專利名稱：日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，尤其涉及日本沼蝦線粒體基 因組全序列擴(kuò)增的方法，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)俗稱青蝦，隸屬于甲殼綱，十足目，長
臂蝦科，沼蝦屬。日本沼蝦具有適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣，食性雜，生長快，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益高 等特點(diǎn)，是我國最重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類。目前對日本沼蝦的研究工作多數(shù)集中于生長 特性、核型分析和育苗等方面，而有關(guān)使用分子生物學(xué)方法對日本沼蝦的研究卻相對較 少，主要集中于對核基因組遺傳多樣性方面的分析，因此，目前日本沼蝦分子生物學(xué)方 面的信息量仍十分有限，開展更為廣泛的分子水平上的研究極為重要。1981年，Anderson用氯化銫密度梯度分離得到線粒體DNA(mtDNA)，進(jìn)行了 全序列分析。線粒體(mitochondrion)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，絕大多數(shù)動(dòng)物線粒體 呈環(huán)狀。由于它分子結(jié)構(gòu)小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快(線粒體基因的堿基替代率比單拷 貝的核基因組快5-10倍)等特點(diǎn)使得其成為動(dòng)物起源進(jìn)化及群體遺傳分化的理想研究對 象。不同的生物線粒體基因組在結(jié)構(gòu)、基因數(shù)量和基因排列方式等各方面均顯示出極大 的多樣性，因此線粒體基因組的全序列研究就成為了動(dòng)物分子系統(tǒng)發(fā)生最有力的證據(jù)。目前，有研究建立了一種不需要提取線粒體基因組DNA而直接用線粒體進(jìn)行聚 合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法將得到的線粒體用高溫加熱，使線粒體膜破裂，釋放DNA 后，直接用于PCR擴(kuò)增。但此方法只適用于對線粒體基因組DNA純度沒有特別要求的 實(shí)驗(yàn)。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也在日趨完善，實(shí)驗(yàn)要求 也在逐步提高。日本沼蝦線粒體遺傳多樣性與動(dòng)物分子系統(tǒng)發(fā)生的分析的基本要求是線 粒體基因組全序列的擴(kuò)增，而線粒體基因組全序列的擴(kuò)增首先要獲得具有較高純度和濃 度的日本沼蝦線粒體DNA，目前提取線粒體DNA的方法有幾種，如Triton法、堿變性 法、蛋白酶K法，但均存在缺點(diǎn)Triton法提取線粒體基因組DNA的產(chǎn)量低，而且容易 降解；堿變性法要求的實(shí)驗(yàn)條件比較嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)不容易重復(fù)而且提取的線粒體DNA可能 有環(huán)狀和開環(huán)兩種結(jié)構(gòu)；蛋白酶K法所需的操作時(shí)間較長。本發(fā)明中采取高鹽沉淀法進(jìn) 行日本沼蝦線粒體DNA的提取可以彌補(bǔ)以上方法提取線粒體DNA的不足。一般的PCR法難以擴(kuò)增5kb以上的長鏈DNA模板，這嚴(yán)重限制了 PCR法的推廣 和應(yīng)用，通過改變PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer等，可以使長鏈DNA模板的擴(kuò)增 成為可能。本發(fā)明使用了 LA Taq聚合酶，此酶在人的染色體上可以擴(kuò)增長度可達(dá)17.5kb 的DNA片段，而以λ DNA為模板則可以擴(kuò)增出高達(dá)35kb的片段，LA Taq聚合酶與一般 的Taq酶相比，具有校正功能和高保真的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決上述問題，克服如Triton法、堿變性法、蛋白酶K法，但均存在缺點(diǎn)Triton法提取線粒體基因組DNA的產(chǎn)量低，而且容易降解；堿變性法要求 的實(shí)驗(yàn)條件比較嚴(yán)格，實(shí)驗(yàn)不容易重復(fù)而且提取的線粒體DNA可能有環(huán)狀和開環(huán)兩種結(jié) 構(gòu)；蛋白酶K法所需的操作時(shí)間較長等問題，提供一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò) 增的方法。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，包括以下部分第一部分，高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組；第二部分，日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I (簡稱為，COI)和16S rRNA兩個(gè)基因片段的擴(kuò)增；第三部分，日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴(kuò)增。第一部分中，所述高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組，包括以下步驟1)使用液氮將鮮活日本沼蝦肌肉研磨至粉末狀，取50mg轉(zhuǎn)入一個(gè)1.5mL離心管 中加入溶液1500 μ 1，混勻，離心后棄上清；2)沉淀中加入溶液ΙΙ500μ1，混勻，離心后棄上清；3)沉淀加溶液IIlOO μ 1，混勻后加入20mg/mL蛋白酶Κ5μ1和10% SDS20yl，
