專利名稱：一種用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度的試劑及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及培養(yǎng)基檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度的試劑及 試齊U盒。
背景技術(shù)：
微生物培養(yǎng)基是微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。在醫(yī)藥及食品檢驗(yàn)過程中， 常要對(duì)培養(yǎng)基的靈敏度及適用性進(jìn)行檢查。如中國(guó)藥典規(guī)定要用無菌檢查法檢查藥品、醫(yī) 療器具、原料、輔料、及相關(guān)物品是否染菌，檢查所用的培養(yǎng)基應(yīng)符合藥典規(guī)定的靈敏度要 求。中國(guó)藥典還規(guī)定要用微生物限度檢查法來檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生 物污染的程度。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌數(shù)。另外，當(dāng)進(jìn)行產(chǎn)品的 微生物限度檢查時(shí)，還要進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法是 否適合于該產(chǎn)品的微生物數(shù)量測(cè)定。進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)所用培養(yǎng)基，無論是成品培養(yǎng) 基、脫水培養(yǎng)基、還是按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基，均應(yīng)在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性 檢查。中國(guó)藥典規(guī)定進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代(從 菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代)；菌液制備時(shí)應(yīng)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種 用0. 9%的無菌氯化鈉溶液稀釋成每Iml含50 IOOcfu菌數(shù)(或孢子數(shù))的菌懸液；菌 懸液若在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2 8°C可在24小時(shí)內(nèi)使用；適用性檢 查時(shí)，取50 IOOcfu的菌液，注入無菌平皿中，立即傾注相應(yīng)的培養(yǎng)基，混勻，凝固后置合 適溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間，計(jì)數(shù)。在實(shí)際工作中檢驗(yàn)人員常會(huì)遇到很多問題。首先，菌懸液的稀釋度很難掌握。藥 典規(guī)定要配置Iml含50 IOOcfu菌數(shù)(或孢子數(shù))的菌懸液，若用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，雖 然快速方便，但計(jì)數(shù)不僅困難且得到的是總菌數(shù)，不僅包括活的微生物，也包括了死亡的微 生物，因此常與平板培養(yǎng)的菌落形成單位(colony forming unit,cfu)不一致；若用平板活 菌計(jì)數(shù)法，需要培養(yǎng)后才能計(jì)數(shù)，培養(yǎng)細(xì)菌至少需要12小時(shí)，培養(yǎng)生長(zhǎng)較慢的酵母菌或霉 菌則需要更長(zhǎng)的時(shí)間。雖然菌懸液在2 8°C下保存允許在24小時(shí)內(nèi)使用，但很難保證菌 數(shù)完全一致，而且平板計(jì)數(shù)完全落在50 IOOcfu的可能性較小，常還需要進(jìn)行再一次稀釋 調(diào)整濃度，操作繁瑣，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)。其次，菌懸液的可保存時(shí)間較短。