專利名稱：一種多拷貝整合表達(dá)載體及其制備方法與在表達(dá)牛乳鐵蛋白中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種多拷貝整合表達(dá)載 體及其制備方法與在表達(dá)牛乳鐵蛋白中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳鐵蛋白(Lactoferrin，簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)F)是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，其分子量為80KDa。 1939年由Sorensen從牛乳中分離出來(lái)，由于LF與鐵結(jié)合后會(huì)形成紅色的復(fù)合物，故一開(kāi) 始被稱為紅蛋白。1960，GrOVes用色譜法得到該蛋白的純化產(chǎn)物后確定其屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家 族，能夠結(jié)合鐵離子，故將其命名為乳鐵蛋白。乳鐵蛋白主要存在于乳液尤其是初乳中，是新生動(dòng)物重要的免疫和營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)物 質(zhì)。國(guó)內(nèi)外大量研究結(jié)果顯示，乳鐵蛋白能促進(jìn)鐵吸收，降低缺鐵性貧血發(fā)生率；乳鐵蛋白 具有明顯的抗菌作用，通過(guò)和細(xì)菌爭(zhēng)奪鐵，抑制或殺死多種細(xì)菌(雙歧桿菌等需鐵量極少 的幾種有益菌除外)；有利于腸道中有益菌的生長(zhǎng)，維持菌群平衡，防止腹瀉；還可阻斷胃 腸炎病毒等多種病毒和宿主細(xì)胞的結(jié)合；可提高機(jī)體過(guò)氧化物酶含量和吞噬細(xì)胞活性，提 高免疫力。乳鐵蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解成小肽后，抗菌活性是乳鐵蛋白本身的400倍。因此， 乳鐵蛋白是安全、高效、具有多種生理功能和良好前景的養(yǎng)殖用抗生素替代品。將乳鐵蛋白 作為飼料添加劑喂養(yǎng)動(dòng)物尤其是新生動(dòng)物，能降低缺鐵性貧血發(fā)生率，增加腸道中有益菌 的數(shù)量，并提高它們的抗病能力，減少新生動(dòng)物疾病發(fā)生率，提高存活率。由于乳鐵蛋白具有很多生理功能作用，于是自I960年以來(lái)人們就試著采用各種 方法來(lái)制備乳鐵蛋白，例如采用色譜法、超濾法、鹽析法以及酸沉淀法等從人或牛乳中分離 純化LF(參見(jiàn)姬德衡.《乳中的生物活性成分》[J].中國(guó)乳品工業(yè).1996,304) :29-31)。 LF的分離方法主要有兩大類色譜法和超濾法。色譜法又可分為吸附、離子交換、親合色 譜法以及固定化單系抗體法，超濾法是生產(chǎn)食用乳鐵蛋白最能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的方法之一。目 前，隨著分離精制技術(shù)不斷完善，已在工業(yè)規(guī)模上成功從干酪乳清和脫脂乳中制備純度高 達(dá)95%以上的LF。但是，色譜法價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)；而超濾法簡(jiǎn)便并且費(fèi) 用低，但是得到的LF純度低，膜需要經(jīng)常清洗。這些從牛乳中分離純化得到乳鐵蛋白的方 法都要受牛乳的質(zhì)量、數(shù)量、價(jià)格等影響，使得LF分離提純成本不易下降，限制了其作為飼 料添加劑的應(yīng)用范圍。如能利用轉(zhuǎn)基因生物得到廉價(jià)的重組乳鐵蛋白，將會(huì)使它得到更廣 泛的應(yīng)用，滿足畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的需要。目前，人乳鐵蛋白已成功在大腸桿菌、畢赤酵母、小鼠、奶牛、馬鈴薯和大米中成功 表達(dá)，并且I^atrick等成功利用轉(zhuǎn)基因奶牛實(shí)現(xiàn)大批量生產(chǎn)人乳鐵蛋白。Iactoferricin 已成功在畢赤酵母和大腸桿菌中表達(dá)，但是很少有人在酵母系統(tǒng)中表達(dá)牛乳鐵蛋白，只有 Dong, Z Y等人在畢赤酵母中表達(dá)青藏高原牦牛的乳鐵蛋白，并且經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵產(chǎn) 物需要進(jìn)行純化后才能使用，不利于降低成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種多拷貝整合表達(dá)載體及其制備方法與在表 達(dá)牛乳鐵蛋白中的應(yīng)用。一種多拷貝整合表達(dá)載體，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述多拷貝整合表達(dá)載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)以YIPlac204為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到460bp大小的Bgl片段，引物序列如下引物 b 1 5 ’ GACGTCAGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC 3 ’，引物 b2 :5’ GAATTCAGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG 3’；PCR 反應(yīng)條件為94°C 2min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，循環(huán)重復(fù) 34 次， 72 °C IOmin ；(2)將步驟(1)制得的Bgl片段經(jīng)Aat II和EcoR I酶切后與經(jīng)Aat II和EcoR I酶切載體YIPlac204后得到的大片段用DNA連接酶連接，得到表達(dá)載體的骨架，將其命名 為 PYB-I ；(3)以質(zhì)粒pMA91為模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到 1836bp的PGK啟動(dòng)子和終止子片段(序列如SEQ ID NO. 2所示)，反應(yīng)條件為98°C IOsec, 61 °C 15sec，72°C 120sec，循環(huán)重復(fù) 34 次，72°C lOmin，引物序列如下pgklCGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC ；pgk2 :CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG ；(4)將步驟(3)制得的經(jīng)BamH I酶切后的PGK啟動(dòng)子和終止子片段與經(jīng)Bgl II 單酶切的pYB-1用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉 素)平板，利用Hind III進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取出現(xiàn)2230bp和1960bp兩條帶的轉(zhuǎn)化子，命名為 pYB-2 ；(5)以釀酒酵母ABXL-ID染色體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為1134bp的 rDNAl片段1216bp的rDNA2片段；引物序列如下rDNAlF CTGCAGTTTCCTCTGGCTTCACCCTATT,rDNAlR CTGCAGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT ；rDNA2F GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT,rDNA2R GACGTCGAAACTCACCAGGTCCAGACACA ；PCR反應(yīng)條件為95°C 5min，94°C 30sec，61°C 30sec，72°C lOOsec，循環(huán)重復(fù) 34 次， 72 °C IOmin ；(6)將步驟(4)制得的pTO-2和步驟(5)制得的rDNA2分別用Aat II酶切，然后 純化，DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板， 利用Hind III和Hpa I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取酶切后產(chǎn)生大小為2156bp、1856bp和960bp三 條帶的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB-3 ；(7)將步驟(6)制得的pTO-3和步驟(5)制得的rDNAl分別用I^st I酶切，然后純 化，DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/ml氨芐青霉素)平板，利 用Hpa I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取酶切后產(chǎn)生大小為4089bp和M50bp兩條帶的轉(zhuǎn)化子，將其命 名為pYB-4;
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(8)以YIPlac204為模板，PCR得到大小為256bp的Not片段，PCR引物序列為notF CGCGGATCCGCGGCCGCATTCTTGCCACGACTCATCTCC,notR :CGCGGATCCGCGGCCGCGATTCCGATGCTGACTTGCTG ；PCR 條件為95°C 2min，94°C 30sec，61°C 30sec，72°C 30sec，循環(huán)重復(fù) 34 次， 72 °C IOmin ；(9)將步驟⑶制得的Not片段用BamH I酶切，并與經(jīng)Bgl II酶切的有步驟(7) 制得的pYB-4，純化后，用DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LBOlOOy g/ mL氨芐青霉素)平板，利用Not I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取酶切后產(chǎn)生大小為256bp條帶的轉(zhuǎn)化 子，將其命名為pYB-5 ；(10)以質(zhì)粒pUG6為模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到 1456bp的KanMX基因，PCR引物序列為kanF GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC,kanR GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG ；PCR 反應(yīng)條件為 98 "C IOsec,68 "C 15sec，72 "C 120sec,循環(huán)重復(fù) 34 次， 72 0C IOmin ；(11)將步驟(10)制得的KanMX基因用BamH I酶切后與用Bgl II單酶切的pYB_5 片段用DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平 板，利用I3St I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取酶切后產(chǎn)生大小為276bp、1200bp和6720bp三條條帶的 轉(zhuǎn)化子，即為構(gòu)建完畢的多拷貝整合表達(dá)載體。