專利名稱：一種紫花苜蓿葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，公開了一種紫花苜蓿葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的方法，通過該方法實現(xiàn)了綠色熒光蛋白在紫花苜蓿葉綠體中的表達(dá)。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了舉世矚目的成就。許多經(jīng)過性狀改良如抗病蟲、抗除草劑、品質(zhì)優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因作物新品種相繼問世并得到推廣，給農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來了巨大的推動作用。然而，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)以核基因組轉(zhuǎn)化為主，仍存在一些亟待解決的問題，如外源基因表達(dá)量低甚至沉默、多基因共轉(zhuǎn)化難、存在位置效應(yīng)、具有環(huán)境安全的風(fēng)險等。葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)的出現(xiàn)，為解決以上問題提供了一種有效的途徑。葉綠體是植物細(xì)胞的一種重要細(xì)胞器，它是植物進(jìn)行光合作用的場所，還參與氨基酸、核苷酸、脂肪酸和淀粉等許多物質(zhì)的生物合成過程。葉綠體具有自身的遺傳物質(zhì)，大多數(shù)高等植物葉綠體的基因組大小在120-1601Λ之間，是環(huán)狀裸露的雙鏈DNA分子，其基因的組織和表達(dá)特性與原核生物相似(Plant J，1998/16 (5) //627 732)。葉綠體轉(zhuǎn)化具有多重優(yōu)勢，第一，表達(dá)量高。每個植物細(xì)胞內(nèi)含約有30-100個葉綠體，而每個葉綠體內(nèi)又有100多個基因組拷貝，因此外源基因插入到葉綠體基因組中，可以大大提高外源基因的拷貝數(shù)，從而顯著提高蛋白的表達(dá)量；第二，可以實現(xiàn)外源基因的定點整合。通過同源重組的方法把外源基因插入基因組的特定位置，從而克服位置效應(yīng)；第三，實現(xiàn)多基因的一步轉(zhuǎn)化。由于葉綠體基因表達(dá)具有原核生物基因表達(dá)的特征，可以構(gòu)建多順反子載體，同時完成多個基因的轉(zhuǎn)化；第四，對生態(tài)環(huán)境安全和生物多樣性的風(fēng)險顯著降低。因為絕大多數(shù)植物屬于母性遺傳，葉綠體在細(xì)胞質(zhì)中，此方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物可以避免由花粉引起的基因飄移。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的研究起步較晚，1988年，Boynton等首次用野生型葉綠體DNA 轉(zhuǎn)化了單細(xì)胞生物——衣藻一個突變體(atpB基因突變體)，使其完全恢復(fù)光合作用能力(Science, 1988/M0//1534 1538)，標(biāo)志著葉綠體基因工程的誕生。1990年，Svab等實現(xiàn)了高等模式植物煙草葉綠體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化(PNAS，1990/87//8526 8530)，從而開啟了高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化的新紀(jì)元。到目前為止，除煙草以外，已在擬南芥(Plant Cell Rep, 1998/ 18(1-2)//20 24)、馬鈴薯(The Plant Journal, 1999/19 (2)//209 216)、番茄 (Nature Biotechnology. 2001/19//870 875)、油菜(^Transgenic Research, 2003/12(1) //111 114)、棉花(Plant Molecular Biology, 2004/56//203 216)、甘藍(lán)(Plant Cell R印，2007/26//1733 1744)、胡蘿卜(Plant Physiology, 2004/136//2843 2854)、萵苣 (Plant Molecular Biology, 2005/58 (6)//763 774)、矮牽牛(Transgenic Research, 2004/13// 523 530)、大豆(Plant Molecular Biology，2005/58(5)//659 668)、楊樹(Transgenic Research 2006/15(5)//637 646)、 舌甘菜(Transgenic Research, 2009/18 (1)//17 30)、茄子(Transgenic Res，2010/19//113 119)等植物上獲得了穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)基因植株；另外，在單子葉植物水稻上也獲得了非同質(zhì)化的葉綠體轉(zhuǎn)基因植株(Mol Cells，2006/21(3)//401 410)。