同一批稀釋液即使在 2 8°C保存，最多只能使用24小時(shí)，若要在24小時(shí)后使用，必須重新培養(yǎng)菌液，重新稀釋， 重新計(jì)數(shù)，不僅麻煩，而且浪費(fèi)大量財(cái)力、物力和人力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度的試劑，利用該試劑可以實(shí)行快速檢 測(cè)，解決了傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)的問題。一種用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度的試劑，包括獨(dú)立分裝的A組分和B組分，其中A組分 為由含菌體和菌體保護(hù)劑的第一水溶液經(jīng)真空冷凍干燥制成的凍干物，B組分為含能讓菌
3體維持休眠狀態(tài)的穩(wěn)定劑的第二水溶液。所述的菌體位金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、 生孢梭菌、白色念珠菌或黑曲霉。所述的菌體保護(hù)劑主要用于防止菌體在凍干過程中死亡，一般選擇脫脂奶粉、海 藻糖、蔗糖、甘露醇、牛血清、甘油、甘氨酸和可溶性淀粉中的一種或多種。菌體保護(hù)劑與菌 體制成水溶液的目的是為了使它們混合均勻，所以菌體保護(hù)劑的用量可以根據(jù)實(shí)際需要調(diào) 整，只要能夠使它溶解即可。所述的菌體保護(hù)劑由在第一水溶液中重量百分比濃度分別為0 10%的脫脂奶 粉、0 5%的海藻糖、0 5%的蔗糖、0 8%的甘露醇、0 10%的牛血清、0. 5 5%的 甘油、0. 1 0. 5%的甘氨酸和0 5%的可溶性淀粉構(gòu)成。更優(yōu)選的，由在第一水溶液中重 量百分比濃度分別為5 8%的脫脂奶粉、2 3%的海藻糖、2 3%的蔗糖、2 5%的甘 露醇、5 8%的牛血清、1 3%的甘油、0. 2 0. 3%的甘氨酸和2 3%的可溶性淀粉。所述的第一水溶液中菌體濃度為4000 85000cfu/ml，當(dāng)選擇60 μ 1的第一水溶 液進(jìn)行真空冷凍干燥后，制備成的A組分溶解在5ml第二水溶液中時(shí)，所得菌體濃度剛好符 合藥典檢測(cè)的要求。所述的凍干物為球狀，含水量不超過3%。在制球時(shí)取60 μ 1的第一水溶液注入到 內(nèi)徑為3mm的球形模具中，在低溫下冷凍成型脫模后進(jìn)行真空冷凍干燥。該球狀凍干物在 凍干時(shí)由于凍干物表面積的增加易于干燥，縮短凍干時(shí)間。儲(chǔ)存時(shí)由于球狀凍干物有很好 的剛性，方便保存，不易分散，保持良好的外觀，也有利于凍干物微生物數(shù)量的穩(wěn)定。球狀凍 干物在使用時(shí)易于溶解，不易結(jié)塊，保持溶解后微生物的均一性。所述為穩(wěn)定劑包括滲透壓平衡劑和抗氧化劑，使用抗氧化劑的目的是為了讓菌體 處于一個(gè)無氧的環(huán)境，處于休眠的狀態(tài)而不會(huì)死亡，使用滲透壓平衡劑的目的是為了讓菌 體處于一個(gè)較適宜的滲透壓環(huán)境中。優(yōu)選的，所述的滲透壓平衡劑為蛋白胨與無機(jī)鹽的混合物，所述的抗氧化劑為巰 基乙酸鈉、維生素C或維生素E。所述的B組分為含有重量百分比濃度為0. 1 0. 9%的氯化鈉、0. 1 0. 5%的磷 酸氫二鈉、0. 1 0. 5%的磷酸二氫鉀、0. 1 1. 0%的蛋白胨和1 5%的巰基乙酸鈉的水 溶液。本發(fā)明還提供了一種包含權(quán)利要求1 9任一所述的試劑用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度 的試劑盒，該試劑盒包括兩個(gè)分別用于分裝A組分和B組分的容器。本發(fā)明試劑可以工業(yè)化生產(chǎn)，利用該試劑進(jìn)行檢測(cè)，省卻了梯度稀釋和計(jì)數(shù)等步 驟，引起雜菌污染的概率大大下降，并可確保微生物數(shù)量精確，達(dá)到藥典規(guī)定的要求，另外 檢測(cè)成本大大降低。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將30微升含250cfu的金黃色葡萄球菌和30微升含重量百分比濃度分別為10% 的脫脂奶粉、3%的海藻糖、5%的蔗糖、5%的甘露醇、5%的牛血清、5%的甘油、0. 的甘 氨酸和5%的可溶性淀粉的水溶液混合，加到內(nèi)徑為3mm的球形模具中，在低溫下冷凍成型