上述多拷貝整合表達(dá)載體在表達(dá)牛乳鐵蛋白中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，步驟如下(1)將牛乳鐵蛋白基因和多拷貝整合表達(dá)載體分別用Not I酶切，然后用DNA連接 酶連接后，轉(zhuǎn)化E. coliTOPIO菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板，利用Not I進(jìn)行 酶切驗(yàn)證，經(jīng)分析測(cè)序，選取反向插入牛乳鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)化子命名為pYIPLF ；(2)將步驟(1)制得的pYIPLF用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80 μ L酵母電 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將混合物電擊后，經(jīng)G418的YEPD平板的篩選，獲得表達(dá)牛乳鐵蛋白的酵 母細(xì)胞；(3)培養(yǎng)步驟( 制得的表達(dá)牛乳鐵蛋白的酵母細(xì)胞，經(jīng)干燥，制得牛乳鐵蛋白飼 料添加劑。上述步驟⑵中電轉(zhuǎn)化的電擊時(shí)間為3. 5 4. Oms0上述步驟(3)中的培養(yǎng)條件在無(wú)選擇壓力的YEPD培養(yǎng)基中28 30°C培養(yǎng)2 3天。上述步驟O)中的酵母為具有絮凝性的野生型釀酒酵母ABXL-1D，菌種購(gòu)自美國(guó) ATCC公司。釀酒酵母對(duì)人類無(wú)毒，被食品和藥物管理局(FDA)確認(rèn)為無(wú)害表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn) 物可直接作為飼料添加劑應(yīng)用，并且釀酒酵母的細(xì)胞壁成分β _1，3葡聚糖也是一種免疫 增強(qiáng)劑。故本發(fā)明利用強(qiáng)絮凝型釀酒酵母組成型表達(dá)牛乳鐵蛋白，在工業(yè)生產(chǎn)中不需要分 離工藝，復(fù)雜的蛋白純化工藝，利用成本較低的發(fā)酵培養(yǎng)基即可進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵完畢后 收集酵母，即可直接制成酵母干粉制劑作為飼料添加劑應(yīng)用。
為了降低重組乳鐵蛋白的生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，本研究選擇具有絮凝性的野 生型釀酒酵母ABXL-ID整合表達(dá)乳鐵蛋白，但是目前商品化的釀酒酵母整合表達(dá)載體大都 利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記作為篩選標(biāo)記和整合位點(diǎn)，需要營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母作為宿主，并且 整合后得到的拷貝數(shù)較低。有研究表明，釀酒酵母的rDNA基因也可作為整合位點(diǎn)，并且可 使重組蛋白基因的拷貝數(shù)提高到50或50以上。本發(fā)明構(gòu)建含有rDNA作為整合位點(diǎn)，G418 抗性為篩選標(biāo)記，酵母強(qiáng)組成型表達(dá)啟動(dòng)子PGK為啟動(dòng)子的新型釀酒酵母多拷貝整合表達(dá) 載體。另外，由于牛乳鐵蛋白在所有哺乳動(dòng)物來(lái)源的乳鐵蛋白中抗菌活性最高，是人乳鐵蛋 白抗菌活性的20倍，故將牛乳鐵蛋白基因同載體連接后，轉(zhuǎn)化Saccharomyces cerevisiae ABXL-1D，檢測(cè)S. cerevisiae ABXL-ID表達(dá)重組牛乳鐵蛋白情況。有益效果1、本發(fā)明所述的多拷貝整合表達(dá)載體以YIPlac204質(zhì)粒為骨架，PGK為啟動(dòng)子， G418抗性為篩選標(biāo)記，rDNA為整合位點(diǎn)，是適用于工業(yè)化生產(chǎn)使用的酵母多拷貝整合型表 達(dá)載體。2、本發(fā)明采用強(qiáng)絮凝性的野生型釀酒酵母作為重組蛋白的宿主菌，并成功表達(dá)重 組乳鐵蛋白。強(qiáng)絮凝性的釀酒酵母菌在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，能使分散在培養(yǎng)液中的酵母細(xì)胞相 互聚集發(fā)生凝集，形成絮凝顆粒并沉降，從而有利于酵母細(xì)胞同培養(yǎng)液的有效分離，可大大 簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，降低成本。3、本發(fā)明采用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PGK高效啟動(dòng)重組蛋白的表達(dá)，提高了重組的表達(dá) 率和減去工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)補(bǔ)料控制工藝，簡(jiǎn)化了操作。4、本發(fā)明首次利用野生型釀酒酵母成功表達(dá)牛乳鐵蛋白，并且利用生物安全性較 高的多拷貝整合表達(dá)載體提高牛乳鐵蛋白在釀酒酵母基因組中的拷貝數(shù)從而提高乳鐵蛋 白在釀酒酵母中的表達(dá)效率，重組牛乳鐵蛋白不需純化就可直接作為飼料添加劑應(yīng)用。利 用該重組牛乳鐵蛋白釀酒酵母工程菌進(jìn)行牛乳鐵蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)，降低牛乳鐵蛋白的生產(chǎn) 成本，從而為推廣牛乳鐵蛋白作為飼料添加劑成為飼用抗生素替代品打下良好基礎(chǔ)。


圖IbLF mRNA序列同根據(jù)bLF氨基酸序列設(shè)計(jì)的bLF序列的比對(duì)圖；圖2多拷貝整合表達(dá)載體的構(gòu)建圖；圖3乳鐵蛋白基因插入表達(dá)載體；其中1泳道pHPLF質(zhì)粒，2泳道pHPLF Not I酶切結(jié)果，3泳道KB ladder Marker0圖4釀酒酵母轉(zhuǎn)化子菌液PCR驗(yàn)證；其中1泳道:S. cerevisiae ABXL-ID 菌液 PCR 結(jié)果，2 泳道S. cerevisiae ABXL-ID重組轉(zhuǎn)化子菌液PCR結(jié)果，3泳道DL2000Marker。圖5重組轉(zhuǎn)化子SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況；其中1泳道=Bio-Rad蛋白Marker，2泳道重組bLF釀酒酵母轉(zhuǎn)化子，3泳道 S. cerevisiaeABXL-IDd泳道重組bLF釀酒酵母轉(zhuǎn)化子；圖中虛線箭頭所指為重組bLF條