快速混勻后進(jìn)行消化；4)加入50 μ 1飽和醋酸鈉，混勻，離心后取上清于Eppendrof管中；5)重復(fù)步驟4) 一次；6)上清中加入等體積的酚氯仿異醇的比例為25 24 1，振蕩，離心后取 上層水相重復(fù)該過程抽提一次，取上層水相；7)加入2倍體積冰乙醇或等體積異丙醇，冰浴，離心后棄上清；8)用70%冰乙醇漂洗沉淀，離心后徹底去上清；9)沉淀于空氣中自然部分干燥，加入50-100 μ IRTE液溶解，貯于4°C。進(jìn)一步，所述溶液I 為 Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 10mmol/L, MgC12 5mmol/ LpH 7.5。進(jìn)一步，所述溶液II 為 Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 400mmol/L, EDTA 2mmol/ LpH 8.0。第二部分中，所述日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16S rRNA兩個(gè)基因片段的擴(kuò)增，包括以下幾步驟l)COI和16S rRNA兩個(gè)基因片段引物的選擇用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因片 段的是CO I通用引物以及16S rRNA的通用引物；2)兩個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)反應(yīng)的模板為權(quán)利要求1高鹽沉淀法所提取 的日本沼蝦線粒體基因組DNA，為lOOng，反應(yīng)總體系為50μ1，其中10 XLA PCR Buffer 115 μ 1，dNTPs 2μ L 各 2.5mmol/L，引物各 1 μ 1、20ymol/L, LA Taq 酶 0.5 μ 1、2U ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min; 94°C變性45s，54°C退火45s，72°C延伸 Imin, 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。第三部分中，所述日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴(kuò)增，包括以下步 驟1)用于日本沼蝦線粒體基因組DNA長PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)以擴(kuò)增得到的COI基因片段和16SrRNA片段的序列為模板在兩端分別設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體 基因組DNA環(huán)的其他部分；以COI基因片段為起點(diǎn)、16SrRNA基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對為 SrCO 2F 和 SrCO 2R ；以16SrRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對為 COSr 2F 和 COSr 2R ；2)根據(jù)設(shè)計(jì)的長PCR引物序列擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因組DNA的兩個(gè)半環(huán) 使用TaKaLa生物公司的LA Taq聚合酶；反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性lmin，98°C變性lOsec，56.5°C退火30sce，68°C延 伸15min ；經(jīng)35個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸15min ；產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，有清晰的條帶；測序，將得到的序列拼接后，即可得到日本沼蝦線粒體基因組全序列。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明所采取的高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組，它具有線粒體基因 組DNA提取的濃度大，純度高，產(chǎn)物不易降解、實(shí)驗(yàn)條件要求不嚴(yán)格、實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù) 性、操作時(shí)間相對較短等優(yōu)點(diǎn)。2本發(fā)明的長PCR引物設(shè)計(jì)方面也采取了具有代表性且容易獲得通用引物的16Sr RNA和COI基因片段作為引物設(shè)計(jì)的選擇區(qū)域，這樣就可以保證擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基 因組全序列的可重復(fù)性，以便后續(xù)不同要求的實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。3、測序，將測得序列在Genbank上同源序列比對，確定是此兩個(gè)基因，然后再 從Genbank中查詢多個(gè)16Sr RNA和COI基因片段進(jìn)行比對，找到兩個(gè)基因片段的保守區(qū) 域，在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)引物，目的是保證對日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的可重復(fù) 性，然后用這樣設(shè)計(jì)的引物即可以進(jìn)行長PCR的擴(kuò)增，得到日本沼蝦線粒體基因組全序 列。
