專利名稱：一種檢測中國地方黃牛aqp9基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領(lǐng)域，涉及以黃牛的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作 為分子遺傳標記，特別涉及一種檢測黃牛AQP9基因的單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
近年來肉牛產(chǎn)業(yè)呈超高速發(fā)展態(tài)勢，已經(jīng)成為各國國民經(jīng)濟和農(nóng)業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)， 我國肉用牛的發(fā)展還有著巨大的潛力。為了在國際市場獲得競爭力，肉類生產(chǎn)者以消費者 食物需要為基礎(chǔ)，在保證肉品安全質(zhì)量的前提下盡力提高肉畜的生產(chǎn)性能。這對于育種工 作者來說就是如何生產(chǎn)出消費者歡迎的畜產(chǎn)品，同時獲得最大效益，也就是說要培育出飼 料利用率高，產(chǎn)品品質(zhì)好的畜禽品種(系)。飼料利用率的高低，歸根結(jié)底是能量利用的高 低。同時就黃牛而言，肌間脂肪是影響其口味的重要因素，它是靠脂肪的沉積和合理分配形 成的。隨著市場經(jīng)濟的迅速發(fā)展人民生活水平的日益提高，加快黃牛生長速度和提高肉品 質(zhì)勢在必行。生長發(fā)育性狀是典型的、具有重要經(jīng)濟價值的數(shù)量性狀，其遺傳力低，一般 為0. 2 0. 3，用傳統(tǒng)育種方法進行育種進展緩慢。而分子育種技術(shù)，則是從操縱數(shù) 量性狀的表型逐步過渡到操縱數(shù)量性狀的基因型，從由表型的選擇轉(zhuǎn)為標記輔助選擇 (marker-assisted selection, MAS),最終可實現(xiàn)分子育種(molecular breeding)。隨著 分子生物學和分子遺傳學的發(fā)展，分子標記也在不斷向前發(fā)展。在分子標記的發(fā)展歷程中， 其大致可分為三類1類是以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標記，如RFLP和DNA指紋；II類是以 PCR為基礎(chǔ)的分子標記，如RAPD、微衛(wèi)星標記、PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR-RMAPD (隨機擴增 微衛(wèi)星引物多態(tài)DNA)標記；III類是以DNA測序為核心的分子標記，如SNP和EST。單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G) 的變化而引起的多態(tài)性，包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化。根據(jù)其 在基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū)SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間 SNPs(iSNPs)三類。其中對于編碼區(qū)SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接 的重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進 化的研究中也具有重要意義。目前SNP檢測技術(shù)有很多，其中DNA序列測定法是最為準確 的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測 序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實際 的理想SNP檢測方法。而其它一些SNP檢測方法操作比較繁瑣，局限性較大，或要求實驗條 件高，不適合一般臨床實驗室使用。PCR-SSCP作為檢測基因突變的一種方法，經(jīng)不斷地改 善，其簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器，更適合臨床實驗的需要。因此，利用PCR-SSCP 與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，既準確又實用。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是廣泛存在于原核和真核細胞膜上轉(zhuǎn)運水的特異 性孔道。其中AQP3、7、9和AQPlO之間基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)序列相近似，除對水分子通透外， 對甘油和尿素等中性小分子也具有通透性，成為AQP家族中的第二個亞家族，水_甘油通道(aquaglyceroporin，AQP)。AQP9是1997年Kuriyame等在進行人類脂肪組織基因序列系統(tǒng) 分析過程中發(fā)現(xiàn)的，之后在白細胞、肝臟、睪丸、脾和腦等器官也都有發(fā)現(xiàn)，在人體多種組織 均有表達，其分子結(jié)構(gòu)和對水的通透性與其他的水通道蛋白類似，并且觀察到AQP9增強了 脂肪細胞甘油通透能力，所以認為當脂肪分解在細胞膜之間形成甘油濃度梯度時，AQP9開 始轉(zhuǎn)運甘油。另有研究顯示，肝細胞膜表面AQP9可以完成甘油的攝入過程。脂肪細胞AQP7 將脂肪動員產(chǎn)生的甘油輸送到血液，而甘油到達肝臟則需要AQP9完成從血液的攝取過程， 最終在肝臟以甘油為原料糖異生補充血糖，因此由AQP7和AQP9協(xié)調(diào)完成了甘油由脂肪細 胞到肝臟的運輸過程。AQP9的功能異常將影響糖異生而導致低血糖的出現(xiàn)，并且與胰島素 抵抗也密切相關(guān)。大量研究表明，AQP9在維持體內(nèi)能量代謝與平衡，脂肪合成以及個體的 生長發(fā)育等方面都具有至關(guān)重要的作用。因此，研究哺乳動物AQP9基因遺傳變異和分子遺 傳特征具有重要理論和實踐意義。AQPs在體內(nèi)各器官組織的廣泛表達具有相當重要的生物學作用。水_甘油通道 蛋白不僅對維持體內(nèi)多個器官系統(tǒng)的正常生理功能具有重要作用，而且其調(diào)節(jié)的甘油運輸 對于機體物質(zhì)代謝還具有重要的生理意義。