市ο圖6重組轉(zhuǎn)化子Western Blot結(jié)果；
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其中1泳道=Bio-Rad蛋白Marker ；2泳道重組bLF釀酒酵母轉(zhuǎn)化子；3泳道 S. cerevisiae ABXL-ID ；圖中虛線箭頭所指為重組bLF條帶。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不 限于此；實(shí)施例1乳鐵蛋白基因的獲得由核酸翻譯至蛋白質(zhì)的過(guò)程中，不同物種存在著不同的密碼子偏愛(ài)性。而釀酒酵 母和哺乳動(dòng)物的密碼子偏愛(ài)性存在較大差異，為了使乳鐵蛋白基因能在釀酒酵母中得到比 較高效的表達(dá)，因此根掘釀酒酵母密碼子偏愛(ài)性，將從NCBI上查到的牛乳鐵蛋白氨基酸序 列轉(zhuǎn)換成適合在釀酒酵母中表達(dá)的核酸序列，同時(shí)還要考慮整個(gè)核酸序列的GC含量等問(wèn) 題，避免翻譯過(guò)程提前終止。設(shè)計(jì)好的核酸序列同牛乳鐵蛋白mRNA進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié) 果顯示兩條核酸序列只有78. 9%相似性(圖1)，說(shuō)明酵母菌和哺乳動(dòng)物牛的密碼子偏好性 存在較大差異。將設(shè)計(jì)好的核酸序列(bLF)兩端引入Not I酶切位點(diǎn)后，交山金思特塵物科技有 限公司進(jìn)行人工合成。該公司將合成好的片段插入PUC57中，并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果反饋序 列合成無(wú)誤。實(shí)施例2多拷貝整合表達(dá)載體的構(gòu)建(圖2)(I)載體骨架pTO-Ι的構(gòu)建(i)Bgl片段的擴(kuò)增以YIPlac204為模板，引物bl和1^2為引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò) 增Bgl片段并在其兩端分別引入Aat ILEcoR I和Bgl II酶切位點(diǎn)。引物序列如下下劃 線部分為Bgl II的識(shí)別位點(diǎn)，陰影部分為Aat II的識(shí)別位點(diǎn)，框架中的序列為EcoR I的 識(shí)別位點(diǎn)。引物 bl :5，GACGTCAGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC 3， (SEQ ID NO. 2)引物 b2 :5’ [gAATT^ AGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG 3' (SEQ ID NO. 3)PCR反應(yīng)條件為 94°C 2 min,94°C 30 sec,60°C 30 sec，72°C 30 sec，循環(huán)重復(fù) 34 次，72°C IOmin0 PCR得到觀0 bp大小的DNA片段，將該片段純化回收后同pGM_T載體連 接，轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布含IPTG和x-gal的LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上， 進(jìn)行藍(lán)白斑篩選挑取白色菌落，搖菌過(guò)夜后進(jìn)行菌液PCR(以菌液為模板，T7和SP6通用引 物為引物)得到約460 bp大小片段，即觀0 hp的Bgl片段再加上載體上T7和SP6引物結(jié) 合位點(diǎn)間約180 bp的距離。這與預(yù)期相符，說(shuō)明Bgl片段已經(jīng)同T載體連接成功。(ii)Bgl片段和YIPlac204的連接將Bgl片段用Aat II和EcoR I從T載體上酶 切下來(lái)，切膠回收。載體YIPlac204上有Aat II和EcoR I的酶切位點(diǎn)，將該載體用Aat II和 EcoR I雙酶切后，回收大片段，并將其同酶切過(guò)的Bgl片段連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coliTOPlO 菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量質(zhì)粒制備后，用Bgl II酶切進(jìn)行驗(yàn)證，得到大小約為2. 2 1Λ的大片段和256 hp的小片段。同預(yù)期相符，說(shuō)明 Bgl片段成功同YIPlac204的片段連接成為表達(dá)載體的骨架，將其命名為pYB_l。
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(II)啟動(dòng)子終止子元件的插入1. 8 kb PGK啟動(dòng)子和終止子片段(PGKp+t)以質(zhì)粒pMA91為模板，利用高保真PCR 聚合酶primeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到，反應(yīng)條件為98 oC 10 sec, 61 oC 15 sec, 72 oC 120sec，循環(huán)重復(fù)；34次，72 oC 10 min，引物均引入BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線)，pgkl CGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC(SEQ ID NO. 4)禾口pgk2 :CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG (SEQ ID NO. 5)，反應(yīng)產(chǎn)物大小約為 1836bp0將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行末端加A尾反應(yīng)，然后再同pGM-T連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選 挑取若干白色菌落，小量制備質(zhì)粒后用EcoR I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得到約3051bp的T載體片段 和約1836bp的PGKp+t片段，同預(yù)期相符說(shuō)明該片段已插入T載體中。