(guò)濾膜孔，附在膜的下面。遷移5h后取濾膜 下表面的細(xì)胞染色(Diff-Quik dye，藍(lán)色)，并計(jì)算穿過(guò)濾膜的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。(B)細(xì)胞遷移 定量分析。結(jié)果證實(shí)CCR5-BM-NSCs組的遷移百分率顯著高于對(duì)照組GFP_BM_NSCs，并呈 RANTES劑量依賴性，說(shuō)明CCR5的表達(dá)顯著增強(qiáng)了 BM-NSCs的遷移能力。*，ρ < 0. 05，**， ρ <0.01。CCR5-BM-NSCs組與GFP-BM-NSCs組比較。實(shí)線箭頭細(xì)胞；虛線箭頭膜孔。圖4雌性C57BL/6小鼠(8_12周)皮下注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白乳化液 (MOG35^55) 200 μ g/ 只誘導(dǎo) EAE 模型，22 天后尾 iv. CCR5_BM_NSCs 和對(duì)照組 GFP-BM-NSCs 各1.5X IO6/只，空白對(duì)照組(Sham-EAE) iv.等量PBS。每日觀察記錄臨床癥狀評(píng)分。結(jié) 果顯示，PBS組呈現(xiàn)典型的EAE疾病進(jìn)程，GFP-BM-NSCs組的病情明顯輕于PBS組，但起效 慢，iv. 18天后才出現(xiàn)明顯治療作用，且治療效果不很理想(最低臨床癥狀評(píng)分0.5士)；而 CCR5-BM-NSCs對(duì)疾病的抑制作用較GFP-BM-NSCs更快更強(qiáng)，iv. 6天后即出現(xiàn)明顯治療作 用，且治療效果顯著增強(qiáng)(最低臨床癥狀評(píng)分0.2士)。*p<0.05，**p<0.01，PBS組與其 它組的比較;#p < 0. 05，CCR5-BM-NSCs 組與 GFP-BM-NSCs 組的比較，η = 8。圖5為靜脈移植2、4、6周后，取腦與脊髓制成冰凍切片，熒光顯微鏡下檢測(cè)病 灶區(qū)(A)腦胼胝體(Corpus callosum), (B)脊髓腹側(cè)角(Ventral), (C)兩組動(dòng)物病灶 區(qū)都可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(靜脈移植的細(xì)胞)；免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，CCR5(紅色)只在 CCR5-BM-NSCs中顯著表達(dá)，在對(duì)照組GFP-BM-NSCs中幾乎不表達(dá)；(D)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析顯示， CCR5-BM-NSCs組進(jìn)入CNS病灶區(qū)的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組GFP-BM-NSCs顯著增多，說(shuō)明CCR5 的表達(dá)顯著增強(qiáng)了 BM-NSCs的遷移能力。*p < 0. 05，**p < 0. 01，CCR5_BM_NSCs組與 GFP-BM-NSCs組在iv.后2、4、6周的比較。圖6為靜脈移植4周后，取腦與脊髓制成冰凍切片，免疫組化檢測(cè)NF-M、GalC, GFAP及Nestin的表達(dá)，電鏡觀察髓鞘修復(fù)與再生。(A)免疫組化、細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明， 與對(duì)照組GFP-BM-NSCs相比，CCR5_BM_NSCs組有更多細(xì)胞分化為GalC+少突膠質(zhì)細(xì)胞(修 復(fù)髓鞘)和NF-M+神經(jīng)元(神經(jīng)元再生)；⑶電鏡檢查結(jié)果顯示，EAE發(fā)病22天時(shí)(EAE Before iv.)，脊髓腹側(cè)角病變區(qū)可見(jiàn)大量脫髓鞘神經(jīng)軸突(虛線箭頭)；iv. PBS 4周后 (Sham-EAE)，脫髓鞘病變進(jìn)行性加重(虛線箭頭)；iv.兩組BM-NSCs 4周后，病變髓鞘得以 明顯修復(fù)，并出現(xiàn)大量薄壁的新生髓鞘(實(shí)線箭頭)，CCR5-BM-NSCs組的新生髓鞘明顯多于 GFP-BM-NSCs組；正常鼠(Naive)的神經(jīng)軸突外包繞著厚壁髓鞘(箭頭)；(C)定量分析結(jié) 果表明，CCR5-BM-NSCs組有髓鞘軸突所占百分率明顯高于對(duì)照組GFP-BM-NSCs，說(shuō)明CCR5的表達(dá)促進(jìn)了髓鞘的修復(fù)與再生。*P < 0. 05,CCR5-BM-NSCs組與GFP_BM_NSCs組的比較； flP < 0. 05, ##p < 0. 01, Sham-EAE 組與兩種 BM-NSCs 治療組的比較，η = 8。
具體實(shí)施例方式一種表達(dá)趨化因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟步驟一、小鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與鑒定(1)骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(BM-NSCs)的生成與培養(yǎng)取8_12周C57BL/6小鼠的腓骨， 提取全骨髓細(xì)胞，用德國(guó)美天旎公司(Miltenyi Biotec)的微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞分選 儀(QuadroMACS S印arator)分兩步篩選出間充質(zhì)干細(xì)胞。首先用系別細(xì)胞去除試劑盒 (Lineage Cell Depletion Kit)去除成熟造血細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、 粒細(xì)胞和紅細(xì)胞以及定向祖細(xì)胞(CD5+，CD45+，CDllb+，Gr-I+, TERl 19+，7/4+)，保留系別 陰性細(xì)胞(lineage-)；再用抗 CD117 抗體(CDl 17 (c_kit)Microbeads)篩選出 lineage-/ CDl 17 (c-kit) + 間充質(zhì)干細(xì)胞，以 1 X 105/ml 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20 μ g/ml+EGF 20μ g/ml+2% Β27中培養(yǎng)，每隔3天換液一次，3_5周后誘導(dǎo)形成神經(jīng)干細(xì)胞球。