隨著分子生物學及基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展， AQPs基因在機體中組織器官的特異性分布情況及在蛋白分子生物學遺傳、結(jié)構(gòu)方面的研究 也日漸深入，已成為眾多學者關(guān)注的焦點，在臨床也有了較廣泛的應(yīng)用。AQP9參與體內(nèi)甘 油的轉(zhuǎn)運，與脂肪代謝、脂類在組織中的沉積有很大關(guān)系，所以AQP9對機體內(nèi)脂肪含量以 及個體生長發(fā)育性狀產(chǎn)生重要影響。已有資料顯示AQP7基因的多態(tài)性與豬脂肪沉積性狀 存在關(guān)系，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)ωi的生長發(fā)育具有顯著的影響，是一個較理想的標記位點。目前， 國內(nèi)外未見關(guān)于動物AQP9基因遺傳變異的研究。中國黃牛AQP9基因遺傳變異領(lǐng)域的研究 未見報道，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與生長性狀(如體重、體高、胸圍等性狀) 關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。由于AQP9基因功能涉及動物的生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為 AQP9基因的SNPs與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛生長性狀的標記 輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測黃牛AQP9基因的單 核苷酸多態(tài)性，并將其與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔 助選擇的分子標記，為中國黃牛遺傳育種領(lǐng)域標記輔助選擇(MAS)在生長前期的選育提供 了寶貴資料，從而加快良種選育速度和提高種群品質(zhì)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)黃牛AQP9基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括黃牛AQP9基因第47575位為C或T的單核苷酸多態(tài)性，第47615位為C或T的單 核苷酸多態(tài)性，第47690位為A或G的單核苷酸多態(tài)性。上述檢測中國地方黃牛水-甘油通道蛋白9(AQP9)基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP) 的方法為以中國地方黃?；蚪MDNA或包含AQP9基因序列為模板，利用特異性引物PCR擴 增黃牛AQP9基因，然后利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測產(chǎn)物單鏈構(gòu)象并進行測序分 析，即可準確鑒定中國地方黃牛品種AQP9基因的單核苷酸多態(tài)性。
所述的引物對為P6 上游引物5' -AAGGAAGACCAAGCGATGT-3‘ 19bp ；P6 下游引物5' -GTGTGTGAAGATGCTTTGTGA-3‘ 21bp。所述的PCR擴增的條件是25μ L 反應(yīng)體系，包括 1. 0μ UlU/μ L)Taq DNA 聚合酶，10XBuffer 2.5yL(含 Mg2+)，2. O μ L (2. 5mmol/L) dNTPs, l.OyL (50. Ong/ μ L)黃牛基因組 DNA 或包含 AQP9 基因序 列的DNA樣品，10 μ mol/L上、下游引物各0. 5 μ L和滅菌超純水17. 5 μ L。所述的PCR擴增反應(yīng)程序為94°C 預變性 4min ；30 35 個循環(huán) 94°C 變性 30s，61 °C 退火 45s，72 °C 延伸 45s ； 72°C延伸 IOmin0所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。所述根據(jù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型及多態(tài)產(chǎn)物測序結(jié)果鑒定黃牛AQP9基 因的單核苷酸多態(tài)性為AA基因型對應(yīng)的SNPs為NC_007308 :g. 47575C，47615C，47690A ； AB 基因型對應(yīng)的 SNPs 為 NC_007308 :g. 47575C/T, 47615C/T, 47690A/G ；BB 基因型對應(yīng)的 SNPs 為 NC_007308 :g.47575T，47615T，47690G。本發(fā)明利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法對黃牛AQP9基因第47575和第47615位 點上的錯義突變產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，當?shù)?7575位點 由C突變?yōu)門時，三聯(lián)密碼⑶C改變?yōu)閁UC，在轉(zhuǎn)錄過程相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)編碼氨基酸發(fā)生 改變，肽鏈260位的亮氨酸變?yōu)楸奖彼?Leu260Phe)，當?shù)?7615位點由C突變?yōu)門時，三 聯(lián)密碼CCG改變?yōu)镃UG，在轉(zhuǎn)錄過程相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)編碼氨基酸發(fā)生改變，肽鏈273位的 脯氨酸變?yōu)榱涟彼?Pro273Leu)，這使得廣泛分布于細胞膜上具有重要生理功能的水-甘 油通道蛋白9基因所編碼蛋白的空間構(gòu)型可能發(fā)生變化，以至影響蛋白的生物學功能。本發(fā)明公開了與黃牛生長性狀相關(guān)的功能基因AQP9的核苷酸多態(tài)性，對AQP9基 因的SNPs進行了基因分型和基因頻率分析，以及與郟縣紅牛生長性狀之間進行了關(guān)聯(lián)分 析；結(jié)果顯示AQP9基因的核苷酸多態(tài)位點能夠成為分子遺傳輔助育種的標記。針對上述黃牛AQP9基因核苷酸多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過 PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。 由于AQP9基因功能主要涉及體重、體高、胸圍等生長發(fā)育性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為 AQP9基因的SNPs與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便推廣應(yīng)用于中國地方黃牛品種 生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。