將篩選出的轉(zhuǎn)化子 送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析，表明PGKp+t片段序列同pMA91質(zhì)粒上的PGKp+t相 同。利用BamH I和Bgl II為同尾酶的特點(diǎn)，將用BamH I從T載體酶切下來(lái)，切膠回 收得到的PGKp+t片段同用Bgl II單酶切pYB-1，切膠回收得到的片段連接，連接液轉(zhuǎn)化 E.COliT0P10菌株，涂布LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量質(zhì)粒 制備后，利用Hind III進(jìn)行酶切驗(yàn)證。若PGKp+t片段正向插入pTO-Ι的Bgl II位點(diǎn)，則經(jīng) Hind III酶切后將得到一條電泳條帶，而反向插入則會(huì)出現(xiàn)兩條帶，大小分別約為2230bp 和1960bp。選取反向插入的轉(zhuǎn)化子將其命名為pYB-2。(III)整合位點(diǎn)rDNA單元的插入酵母基因組中高度重復(fù)的rDNA單元，是構(gòu)建高拷貝整合表達(dá)載體同源重組區(qū)的 首選序列。每個(gè)rDNA單元長(zhǎng)達(dá)9. Ikb左右，由5S、5. 8S、25S和18S rRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)及一些 非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成。有研究表明，用于介導(dǎo)整合的rDNA區(qū)域，不應(yīng)包含其RNA polymerase I的 起始轉(zhuǎn)錄區(qū)，同時(shí)整合于rDNA區(qū)域的外源片斷大小接近rDNA單元長(zhǎng)度時(shí)，其在有絲分裂中 穩(wěn)定性最高。根據(jù)這一要求，對(duì)S.cerevisiae rDNA序列進(jìn)行分析，確定所需2. 21Λ片斷， 其在rDNA單元中的相對(duì)位置。該片段含有質(zhì)粒用于線性轉(zhuǎn)化的Hpa I單酶切位點(diǎn)。為了減少能賦予細(xì)菌氨芐青霉素抗性的β -內(nèi)酰胺酶編碼基因的擴(kuò)散，增加重組 蛋白工程菌作為飼料添加劑的生物安全性，將選擇出的rDNA片段從Hpa I處分成兩段進(jìn)行 PCR并克隆入pYB-2中，這樣就可以在轉(zhuǎn)化酵母時(shí)，利用Hpa I線性化載體從而去除β -內(nèi) 酰胺酶編碼基因Ampr。根據(jù)這兩段rDNA序列設(shè)計(jì)引物rDNAlF :CTGCAGTTTCCTCTGGC TTCACCCTATT (SEQ ID NO. 6)，rDNAIR CTGCAGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT (SEQ ID NO. 7)，rDNA2F GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT (SEQ ID NO. 8)，rDNA2R GACGTC GAAACTCACCAGGTCCAGACACA (SEQ ID NO. 9)，引物均引進(jìn)酶切位點(diǎn)(Aat II下劃線，Pst I陰影)。以釀酒酵母ABXL-1D染色 體為模板，上述引物為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增rDNAl和rDNA2片段。PCR反應(yīng)條件為 950C 5min,94°C 30sec,61°C 30sec,72°C lOOsec，循環(huán)重復(fù) 34 次，72°C IOmin0 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物 rDNAl和rDNA2的大小分別約為1134bp禾Π 1216bp。將rDNA2和用Aat II酶切，切
9膠純化回收片段后連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB(100 μ g/mL氨芐青霉素) 平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量質(zhì)粒制備后，利用Hind III和Hpa I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切后 產(chǎn)生三條帶，大小分別約為215^ρ，1856bp和960bp的轉(zhuǎn)化子為rDNA2片段反向插入pYB_2 的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB-3。將pTO-3和rDNAl用I^st I酶切，切膠純化回收片段后連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/ml氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量質(zhì)粒制備后， 利用Hpa I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切后產(chǎn)生兩條帶，大小分別約為4089bp和M50bp的轉(zhuǎn)化子為 rDNAl片段反向插入pYB-3的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB_4。(IV) pYB-5 的構(gòu)建由于G418抗性基因中含有Bgl II位點(diǎn)，因此，PGKp+t片段中的克隆位點(diǎn)Bgl II 則不可用，需要另?yè)Q克隆位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)序列分析后，得知載體和bLF上不存在Not I位點(diǎn)，并 且Not I在基因組中出現(xiàn)頻率低，故將PGKp+t片段的Bgl II位點(diǎn)置換成Not I位點(diǎn)。