結(jié)果見(jiàn)圖 1A。(2)取第三代骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞球及打散的單個(gè)細(xì)胞，以抗小鼠Nestin和S0X2抗 體進(jìn)行免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測(cè)。結(jié)果顯示BM-NSCs細(xì)胞球及單個(gè)細(xì)胞都為Nestin 和S0X2陽(yáng)性，可鑒定為未分化NSCs。結(jié)果見(jiàn)圖1A，B。步驟二、CCR5與EGFP共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染BM-NSCs及CCR5表達(dá)的檢測(cè)(圖 2)。(1)克隆小鼠CCR5基因，構(gòu)建可共表達(dá)CCR5與EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒，由 CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；只表達(dá)EGFP的質(zhì)粒作為對(duì)照(圖2A)。(2)以293T細(xì)胞包裝病毒；收集72小時(shí)內(nèi)病毒上清液；用濃縮的病毒上清轉(zhuǎn)染 BM-NSCs。3天后以免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測(cè)，結(jié)果顯示兩組BM-NSCs都顯著表達(dá)GFP， 但CCR5只在CCR5-BM-NSCs中顯著表達(dá)，在對(duì)照組GFP-BM-NSCs幾乎不表達(dá)(圖2B)；轉(zhuǎn) 染3天后取兩組BM-NSCs，分散成單細(xì)胞，PBS洗3次，分別加入anti_nestin和anti_CCR5 抗體，4°C孵育20min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR5的表達(dá)。結(jié)果顯示在CCR5_BM_NSCs組中， nestin+/CCR5+細(xì)胞數(shù)高達(dá)82. 5%，而在對(duì)照組只有7. 1 %，說(shuō)明CCR5轉(zhuǎn)基因BM-NSCs能有 效表達(dá)CCR5 (圖2C)。步驟三、CCR5轉(zhuǎn)基因骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的趨化性實(shí)驗(yàn)(圖3)將BM-NSCs置于趨化小室的上面，趨化因子RANTES在下面，并通過(guò)濾膜形成一定 濃度梯度。37°C，5% CO2孵育5h，BM-NSCs則沿著梯度穿過(guò)膜孔，粘附在膜的下面。取出濾 膜進(jìn)行細(xì)胞染色，并計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果證實(shí)CCR5-BM-NSCs的遷移百分率顯著 高于對(duì)照組GFP-BM-NSCs。見(jiàn)附圖3。動(dòng)物試驗(yàn)1、多發(fā)性硬化動(dòng)物模型的制作與BM-NSCs移植治療(圖4)雌性C57BL/6小鼠(8_12周)皮下注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白乳化液 (MOG35^55)，200 μ g/只，誘導(dǎo)MS動(dòng)物模型(實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)。 22 # M jl iv. CCR5-BM-NSCs, M M jl
7iv. GFP-BM-NSCs各1. 5X IO6個(gè)細(xì)胞/只，觀察、記錄臨床評(píng)分的改變。結(jié)果顯示，PBS組呈 現(xiàn)典型的EAE疾病進(jìn)程，兩個(gè)干細(xì)胞移植組的發(fā)病明顯輕于PBS組；CCR5-BM-NSCs治療組 較GFP-BM-NSCs對(duì)照組起效顯著加快，作用顯著增強(qiáng)。見(jiàn)附圖4。2、BM-NSCs在CNS的遷移能力檢測(cè)(圖5)靜脈移植2、4、6周后，取腦與脊髓制成冰凍切片，熒光顯微鏡下檢測(cè)病灶區(qū)(腦胼 胝體Corpus callosum,脊髓腹側(cè)角Ventral)，可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(綠色)，說(shuō)明靜脈移植的 BM-NSCs已進(jìn)入病變區(qū)；免疫組化結(jié)果顯示，CCR5(紅色)只在CCR5_BM_NSCs中顯著表達(dá)， 在對(duì)照組BM-NSCs中幾乎不表達(dá)；細(xì)胞計(jì)數(shù)定量分析結(jié)果顯示，CCR5-BM-NSCs組進(jìn)入CNS 病灶區(qū)的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組GFP-BM-NSCs明顯著增，說(shuō)明CCR5的表達(dá)顯著增強(qiáng)了 BM-NSCs 的遷移能力。見(jiàn)附圖5。3、BM-NSCs在CNS的分化與修復(fù)髓鞘作用檢測(cè)(圖6)靜脈移植4周后，取腦與脊髓制成冰凍切片，免疫組化檢測(cè)NF-M、GalC, GFAP及 Nestin的表達(dá)，電鏡觀察髓鞘修復(fù)與再生。免疫組化染色、細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明，與對(duì)照 組GFP-BM-NSCs相比，CCR5_BM_NSCs組有更多細(xì)胞分化為GalC+少突膠質(zhì)細(xì)胞(修復(fù)髓鞘) 和NF-M+神經(jīng)元(神經(jīng)元再生)；電鏡檢查結(jié)果顯示，EAE發(fā)病22天時(shí)(EAE Before iv.)， 脊髓腹側(cè)角病變區(qū)可見(jiàn)大量脫髓鞘神經(jīng)軸突；iv. PBS 4周后(Sham-EAE)，脫髓鞘病變進(jìn)行 性加重；iv.兩組BM-NSCs 4周后，病變髓鞘得以明顯修復(fù)，并出現(xiàn)大量薄壁的新生髓鞘， CCR5-BM-NSCs組的新生髓鞘明顯多于GFP-BM-NSCs組；正常鼠(Na'ive)的神經(jīng)軸突外包繞 著厚壁髓鞘；定量分析結(jié)果表明，CCR5-BM-NSCs組有髓鞘軸突所占百分率明顯高于對(duì)照組 GFP-BM-NSCs，說(shuō)明CCR5的表達(dá)促進(jìn)了髓鞘的修復(fù)與再生。見(jiàn)附圖6。