圖1為黃牛AQP9基因P6位點的PCR產(chǎn)物電泳圖譜。圖2為黃牛AQP9基因P6位點的PCR-SSCP電泳圖譜。圖3為黃牛AQP9基因SNPs的不同基因型測序圖。圖4為黃牛AQP9基因P6位點野生型與突變型的核苷酸及氨基酸序列的比對分析。
具體實施例方式本發(fā)明以AQP9基因保守序列設(shè)計引物擴增AQP9基因外顯子6區(qū)域及3’ UTR的
572bp片段，分別以郟縣紅牛、魯西牛、秦川牛3個品種的基因組為模板，進行PCR擴增，然后 利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測產(chǎn)物單鏈構(gòu)象多態(tài)性，多態(tài)產(chǎn)物經(jīng)測序后尋找該擴增 片段的單核苷酸多態(tài)；針對發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其檢測方法， 使得AQP9基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺傳標記，為加快建立 具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟性狀的黃牛種群提供依據(jù)。 下面結(jié)合對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
a、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法對黃牛AQP9基因SNPs的檢測1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以3個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1。表1黃牛樣本的采集
權(quán)利要求
一種檢測中國地方黃牛AQP9基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以中國地方黃?；蚪MDNA或包含AQP9基因序列為模板，利用特異性引物對PCR擴增黃牛AQP9基因，然后利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測產(chǎn)物單鏈構(gòu)象多態(tài)性，多態(tài)產(chǎn)物經(jīng)測序后即可準確鑒定中國地方黃牛品種AQP9基因的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對為上游引物5′ AAGGAAGACCAAGCGATGT 3′ 19bp；下游引物5′ GTGTGTGAAGATGCTTTGTGA 3′21bp。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黃牛AQP9基因單核苷酸多態(tài)性位點 為該基因的g. 47575C > T，47615C > T，47690A > G 變異位點。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR擴增的條件是25μ L反應(yīng)體 系，包括 1. OyL Taq DNA 聚合酶，10 XBuffer 2. 5 μ L，含 Mg2+，2. 5mmol/LdNTPs2. 0 μ L， 50. Ong/μ L黃牛基因組DNA或包含AQP9基因序列的DNA樣品1. 0μ L，IOpmol/μ L上、下游 引物各0. 5 μ L和滅菌超純水17. 5 μ L ；所述的PCR擴增反應(yīng)程序為94°C預變性4min ；30 35個循環(huán)94°C變性30s，61°C退 火 45s, 72°C延伸 45s ；72°C延伸 IOmin0
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為10%聚丙烯 酰胺凝膠電泳。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，根據(jù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型及多 態(tài)產(chǎn)物測序結(jié)果鑒定黃牛AQP9基因的單核苷酸多態(tài)性為與GenBank acc. No. :NC_007308 序列比較，AA基因型對應(yīng)的SNPs為g. 47575C，47615C，47690A ；AB基因型對應(yīng)的SNPs為 g. 47575C/T, 47615C/T, 47690A/G ；BB 基因型對應(yīng)的 SNPs 為g. 47575T，47615T，47690G。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測黃牛AQP9基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含AQP9基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以特異性引物對P6為引物，PCR擴增黃牛AQP9基因的外顯子6區(qū)；再對擴增產(chǎn)物片段進行SSCP多態(tài)性檢測并對產(chǎn)物進行測序分析。由于AQP9基因的功能涉及體重、體高、體長、胸圍等生長性狀，該發(fā)明是一種在DNA水平上篩查和檢測與黃牛生長性狀密切相關(guān)的分子遺傳標記，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK101985656SQ20101053153
公開日2011年3月16日 申請日期2010年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月4日
發(fā)明者張婧敏, 張春雷, 房興堂, 陳宏 申請人:徐州師范大學