專利名稱：人源臍帶血造血干細胞體外高效擴增技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及從健康人的臍帶血中提取含造血干細胞的有核細胞作為擴增起始細胞，以健康人的臍帶間充質干細胞作為滋養(yǎng)層，接種于含有臍帶血血漿的特定培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)，從而高效地擴增造血干細胞。
背景技術：
干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，根據(jù)分化潛能大小可以分為全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。造血干細胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)是一類存在于造血組織中的多能干細胞，可以定向分化、增殖為不同的血細胞系，并進一步生成血細胞。造血干細胞在治療白血病、惡性腫瘤、重癥非惡性血液系統(tǒng)疾病以及某些遺傳性疾病中有廣泛的應用。造血干細胞根據(jù)來源又可分為骨髓造血干細胞、夕卜周血造血干細胞和臍帶血造血干細胞。與骨髓和外周血造血干細胞相比，臍血造血干細胞更為原始，自我增殖能力最強，且臍帶血具有采集方便、細胞免疫不成熟、移植過程中不需要嚴格配型等優(yōu)點，因而臍帶血造血干細胞具有極大的臨床應用價值。但是，單份臍血的造血干細胞含量低，在臨床中很難用于正常體重成人患者的移植。因此，造血干細胞在移植前需要進行體外擴增。目前，造血干細胞體外擴增技術主要有三種(1)細胞因子支持造血干細胞體外擴增；( 細胞滋養(yǎng)層支持造血干細胞體外擴增；( 三維空間立體培養(yǎng)。但這三種技術分別存在以下不足(1)細胞因子促進細胞擴增的同時也加速了細胞的分化，尚不能達到既擴增又保持其干細胞功能的目的，且細胞因子價格昂貴；( 滋養(yǎng)層細胞易滲入造血干細胞，而且一部分培養(yǎng)的造血干細胞也會遷入滋養(yǎng)層，要將培養(yǎng)的造血干細胞完全收獲非常困難，另外異源滋養(yǎng)層細胞可能產生免疫排斥問題；C3)三維空間立體培養(yǎng)技術復雜，難以進行規(guī)模培養(yǎng)，且三維空間培養(yǎng)主要是模擬骨髓造血微環(huán)境，而骨髓造血干細胞與臍血造血干細胞的原始程度并不相同，兩者本身的造血微環(huán)境差異很大，所以三維空間立體培養(yǎng)技術可能并非適合臍帶血或外周血的造血干細胞體外擴增。因此，要想獲得高產量的臍血造血干細胞，又不存在免疫排斥，而且成本低廉，就需要不斷更新或優(yōu)化造血干細胞體外擴增技術。為此，本發(fā)明利用臍帶間充質干細胞(Mesenchymal stem cellS，MSCS)作滋養(yǎng)層， 添加臍帶血血漿的方法來擴增臍帶血造血干細胞，以臍血有核細胞為起始細胞，無需添加細胞因子，無需復雜的三維技術即可高效擴增臍帶血造血干細胞。臍帶間充質干細胞是一類具有多向分化潛能的干細胞，可以產生多種細胞因子，利用臍帶間充質干細胞作為滋養(yǎng)層具有以下幾個優(yōu)點(1)來源充足，取材方便，成本低廉；( 人臍帶間充質干細胞含量豐富，較為原始，分化能力強，可在體外進行分離、培養(yǎng)，擴增迅速，且生物學性狀穩(wěn)定，多次傳代擴增仍能保持旺盛功能，可以提供充足的細胞來源；C3)免疫原性極低，免疫排斥的概率極低，且臍帶間充質干細胞還具有一定的免疫抑制功能；(4)臍帶間充質干細胞可以支持造血和促植入。作為造血微環(huán)境主要細胞成分-基質細胞系的干/祖細胞，間充質干細胞通過細胞對細胞的直接作用、分泌細胞外基質及多種細胞因子，實現(xiàn)對造血的精細調控，支持造血干細胞的生長。間充質干細胞與造血干細胞共同移植可促進造血干細胞的植入，對于提高造血干細胞的移植成功率有重要意義。同時，臍帶血血漿中含有豐富的造血生長因子， 如粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、單核細胞集落刺激因子(M-CSF)、紅細胞生成素(Fpo)、白細胞介素-1 (IL-I)、白細胞介素-3 (IL-3)、白細胞介素-6 (IL-6)等等，具有促進造血干細胞生長與增值功能。其中有些臍血血漿因子可以與間充質干細胞分泌的細胞因子協(xié)同作用促進造血干細胞生長、增值，例如Flt3配體和EPO對⑶34+細胞的擴增起關鍵的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種適合臍帶血造血干細胞的體外高效擴增技術，為治療疾病和應用研究提供充足的造血干細胞。