用于 置換酶切位點(diǎn)的Not片段通過(guò)PCR得到，該P(yáng)CR以YIPlac204為模板，兩端引入BamH I (下 劃線)和Not I位點(diǎn)(陰影)的notF :CGCGGATCCGCGGCCGCATTCTTGCCACGACTCATCTCC (SEQ ID NO. 10)禾口notR :CGCGGATCCGCGGCCGCGATTCCGATGCTGACTTGCTG(SEQ ID NO. 11)為引物，條件為95°C2min,94°C 30sec,61°C 30sec，72°C 30sec，循環(huán)重復(fù)；34 次， 72°C IOmin, PCR反應(yīng)得到大小約為256bp的Not片段。將Not片段用BamHI酶切，pYB-4 用Bgl II酶切，純化回收后連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coll T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐 青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量質(zhì)粒制備后，利用Not I進(jìn)行酶切驗(yàn)證。挑選釋 放出約256bp的Not片段的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB-5。(v)G418抗性基因的插入以質(zhì)粒pUG6為模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到約 1. 4Kb 的 KanMX 基因，PCR 反應(yīng)條件為 98°C 10sec，58°C 15sec，72°C 120sec，循環(huán)重復(fù) 34 次， 72°C IOmin,引物均引入BamH I酶切位點(diǎn)(下劃線)，引物序列為kanF :GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC (SEQ ID NO. 12)禾口kanR GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG (SEQ ID NO. 1 ，反應(yīng)產(chǎn)物大小約為 1456bp0將PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行末端加A尾反應(yīng)，然后再同PGM-T連接，連接液轉(zhuǎn)化 E. coliTOPlO菌株，涂布含IPTG和Χ-gal的LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，進(jìn)行藍(lán)白 斑篩選挑取若干白色菌落，小量制備質(zhì)粒后用EcoR I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得到約3051bp的T載 體片段和約1472bp的KanMX片段，同預(yù)期相符說(shuō)明該片段已插入T載體中。將篩選出的轉(zhuǎn) 化子送去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)序列比對(duì)分析，表明KanMX片段序列同pUG6質(zhì)粒上的KanMX 序列相同。將KanMX用BamHI從T載體酶切下來(lái)，切膠回收后同用Bgl II單酶切pYB_l，切膠 回收得到的片段連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平 板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量質(zhì)粒制備后，利用I3St I進(jìn)行酶切驗(yàn)證。若KanMX正向插入 pYB-1的BamH I位點(diǎn)，則經(jīng)Pst I酶切后將得到三條電泳條帶，大小分別為276bp，1200bp 和6720bp。選取正向插入的轉(zhuǎn)化子將其命名為pYB-6(pYIP-6)。pYIP_6即為構(gòu)建完畢的多拷貝整合表達(dá)載體。其序列如SEQ ID NO. 1所示。實(shí)施例3多拷貝整合表達(dá)載體在表達(dá)牛乳鐵蛋白中的應(yīng)用，步驟如下(I)將bLF和載體pYIP-6用Not I酶切，切膠回收得到的片段進(jìn)行連接，連接液轉(zhuǎn) 化E.coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行小量 質(zhì)粒制備后，利用Not I進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖3)。酶切后，得到大小約為7940bp的載體片段 和釋放出來(lái)大小約為2142bp的bLF片段。將插入bLF的幾個(gè)轉(zhuǎn)化子送去測(cè)序，分析測(cè)序結(jié) 果將反向插入bLF的轉(zhuǎn)化子命名為pYIPLF。(IDpYIPLF轉(zhuǎn)化釀酒酵母ABXL-ID和含高拷貝bLF轉(zhuǎn)化子的篩選提取pYIPLF質(zhì) 粒，用Hpa I酶切，切膠回收大片段。將回收得到的大片段加入到80 μ L釀酒酵母ABXL-ID 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將混合物加入0. Icm電擊杯中，選取酵母電擊參數(shù)進(jìn)行電擊，電擊時(shí)間 為3. 8ms。電擊完后，涂布含200 μ g/mL G418的YEPD平板，30°C倒置培養(yǎng)2天。挑取平板 上轉(zhuǎn)化子接種于500 μ g/mL G418的YEPD平板，30°C倒置培養(yǎng)2天后，將該平板上的轉(zhuǎn)化子 轉(zhuǎn)接至lmg/mL G418的YEPD平板，30°C倒置培養(yǎng)2天后，以同樣的程序在ang/mL和^ig/ mL G418的YEPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子。抗G418的濃度越高，說(shuō)明G418在釀酒酵母染色體中 的拷貝數(shù)就越高，則bLF在釀酒酵母染色體的拷貝數(shù)就越高。