權(quán)利要求
表達(dá)趨化因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[lineage /CD117(c kit)+]經(jīng)體外誘導(dǎo)分化而來(lái)，轉(zhuǎn)染了可表達(dá)CCR5基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，用于治療多發(fā)性硬化癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)趨化因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于所 述的骨髓充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于成年小鼠骨髓，表達(dá)Nestin與S0X2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)趨化因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞，其特征在于所 述的轉(zhuǎn)染了可表達(dá)CCR5基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒為轉(zhuǎn)染了可表達(dá)CCR5、由CMV啟動(dòng)的逆轉(zhuǎn)錄 病毒質(zhì)粒，作為基因治療的良好載體，攜帶并有效表達(dá)外源基因CCR5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)趨化因子受體CCR5的骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法，其 特征在于包括下列步驟步驟一、小鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與鑒定提取4-6周齡C57BL/6小鼠全骨髓細(xì)胞，用微珠標(biāo)記抗體及磁性細(xì)胞分選儀(Miltenyi Biotec)篩選出間充質(zhì)干細(xì)胞[lineage-/CDl 17 (c-kit) +]，體外用bFGF和EGF誘導(dǎo)分化為 神經(jīng)干細(xì)胞；經(jīng)免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測(cè)，證實(shí)為Nestin與S0X2陽(yáng)性表達(dá)，可鑒定為 未分化神經(jīng)干細(xì)胞；步驟二、構(gòu)建CCR5和EGFP共表達(dá)的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞及CCR5表達(dá)的檢測(cè)；克隆小鼠CCR5基因、構(gòu)建共表達(dá)CCR5和EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒，由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)； 以293T細(xì)胞包裝病毒；用病毒上清轉(zhuǎn)染BM-NSCs ；對(duì)照組轉(zhuǎn)染只表達(dá)EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì) 粒；以免疫組化法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CCR5的表達(dá)，證實(shí)被轉(zhuǎn)染的BM-NSCs可有效表達(dá)CCR5 禾口 GFP ；步驟三、CCR5轉(zhuǎn)基因骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的趨化性實(shí)驗(yàn)微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)是根據(jù)靶細(xì)胞能夠趨化性主動(dòng)遷移，穿過(guò)一定孔徑的濾膜而設(shè) 計(jì)的；濾膜將小室分隔成上下兩部分，BM-NSCs在上面，趨化因子RANTES在下面，并通過(guò)濾 膜形成一定濃度梯度；BM-NSCs則沿著梯度穿過(guò)膜孔，粘附在膜的下面，遷移5h后取出濾膜 染色，并計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種骨髓來(lái)源的、表達(dá)趨化因子受體CCR5、可用于治療多發(fā)性硬化癥的新型神經(jīng)干細(xì)胞的制備方法及用途。具體涉及骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的生成與鑒定、外源基因CCR5的導(dǎo)入及對(duì)多發(fā)性硬化癥的治療作用。骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新及分化為神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力，且取材容易，來(lái)源豐富，無(wú)免疫原性，是一種理想的神經(jīng)干細(xì)胞的新來(lái)源；同時(shí)還可攜帶并有效表達(dá)外源基因CCR5，顯著增強(qiáng)其向中樞病變區(qū)的遷移能力，使療效明顯提高，為多發(fā)性硬化及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一種全新的神經(jīng)干細(xì)胞制劑。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101979510SQ20101051111
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者徐志立, 李云興, 楊靜嫻, 梁文波, 王東, 閆宇輝, 陶小軍 申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)