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下利用正常培養(yǎng)的第3代以內臍帶間充質干細胞或直接利用復蘇冷凍的臍帶間充質干細胞(也為第3代以內的細胞)，接種于DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至細胞完全貼壁時， 全量換液為特定培養(yǎng)基(此特定培養(yǎng)基DMEM/F12 RPMI1640為1 1混合，另含10%胎牛血清和10%臍帶血血漿，pH = 7. 0 7. 4)，接種從臍帶血中提取的有核細胞，放置培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)，每隔3 4天更換半量培養(yǎng)基，培養(yǎng)、擴增至第10 11天，此時收集的細胞中造血干細胞最為豐富。若要獲得更多的造血干細胞，重復之前的培養(yǎng)過程即可。其過程為(1)臍帶間充質干細胞滋養(yǎng)層的制備取正常培養(yǎng)的第3代以內臍帶間充質干細胞或復蘇已凍存的第3代以內臍帶間充質干細胞(間充質干細胞來自健康人的臍帶，按照常規(guī)的組織塊法制備獲得，正常按1 2 的比率傳代)，接種于DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至細胞完全貼壁。(2)臍帶血有核細胞的提取采集健康人的臍帶血，按5 1比例加5%羥乙基淀粉(臍帶血羥乙基淀粉為 5 1)，混勻6 8分鐘，與4°C靜止4 5小時，取上清離心即可獲得有核細胞，分離得到的血漿保存待用。(3)臍帶血造血干細胞培養(yǎng)、擴增當臍帶間充質干細胞培養(yǎng)至完全貼壁時，全量換液為特定培養(yǎng)基(此特定培養(yǎng)基 DMEM/F12 RPMI1640為1 1混合，另含10%胎牛血清和10%臍帶血血漿，pH = 7. 0 7. 4)，并接種臍帶血有核細胞共同培養(yǎng)(臍帶血有核細胞接種濃度為5 8X IO5ceIls/ ml)，每隔3 4天更換半量培養(yǎng)基，至第10 11天即可收集細胞。若要獲得更多的造血干細胞，將收集的細胞接種于重新制備好的含臍帶間充質干細胞滋養(yǎng)層的培養(yǎng)液中，重復臍帶血造血干細胞培養(yǎng)、擴增過程即可。整個過程要求無細菌、真菌、病毒和支原體等污染。本發(fā)明聯(lián)合應用臍帶間充質干細胞和臍血血漿，選用臍帶血有核細胞作為起始培養(yǎng)細胞，而非單個核細胞或單純的造血干細胞，發(fā)現(xiàn)在擴增過程中細胞分化的比例更小，因此，本技術不但可以高效地體外擴增造血干細胞，而且還避免了造血干細胞增殖的同時也加速分化的不足。
本發(fā)明與現(xiàn)有的造血干細胞體外擴增技術相比具有明顯的優(yōu)勢第一，臍帶間充質干細胞與臍血血漿聯(lián)合應用，不但可以高效擴增造血干細胞，而且還可以在一定程度上抑制或減緩造血干細胞的分化，不需加外源細胞因子，大大降低了成本。第二，臍帶間充質干細胞作為滋養(yǎng)層，無需絲裂霉素C或γ -射線2IGy照射等處理，由于其免疫原性低，且具有免疫抑制功能，可以提高造血干細胞移植的成功率，所以即使少量的滋養(yǎng)層間充質干細胞混入造血干細胞中對臨床治療非但不會產生免疫排斥等副作用，反而具有促進功能。第三，本發(fā)明不用三維空間技術，簡化了培養(yǎng)、擴增過程，便于規(guī)模化生產。
具體實施例方式實施例1、造血干細胞體外擴增(1)臍帶間充質干細胞的制備①采集健康人的臍帶；②去掉臍帶內血管和外層薄膜；③將臍帶組織剪切成1 2mm3大小的小塊；④將剪切后小塊種植于加有DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(直徑為100mm)中培養(yǎng)， 置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑤每3 4天半量換液，培養(yǎng)14 16天細胞生長約80%匯合；⑥當細胞約80%匯合時，利用0. 25%胰酶對細胞進行消化，以1 3X IO5ceIls/ ml接種于培養(yǎng)皿中傳代培養(yǎng)；⑦當細胞約80%匯合時，利用0. 25%胰酶對細胞進行消化，收集第1代細胞，按 1 2比率進行傳代，置于37°C、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑧若需多次傳代，重復步驟⑦即可；⑨若需冷凍細胞，以90%胎牛血清(FBS)+10%二甲基亞砜(DMSO)的混合液作為冷凍保護劑，細胞濃度為3 5X 106cells/ml，進行常規(guī)冷凍。(2)臍帶間充質干細胞滋養(yǎng)層的制備①收集第3代以內(包括第3代)臍帶間充質干細胞，或復蘇已冷凍的第3代以內(包括第3代)臍帶間充質干細胞；②將臍帶間充質干細胞接種于DMEM/F12培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(直徑為100mm)中，調整細胞濃度為0. 