豆科植物是人畜主要的蛋白質(zhì)來源，實現(xiàn)豆科植物的葉綠體轉(zhuǎn)化，對于提高豆科植物的育種進(jìn)程具有重要的意義。目前，豆科植物的葉綠體轉(zhuǎn)化僅在大豆上有過成功的報道(Plant Molecular Biology，2005/58 (5)//659 668)。紫花苜蓿是一種優(yōu)良的豆科牧草， 素有“牧草之王”的美稱，對其葉綠體轉(zhuǎn)化的研究對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化紫花苜蓿葉綠體的轉(zhuǎn)基因方法，通過該方法獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白的葉綠體轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿。本發(fā)明提供一種紫花苜蓿葉綠體基因組部分堿基序列(部分激分 2蘇)，見 SEQ ID NO: I0本發(fā)明公開的紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體，其特征在于該載體組合有葉綠體基因組中擴增16S核糖體RNA基因-異亮氨酸轉(zhuǎn)移RNA基因(A6S_trnD片段，丙氨酸轉(zhuǎn)移 RNA基因-23S核糖體RNA基因(片段，綠色熒光蛋白基因&/>)、壯觀霉素抗性基因Caa說)表達(dá)框及多克隆位點片段(^f/7-aa說-MCS)。上述的質(zhì)粒載體，其特征在于-.gfp-aadA-WS片段位于7浴-ira/片段和trnA_23S 片段之間，片段的順序從5’端到3’端依次是d6S-trnI片段、gfp-aadA~MCS片段和 iraUJS片段。上述的質(zhì)粒載體，其特征在于:gfP-aadA-WS片段中，gfp-aadA表達(dá)框是多順反子；其中啟動子是煙草葉綠體16S rRNA操縱子的啟動子ftrn -,gfp基因采用T7噬菌體第 10個基因的核糖體結(jié)合位點IlglO -,aadA基因采用煙草葉綠體核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶大亞基的核糖體結(jié)合位點；終止子采用煙草葉綠體基因的終止子Tr/zsl6。上述的質(zhì)粒載體，其特征在于-.gfp-aadA-WS片段中，多克隆位點MCS的5’端有由煙草煙草葉綠體16S rRNA操縱子的啟動子ftrn和煙草酪蛋白水解酶導(dǎo)肽clpPrbcL所構(gòu)成的融合啟動子ftrnPcIpI^rbcL ；5'端有煙草葉綠體/zs似基因的終止子rXpsbA0本發(fā)明利用上述質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因獲得的紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)化體，其特征在于其宿主為紫花苜蓿，其葉綠體基因組上整合了綠色熒光蛋白基因gf/7和壯觀霉素抗性基因％說表達(dá)框，轉(zhuǎn)化體具有壯觀霉素抗性和綠色熒光蛋白表達(dá)。本發(fā)明的紫花苜蓿葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟
(a)基因槍法轟擊葉片把紫花苜蓿無菌苗的葉子剪下，把小葉剪開，小葉的背面朝上平鋪在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2，4_D+8g/L瓊脂)上過夜，基因槍轟擊后的葉片放在黑暗下25°C恢復(fù)培養(yǎng)3天；
(b)篩選把恢復(fù)培養(yǎng)后的葉片，橫切成兩段，背面朝下、分散平放到篩選培養(yǎng)基I (MS0+30g/L 蔗糖+0. 25mg/L KT+2mg/L 2, 4-D+500mg/L spe+8g/L 瓊脂)上，在光下 25°C進(jìn)行篩選，每15-20天更換一次培養(yǎng)基I，待有抗性胚狀體或者抗性愈傷組織長出，把抗性胚狀體或抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基I上繼續(xù)培養(yǎng)兩周，再把抗性胚狀體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基 II(MS0+30g/L 蔗糖+0. 05mg/L 6-BA+O. 25mg/L NAA+625mg/L spe+8g/L 瓊脂)上， 繼續(xù)培養(yǎng)兩周，把長大的胚狀體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基III (MS0+30g/L蔗糖625mg/L spe+8g/ L瓊脂)上培養(yǎng)20-30天，抗性胚狀體萌發(fā)并生根長成抗性再生植株，此時把抗性植株剪下，插入瓶裝的篩選培養(yǎng)基III中生根，至此第一輪篩選結(jié)束；第二輪篩選是將第一輪篩選獲得的抗性植株的葉子剪下在篩選培養(yǎng)基I上以第一輪篩選的方法進(jìn)行篩選，直至得到抗性植株；第三輪篩選方法和第二輪相同。本發(fā)明的積極效果在于公開一種轉(zhuǎn)化紫花苜蓿葉綠體的方法，該方法是通過基因槍轟擊紫花苜蓿葉片，將轟擊后的葉片在含有壯觀霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)過三輪篩選，獲得紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明為紫花苜蓿的葉綠體轉(zhuǎn)化提供了載體和方法，實現(xiàn)了綠色熒光蛋白在紫花苜蓿葉綠體中的表達(dá)。