4脫模后進(jìn)行真空冷凍干燥。待水分完全解吸后，密封瓶口，制備成球狀凍干物A，含水量為 1. 0%。將含重量百分比濃度為0. 氯化鈉、0. 磷酸氫二鈉、0. 磷酸二氫鉀、0. 1% 蛋白胨和0. 巰基乙酸鈉的水溶液5ml裝入血清瓶中，封口后在0. IMPa的壓力下滅菌20 分鐘，制備成試劑B。檢測(cè)球狀凍干物A在25°C下保存60天，每隔10天取1瓶測(cè)定其中的金黃色葡 萄球菌數(shù)量，或在4°C下保存18個(gè)月，每隔3個(gè)月取1瓶測(cè)定其中的金黃色葡萄球菌數(shù)量。 金黃色葡萄球菌數(shù)量的測(cè)定用平板活菌計(jì)數(shù)法。結(jié)果見表1。5ml試劑B加至球狀凍干物A后，搖勻，將懸液在2°C下保存，每隔1天測(cè)定懸液中 的活細(xì)胞濃度，金黃色葡萄球菌數(shù)量的測(cè)定用平板活菌計(jì)數(shù)法。結(jié)果見表2。表1.球狀凍干物A的保藏效果(cfu/瓶)
權(quán)利要求
一種用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度的試劑，其特征在于，包括獨(dú)立分裝的A組分和B組分，其中A組分為由含菌體和菌體保護(hù)劑的第一水溶液經(jīng)真空冷凍干燥制成的凍干物，B組分為含能讓菌體維持休眠狀態(tài)的穩(wěn)定劑的第二水溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的菌體保護(hù)劑為脫脂奶粉、海藻糖、蔗 糖、甘露醇、牛血清、甘油、甘氨酸和可溶性淀粉中的一種或多種。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述的菌體保護(hù)劑由在第一水溶液中重量 百分比濃度分別為0 10%的脫脂奶粉、0 5%的海藻糖、0 5%的蔗糖、0 8%的甘露 醇、0 10%的牛血清、0. 5 5%的甘油、0. 1 0. 5%的甘氨酸和0 5%的可溶性淀粉構(gòu) 成。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，所述的菌體保護(hù)劑由在第一水溶液中重量 百分比濃度分別為5 8%的脫脂奶粉、2 3%的海藻糖、2 3%的蔗糖、2 5%的甘露 醇、5 8%的牛血清、1 3%的甘油、0. 2 0. 3%的甘氨酸和2 3%的可溶性淀粉。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的菌體在第一水溶液中的濃度為 4000 85000cfu/mlo
6.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的凍干物為球狀，含水量不超過3%。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑包括滲透壓平衡劑和抗氧化劑。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑，其特征在于，所述的滲透壓平衡劑為蛋白胨與無機(jī)鹽的 混合物，所述的抗氧化劑為巰基乙酸鈉、維生素C或維生素E。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑，其特征在于，所述的B組分為含有重量百分比濃度分別為 0. 1 0. 9%的氯化鈉、0. 1 0. 5%的磷酸氫二鈉、0. 1 0. 5%的磷酸二氫鉀、0. 1 1.0% 的蛋白胨和1 5%的巰基乙酸鈉的水溶液。
10.一種包含權(quán)利要求1 9任一所述的試劑用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)培養(yǎng)基靈敏度的試劑及其試劑盒，該試劑包括獨(dú)立分裝的A組分和B組分，其中A組分為由含菌體和菌體保護(hù)劑的第一水溶液經(jīng)真空冷凍干燥制成的凍干物，B組分為含能讓菌體維持休眠狀態(tài)的穩(wěn)定劑的第二水溶液。本發(fā)明試劑可以工業(yè)化生產(chǎn)，利用該試劑進(jìn)行檢測(cè)，省卻了梯度稀釋和計(jì)數(shù)等步驟，引起雜菌污染的概率大大下降，并可確保微生物數(shù)量精確，達(dá)到藥典規(guī)定的要求，另外檢測(cè)成本大大降低。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK101974607SQ201010518820
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者馮廣青 申請(qǐng)人:馮廣青