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明。

圖1為日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16SrRNA兩個(gè)基
因片段的擴(kuò)增。圖2為以COI基因片段為起點(diǎn)、16S rRNA基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引 物所擴(kuò)增的片段。圖3為以16SrRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引 物所擴(kuò)增的片段。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例試驗(yàn)1.高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組
使用液氮將采集于中國上海的鮮活日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)肌肉 研磨至粉末狀，取50mg轉(zhuǎn)入一個(gè)1.5mL離心管中加入溶液I (Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 10mmol/L, MgCl25mmol/L pH 7.5) 500 μ 1,混勻，2000r/min，IOmin,棄上清。沉淀中 加入溶液 II (Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 400mmol/L, EDTA 2mmol/L pH 8.0) 500 μ 1,混 勻，3500r/min，IOmin,棄上清。沉淀加溶液IIlOO μ 1，混勻后加入20mg/mL蛋白酶K 5 μ 1和10% SDS 20 μ 1，快速混勻。55°C水浴1.5h。加入50 μ 1飽和醋酸鈉，混勻，輕 搖 15S。15000r/min, 4°C,離心 15min，取上清于 Eppendrof 管中。再一次加入 50 μ 1 飽和醋酸鈉，混勻，輕搖15S。15000r/min, 4°C,離心15min，取上清于Eppendrof管 中。上清中加入等體積酚氯仿異醇(25 24 1)，溫和振蕩8min，10000r/min,
4離心lOmin，取上層水相重復(fù)該過程抽提一次，輕取上層水相。加入2倍體積冰乙 醇或等體積異丙醇，冰浴30min后，15000r/min，4°C,離心lOmin，棄上清。用70%冰 乙醇漂洗沉淀，15000r/min，離心2min，徹底去上清。沉淀于空氣中自然部分干燥，加 入適量RTE液溶解，貯于4°C。試驗(yàn)2.日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16SrRNA兩個(gè)基
因片段的擴(kuò)增CO I和16S rRNA兩個(gè)基因片段引物的選擇用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因片 段的是CO I通用引物(引物序列為F 5，GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3，和 R 5，TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3，)，以及 16S rRNA 的通用引物(F 5，CGCCTGTTTAACAAAAACAT 3'禾口 R 5，CCGGTTGAACTCAGATCA 3，)。兩個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)反應(yīng)的模板為權(quán)利要求1所提取的日本沼蝦線 粒體基因組DNA，約為100ng，反應(yīng)總體系為50 μ 1，其中IOXEx TaqBuffer5 μ 1，dNTPs 2口1(各2.511111101/0，引物各 1 μ 1 (20 μ mol/L)，LA Taq酶0.5 μ 1 (2U) .PCR反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性4min; 94°C變性45s，54°C退火45s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin。每次反應(yīng)設(shè)立不含DNA模板的空白對照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢 測。圖1日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16SrRNA兩個(gè)基因片 段的擴(kuò)增。左起第一泳道為D15000標(biāo)準(zhǔn)分子量；第二、三泳道為cytochrome oxidase I(COI)基因片段；第四、五泳道為16S rRNA基因片段。試驗(yàn)3.日本沼蝦線粒體基因組全序列的長PCR擴(kuò)增用于日本沼蝦線粒體基因組DNA長PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)以擴(kuò)增得到的COI 基因片段和16S rRNA片段的序列為模板在兩端分別設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體 基因組DNA環(huán)的其他部分。