圖1是紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化載體pXLW-MsOl的結(jié)構(gòu)圖。圖2是紫花苜蓿的葉綠體轉(zhuǎn)化流程； A-E:第一輪篩選；F:第二輪篩選的開始。圖3是紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)基因植株的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和分子雜交結(jié)果；
A，PCR結(jié)果；B, Southern blot結(jié)果；Μ:marker ；-水(空白對照);+:質(zhì)粒(陽性對照); WT:未轉(zhuǎn)化植株(野生型，負(fù)對照)；A2,A21,B22,C29:轉(zhuǎn)化植株。圖4是紫外光下紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)基因植株葉片綠色熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果； WT:未轉(zhuǎn)化植株(野生型，負(fù)對照)；A2,A21,B22,C29:轉(zhuǎn)化植株。圖5是紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)基因植株葉片原生質(zhì)體綠色熒光蛋白的表達(dá)結(jié)果；
左(綠色)轉(zhuǎn)化植株在激光激發(fā)的顯微鏡視野下成像；右(灰色)轉(zhuǎn)化植株在普通顯微鏡視野下的成像。
具體實施例方式
通過以下實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動或者改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。實施例1
一、紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建方法。a.紫花苜蓿7浴-iraJ-irW-么奴片段的擴增
設(shè)計 弓I 物 Pl (5' -cactctgctgggccgacactgacac _3')、P2 (5‘-cctggctgtctctgcactcctacct -3')，以紫花苜?？侱NA為模板，用高保真酶通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增，獲得4087bp的16S-trnI-trnA-23S片段(見SEQ ID N0:1)；該片段和用 ^kII酶切的pUC19質(zhì)粒大片段相連接。連接產(chǎn)物交由上海捷瑞生物公司測序，測序引物 % P3 (5' - gcaactgttgggaagggc -3' )> P4 (5' - caatacgcaaaccgcctc ~3' ),λ^^ Ι Ε 確后，命名為pUCMS。b.紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化載體pXLW-MsOl的構(gòu)建
首先，設(shè)計引物 P5 (5，-CAATCGCCCTGGGTGGGTTACACG-3，)和 P6 (5，-CTTGAT CCACTTGGCTACATCCGC-3’)，從質(zhì)粒pEASY Bs-Syth (本實驗室構(gòu)建)上用高保真酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，擴增出2774bp的綠色熒光蛋白基因和壯觀霉素抗性基因 Caa說)表達(dá)框以及多克隆位點，回收產(chǎn)物，命名為說-MCS片段。然后用內(nèi)切酶/^rII 切開pUCMS質(zhì)粒并說片段連接。連接產(chǎn)物由上海捷瑞生物公司測序，測序引物為P7 (5，-CAATTGGATGGACCGTAG-3，)、P8 (5，-CATGAAGGAGTC AAATC-3，)。測序序列正確，命名為pXLff-MsOl (圖 1)。 二、紫花苜蓿的葉綠體轉(zhuǎn)化和篩選
a.培養(yǎng)基。本發(fā)明所用的培養(yǎng)基列在表1中。表1紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化涉及到的培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.紫花苜蓿葉綠體基因組部分堿基序列(部分16S-trnI-trnA-部分J D，見SEQID N0:1。