G418YEPD平板上 菌落較大的轉(zhuǎn)化子為含高拷貝數(shù)bLF的釀酒酵母轉(zhuǎn)化子。(III)重組乳鐵蛋白釀酒酵母工程菌的菌液PCR檢驗(yàn)將挑選出來(lái)的轉(zhuǎn)化子和空 白菌利用凍-煮-凍的方法制備模板，利用根據(jù)bLF設(shè)計(jì)的引物Ifl和If2為引物進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證。反應(yīng)條件為94°C 2min,94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 30sec，循環(huán)重復(fù) 34 次， 72°C IOmin0取10 μ L PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。轉(zhuǎn)化子PCR得到的片段大約 為224bp，符合Ifl和lf2之間的距離，而沒(méi)有經(jīng)載體轉(zhuǎn)化的空白菌PCR沒(méi)有得到條帶(圖 4)，說(shuō)明經(jīng)篩選得到的轉(zhuǎn)化子基因組中含有bLF，pYIPLF已經(jīng)整合到S. cerevisiaeABXL-lD 基因組中。(IV)Western Blotting檢測(cè)重組乳鐵蛋白釀酒酵母工程菌表達(dá)量接種轉(zhuǎn)化子于 50mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30°C 200rpm振蕩培養(yǎng)4 后，取ImL菌液離心后，用ImL PBS洗 滌兩次后，用200 μ L PBS溶解沉淀后，加2 X上樣緩沖液混勻后，沸水浴IOmin。取20 μ L 處理液上樣SDS-PAGE(圖5)。由圖5可知，轉(zhuǎn)化子表達(dá)一種不在空白菌中表達(dá)的蛋白，大小 約為78kD，同乳鐵蛋白分子量相符，說(shuō)明乳鐵蛋白可能在釀酒酵母轉(zhuǎn)化子中成功表達(dá)。為了 進(jìn)一步驗(yàn)證該蛋白是否為乳鐵蛋白，我們利用抗牛乳鐵蛋白的鼠源一抗和山羊抗鼠的二抗 (帶堿性磷酸酶)進(jìn)行Wfestern Blot (圖6)。由圖6可知，在75kD的上方轉(zhuǎn)化子中有一條約為78kD的條帶，而空白菌中則沒(méi) 有。由此，可以認(rèn)定牛乳鐵蛋白在釀酒酵母中成功得到表達(dá)，但是表達(dá)量相對(duì)較少，這可能 與乳鐵蛋白分子量相對(duì)較大，在S. cerevisiae胞內(nèi)表達(dá)該蛋白有關(guān)。
1權(quán)利要求
1.一種多拷貝整合表達(dá)載體，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的多拷貝整合表達(dá)載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)以YIPlac204為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到460bp大小的Bgl片段，引物序列如下 引物 b 1 5 ’ GACGTCAGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC 3 ’，引物 b2 :5’ GAATTCAGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG 3’ ；PCR 反應(yīng)條件為94°C 2min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec,循環(huán)重復(fù) 34 次， 72 °C IOmin ；(2)將步驟(1)制得的Bgl片段經(jīng)AatII和EcoR I酶切后與經(jīng)Aat II和EcoR I酶 切載體YIPlac204后得到的大片段用DNA連接酶連接，得到表達(dá)載體的骨架，將其命名為 pYB-1 ；(3)以質(zhì)粒pMA91為模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到1836bp 的PGK啟動(dòng)子和終止子片段，反應(yīng)條件為98°C 10sec,6rC 15sec,72°C 120sec，循環(huán)重復(fù)；34 次，72°C lOmin，引物序列如下pgkl CGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC ； pgk2 :CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG ；(4)將步驟(3)制得的經(jīng)BamHI酶切后的PGK啟動(dòng)子和終止子片段與經(jīng)Bgl II單酶 切的pYB-1用DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB平板，利用Hind III進(jìn)行 酶切驗(yàn)證，選取出現(xiàn)2230bp和1960bp兩條帶的轉(zhuǎn)化子，命名為pYB_2 ；(5)以釀酒酵母ABXL-ID染色體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為1134bp的rDNAl片 段1216bp的rDNA2片段；引物序列如下rDNAlF CTGCAGTTTCCTCTGGCTTCACCCTATT， rDNAlR CTGCAGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT ； rDNA2F :GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT， rDNA2R :GACGTCGAAACTCACCAGGTCCAGACACA ；PCR 反應(yīng)條件為95°C 5min,94°C 30sec,61°C 30sec,72°C IOOsec,循環(huán)重復(fù) 34 次， 72 °C IOmin ；(6)將步驟⑷制得的pYB-2和步驟(5)制得的rDNA2分別用AatII酶切，然后純 化，DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB平板，利用Hind