以COI基因片段為起點(diǎn)、16S rRNA基因片段為終點(diǎn)的半環(huán) 區(qū)域設(shè)計(jì)的引物為 SrCO 2F (5，ATTGAAGGCTTGAATGAAAGGTTG 3')禾口 SrCO 2R( 5’ TAGAAAGAGGAGTAGGCACAGGAT3‘)；以 16S rRNA 基因片段為起點(diǎn)、COI 基因 片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物為COSr 2F(5，CCTGTGCCTACTCCTCTTTCTA 3，) 和 COSr 2R (5，CTACTGACTATGCT-ACCTTCGC 3，)。根據(jù)設(shè)計(jì)的長PCR引物序列擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因組DNA的兩個(gè)半環(huán)使用 TaKaLa生物公司的LA Taq聚合酶，反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性Imin，98°C變性lOsec，56.5°C退火30sce，68°C延伸15min。經(jīng)35個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸15min。產(chǎn)物經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳檢測，有清晰的條帶。圖2以COI基因片段為起點(diǎn)、16SrRNA基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物 所擴(kuò)增的片段。左起第一泳道為D15000標(biāo)準(zhǔn)分子量；第二、三泳道為擴(kuò)增片段。圖3以16SrRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物 所擴(kuò)增的片段。右起第一泳道為XDNA/Hindlll標(biāo)準(zhǔn)分子量；第二、三泳道為擴(kuò)增片段。測序，將得到的序列拼接后即可得到日本沼蝦線粒體基因組全序列。本發(fā)明所采取的高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組是擴(kuò)增日本沼蝦線粒體 基因組全序列的基礎(chǔ)，它具有線粒體基因組DNA提取的濃度大，純度高，產(chǎn)物不易降 解、實(shí)驗(yàn)條件要求不嚴(yán)格、實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性、操作時(shí)間相對較短等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提取的日本沼蝦線粒體基因組的完整性對于長PCR擴(kuò)增日本沼蝦線粒體 基因組全序列至關(guān)重要，因此，在提取過程中，每步搖勻的動(dòng)作不易過猛、水浴時(shí)間不 易過長。飽和醋酸鈉的作用是使大部分線性大分子量的DNA和蛋白質(zhì)在SDS作用下變 性形成沉淀，而環(huán)狀線粒體DNA仍為自然狀態(tài)，通過高速離心，便可除去絕大部分細(xì)胞 碎片、核DNA及蛋白質(zhì)，而線粒體DNA仍留在上清中，因此，飽和醋酸鈉可以多使用 一次，以提高所提取的日本沼蝦線粒體的純度。本發(fā)明的長PCR引物設(shè)計(jì)方面也采取了具有代表性且容易獲得通用引物的16Sr RNA和COI基因片段作為引物設(shè)計(jì)的選擇區(qū)域，這樣就可以保證擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基 因組全序列的可重復(fù)性，以便后續(xù)不同要求的實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，日本沼蝦的16Sr RNA和COI 兩個(gè)基因位于線粒體基因組，采用甲殼類16& RNA和COI基因擴(kuò)增的通用引物擴(kuò)增出兩 個(gè)基因片段，測序，將測得序列在Genbank上同源序列比對，確定是此兩個(gè)基因，然后 再從Genbank中查詢多個(gè)16Sr RNA和COI基因片段進(jìn)行比對，找到兩個(gè)基因片段的保守 區(qū)域，在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)引物，目的是保證對日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的可重 復(fù)性，然后用這樣設(shè)計(jì)的引物即可以進(jìn)行長PCR的擴(kuò)增，得到日本沼蝦線粒體基因組全 序列。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技 術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說 明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)， 這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要 求書及其等同物界定。
權(quán)利要求