2.一種紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化質(zhì)粒載體，其特征在于該載體組合有葉綠體基因組中擴增16S核糖體RNA基因-異亮氨酸轉(zhuǎn)移RNA基因(J6S-trnI)片段，丙氨酸轉(zhuǎn)移RNA基因-23S 核糖體RNA基因片段，綠色熒光蛋白基因(gf/7)、壯觀霉素抗性基因UadA )表達(dá)框及多克隆位點片段igfp-aadA -MCS )。
3.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于說-MCS片段位于MS-ir/ /片段和 ^片段之間，片段的順序從5’端到3’端依次是d6S-trnI片段、gfp-aadA-MCS片段和片段。
4.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于:gfP-aadA-WS片段中，gfp-aadA表達(dá)框是多順反子；其中啟動子是煙草葉綠體16S rRNA操縱子的啟動子ftrn基因采用T7噬菌體第10個基因的核糖體結(jié)合位點IlglO ’aadA基因采用煙草葉綠體核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶大亞基的核糖體結(jié)合位點；終止子采用煙草葉綠體基因的終止子Tr/zsl6。
5.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒載體，其特征在于:gfp-ancs片段中，多克隆位點MCS 的5’端有由煙草煙草葉綠體16S rRNA操縱子的啟動子ftrn和煙草酪蛋白水解酶導(dǎo)肽 ClpPrbcL所構(gòu)成的融合啟動子ftrnPcIpI^rbcL ；5'端有煙草葉綠體psbA基因的終止子 TpsbA ο
6.利用權(quán)利要求1所述質(zhì)粒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因獲得的紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)基因植株的轉(zhuǎn)化體，其特征在于其宿主為紫花苜蓿，其葉綠體基因組上整合了綠色熒光蛋白基因和壯觀霉素抗性基因％說表達(dá)框，轉(zhuǎn)化體具有壯觀霉素抗性和綠色熒光蛋白表達(dá)。
7.一種紫花苜蓿葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟(a)基因槍法轟擊葉片把紫花苜蓿無菌苗的葉子剪下，把小葉剪開，小葉的背面朝上平鋪在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS0+30g/L蔗糖+0.25mg/L KT+2mg/L 2，4_D+8g/L瓊脂)上過夜，基因槍轟擊后的葉片放在黑暗下25°C恢復(fù)培養(yǎng)3天；(b)篩選把恢復(fù)培養(yǎng)后的葉片，橫切成兩段，背面朝下、分散平放到篩選培養(yǎng)基I (MS0+30g/L 蔗糖+0. 25mg/L KT+2mg/L 2, 4-D+500mg/L spe+8g/L 瓊脂)上，在光下 25°C進(jìn)行篩選，每15-20天更換一次培養(yǎng)基I，待有抗性胚狀體或者抗性愈傷組織長出，把抗性胚狀體或抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基I上繼續(xù)培養(yǎng)兩周，再把抗性胚狀體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基 II(MS0+30g/L 蔗糖+0. 05mg/L 6-BA+O. 25mg/L NAA+625mg/L spe+8g/L 瓊脂)上， 繼續(xù)培養(yǎng)兩周，把長大的胚狀體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基III (MS0+30g/L蔗糖625mg/L spe+8g/ L瓊脂)上培養(yǎng)20-30天，抗性胚狀體萌發(fā)并生根長成抗性再生植株，此時把抗性植株剪下， 插入瓶裝的篩選培養(yǎng)基III中生根，至此第一輪篩選結(jié)束；第二輪篩選是將第一輪篩選獲得的抗性植株的葉子剪下在篩選培養(yǎng)基I上以第一輪篩選的方法進(jìn)行篩選，直至得到抗性植株；第三輪篩選方法和第二輪相同。
全文摘要
本發(fā)明公開一種紫花苜蓿葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化的方法，該方法是通過基因槍轟擊紫花苜蓿葉片，將轟擊后的葉片在含有壯觀霉素的篩選培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)過三輪篩選，獲得紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明為紫花苜蓿的葉綠體轉(zhuǎn)化提供了載體和方法，實現(xiàn)了綠色熒光蛋白在紫花苜蓿葉綠體中的表達(dá)。
文檔編號C12N15/82GK102337274SQ20101052236
公開日2012年2月1日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者劉艷芝, 林春晶, 王云鵬, 蔡勤安, 邢少辰, 韋正乙 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院