III和Hpa I進(jìn) 行酶切驗(yàn)證，選取酶切后產(chǎn)生大小為2156bp、1856bp和960bp三條帶的轉(zhuǎn)化子，將其命名為 pYB-3 ；(7)將步驟(6)制得的pTO-3和步驟(5)制得的rDNAl分別用PstI酶切，然后純化， DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB平板，利用Hpa I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取 酶切后產(chǎn)生大小為4089bp和M50bp兩條帶的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB-4 ；(8)以YIPlac204為模板，PGR得到大小為256bp的Not片段，PCR引物序列為 notF CGCGGATCCGCGGCCGCATTCTTGCCACGACTCATCTCC,notR :CGCGGATCCGCGGCCGCGATTCCGATGCTGACTTGCTG ；PCR 條件為95 "C 2min，94 "C 30sec，61 "C 30sec，72 "C 30sec,循環(huán)重復(fù) 34 次， 72 °C IOmin ；(9)將步驟(8)制得的Not片段用BamHI酶切，并與經(jīng)Bgl II酶切的有步驟(7)制得的pYB-4，純化后，用DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB平板，利用Not I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，選取酶切后產(chǎn)生大小為256bp條帶的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB-5 ；(10)以質(zhì)粒pUG6為模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到1456bp 的KanMX基因，PCR引物序列為kanF GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC，kanR GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG ；PCR 反應(yīng)條件為 98°C 10sec，58°C 15sec，72°C 120sec，循環(huán)重復(fù) 34 次，72°C IOmi η ；(11)將步驟(10)制得的KanMX基因用BamHI酶切后與用Bgl II單酶切的ρΥΒ_5片 段用DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化Ε. coli TOPlO菌株，涂布LB平板，利用I^st I進(jìn)行酶切驗(yàn) 證，選取酶切后產(chǎn)生大小為276b p、1200bp和6720bp三條條帶的轉(zhuǎn)化子，即為構(gòu)建完畢的 多拷貝整合表達(dá)載體。
3 .權(quán)利要求1所述的多拷貝整合表達(dá)載體在表達(dá)牛乳鐵蛋白中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下(1)將牛乳鐵蛋白基因和多拷貝整合表達(dá)載體分別用NotI酶切，然后用DNA連接酶連 接后，轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB平板，利用Not I進(jìn)行酶切驗(yàn)證，經(jīng)分析測(cè)序，選取 反向插入牛乳鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)化子命名為PYIPLF ；(2)將步驟⑴制得的pYIPLF用HpaI酶切，回收大片段后，加入到80 μ L酵母電轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞，將混合物電擊后，經(jīng)G418的YEPD平板的篩選，獲得表達(dá)牛乳鐵蛋白的酵母細(xì) 胞；(3)培養(yǎng)步驟(2)制得的表達(dá)牛乳鐵蛋白的酵母細(xì)胞，經(jīng)干燥，制得牛乳鐵蛋白飼料添 加劑。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟O)中電轉(zhuǎn)化的電擊時(shí)間為3.5 4. Oms0
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，上述步驟(2)中的酵母為具有絮凝性的野生 型釀酒酵母ABXL-1D，菌種購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，上述步驟C3)中的培養(yǎng)條件在無(wú)選擇壓力 的YEPD培養(yǎng)基中28 30°C培養(yǎng)2 3天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達(dá)載體及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種多拷貝整合表達(dá)載體及其制備方法與在表達(dá)牛乳鐵蛋白中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。一種多拷貝整合表達(dá)載體，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明所述的多拷貝整合表達(dá)載體以YIPlac204質(zhì)粒為骨架，PGK為啟動(dòng)子，G418抗性為篩選標(biāo)記，rDNA為整合位點(diǎn)，是適用于工業(yè)化生產(chǎn)使用的酵母多拷貝整合型表達(dá)載體。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102121025SQ20101053123
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者劉增英, 孫冰玉, 寧萌, 張燕君 申請(qǐng)人:山東大學(xué)