1.一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，包括以下部分第一部分，高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組；第二部分，日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I和16S rRNA兩個(gè)基因片段的擴(kuò)增；第三部分，日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，第 一部分中，所述高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組，包括以下步驟1)使用液氮將鮮活日本沼蝦肌肉研磨至粉末狀，取50mg轉(zhuǎn)入一個(gè)1.5mL離心管中加 入溶液1500 μ 1，混勻，離心后棄上清；2)沉淀中加入溶液ΙΙ500μ1，混勻，離心后棄上清；3)沉淀加溶液IIlOOμ 1，混勻后加入20mg/mL蛋白酶K 5 μ 1和10% SDS20 μ 1，快 速混勻后進(jìn)行消化；4)加入50μ 1飽和醋酸鈉，混勻，離心后取上清于Eppendrof管中；5)重復(fù)步驟4)一次；6)上清中加入等體積的酚氯仿異醇的比例為25 24 1，振蕩，離心后取上層 水相重復(fù)該過程抽提一次，取上層水相；7)加入2倍體積冰乙醇或等體積異丙醇，冰浴，離心后棄上清；8)用70%冰乙醇漂洗沉淀，離心后徹底去上清；9)沉淀于空氣中自然部分干燥，加入50-100μ IRTE液溶解，貯于4°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，所 述溶液 I 為 Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 10mmol/L, MgCl25mmol/LpH 7.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，所 述溶液 II 為 Tris-HCl 10mmol/L, NaCl 400mmol/L, EDTA 2mmol/LpH 8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，第 二部分中，所述日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I (CO I)和16S rRNA兩個(gè)基 因片段的擴(kuò)增，包括以下幾步驟1)COI和16SrRNA兩個(gè)基因片段引物的選擇用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因片段的 是CO I通用引物以及16S rRNA的通用引物；2)兩個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)反應(yīng)的模板為權(quán)利要求1高鹽沉淀法所提取的 日本沼蝦線粒體基因組DNA，為IOOng，反應(yīng)總體系為50 μ 1，其中10XLA PCR Buffer 115 μ 1，dNTPs 2μ L 各 2.5mmol/L，引物各 1 μ 1、20ymol/L, LA Taq 酶 0.5 μ 1、2U ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min; 94°C變性45s，54°C退火45s，72°C延伸lmin， 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，其特征在于，第 三部分中，所述日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴(kuò)增，包括以下步驟1)用于日本沼蝦線粒體基因組DNA長PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)以擴(kuò)增得到的COI基 因片段和16S rRNA片段的序列為模板在兩端分別設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基 因組DNA環(huán)的其他部分；以COI基因片段為起點(diǎn)、16S rRNA基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對為SrCO2F 和 SrCO 2R ；以16SrRNA基因片段為起點(diǎn)、COI基因片段為終點(diǎn)的半環(huán)區(qū)域設(shè)計(jì)的引物對為COSr 2F 禾口 COSr 2R ；2)根據(jù)設(shè)計(jì)的長PCR引物序列擴(kuò)增日本沼蝦線粒體基因組DNA的兩個(gè)半環(huán)使用 TaKaLa生物公司的LA Taq聚合酶；反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性lmin，98°C變性lOsec，56.5°C退火30sce，68°C延伸 15min ；經(jīng)35個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸15min ；產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，有清晰的條帶；測序，將得到的序列拼接后，即可得到日本沼蝦線粒體基因組全序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種日本沼蝦線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，包括高鹽沉淀法提取日本沼蝦線粒體基因組；日本沼蝦線粒體基因中的cytochrome oxidase I(CO I)和16S rRNA兩個(gè)基因片段的擴(kuò)增；日本沼蝦線粒體基因組DNA的長PCR擴(kuò)增。在分子遺傳進(jìn)化研究中，線粒體DNA(mtDNA)是十分有用的材料。由于線粒體基因在細(xì)胞減數(shù)分裂期間不發(fā)生重排，而且點(diǎn)突變率高，所以有利于檢查出在較短時(shí)期內(nèi)基因發(fā)生的變化，有利于比較不同物種的相同基因之間的差別，確定這些物種在進(jìn)化上的親緣關(guān)系。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102010860SQ20101052915
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者馮建彬, 姜虎成, 李家樂, 馬克異 申請人:上海海洋大學(xué)