4 0.6父105(^118/1111，置371，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；③至臍帶間充質干細胞完全貼壁，無需絲裂霉素C或γ -射線21Gy照射等處理。(3)臍帶血有核細胞的提取采集健康人的臍帶血，保存于抗凝血袋中，按5 1的體積比加入5%羥乙基淀粉 (HES)(臍帶血羥乙基淀粉為5 1)，混合均勻，于4°C冰箱靜置4 5小時，沉降紅細胞， 取上清，2000rpm離心lOmin，獲得有核細胞，其中含0. 83%⑶34+細胞(⑶34為造血干細胞表面抗原)。(4)臍帶血造血干細胞培養(yǎng)、擴增滋養(yǎng)層間充質干細胞培養(yǎng)至完全貼壁時，全量換液為特定培養(yǎng)基(此特定培養(yǎng)基 DMEM/F12 RPMI1640 為 1 1 混合，另含 10% FBS 和 10%臍帶血血漿，pH = 7. O 7. 4)， 并接種臍帶血有核細胞共同培養(yǎng)(臍帶血有核細胞接種濃度為5 8X 105cells/ml)，每隔3 4天更換半量培養(yǎng)基，至第10 11天即可收集細胞，此時收集的細胞中造血干細胞最為豐富。若要獲得更多的造血干細胞，將收集的細胞接種于重新制備好的含臍帶間充質干細胞滋養(yǎng)層的特定培養(yǎng)基中，每隔34天更換半量培養(yǎng)基，至第10 11天即可收集細胞，多次重復此培養(yǎng)、擴增過程可獲得大量造血干細胞。實施例2、造血干細胞體外擴增效果測定(1)測定分組將提取的臍帶血有核細胞接種于下面各組，以比較造血干細胞體外擴增效果。A組(僅含MSC)臍帶間充質干細胞作滋養(yǎng)層，培養(yǎng)基為DMEM/F12 RPMI1640 為 1 1 混合,另含 10% FBS, pH = 7. 0 7. 4 ；B組(僅含細胞因子)無臍帶間充質干細胞滋養(yǎng)層，培養(yǎng)基為DMEM/ F12 RPMI1640為1 1混合，另含10% FBS和干細胞生長因子(SCF) 30ng/ml、血小板生成素(TPO) 20ng/ml、FLT-3 配體(FL) 20ng/ml, pH = 7. 0 7. 4 ；C組(MSC+細胞因子)臍帶間充質干細胞作滋養(yǎng)層，培養(yǎng)基為DMEM/ F12 RPMI1640為1 1混合，另含10% FBS和干細胞生長因子(SCF) 30ng/ml、血小板生成素(TPO) 20ng/ml、FLT-3 配體(FL) 20ng/ml, pH = 7. 0 7. 4 ；D組(MSC+臍血血漿)臍帶間充質干細胞作滋養(yǎng)層，培養(yǎng)基為DMEM/ F12 RPMI1640為1 1混合，另含10% FBS和10%臍帶血血漿，pH = 7. 0 7. 4。(2)擴增效果測定以上各組分別于培養(yǎng)第6和第11天測定⑶34+細胞和集落形成單位(Colony forming unit，CFU)擴增倍數(shù)。⑶34為造血干細胞表面抗原，⑶34+細胞數(shù)的多少反映造血干細胞的增殖情況，⑶34+細胞采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分離裝置進行分離，利用FACS Calibur流式細胞儀分析⑶34+細胞純度；集落形成單位(CFU)包括粒單系集落形成單位(Colony forming unit for granulocytes/macrophage, CFU-GM)、粒紅單巨核集落形成單位(Colony forming unit for granulocytes, erythroid, monocytes and megarkaryocytes, CFV-GEWA) ,tlM'B^MWMf^^-itL (Burst forming unit erythroid, BFU-E)和高增值潛能集落形成單位(High proliferative colony forming unit, HPP-CFU)，主要反映造血干細胞的增殖分化情況，利用甲基纖維素培養(yǎng)基(內含干細胞生長因子、白介素_3、白介素_6、粒細胞集落刺激因子、粒單細胞集落刺激因子和血小板生成素)培養(yǎng)分析，集落以細胞數(shù)大于50個計數(shù)。A組(僅含MSC)⑶34+細胞和集落形成細胞(CFU)擴增倍數(shù)第6天為2. 0倍和 4. 1倍、第11天為4. 1倍和6.0倍；B組(僅含細胞因子)⑶34+細胞和集落形成細胞(CFU)擴增倍數(shù)第6天為3. 0 倍和4. 3倍、第11天為3. 5倍和6. 5倍；C組(MSC+細胞因子)⑶34+細胞和集落形成細胞(CFU)擴增倍數(shù)第6天為4. 4 倍和6. 3倍、第11天為16. 8倍和10. 2倍；D組(MSC+臍血血漿)⑶34+細胞和集落形成細胞(CFU)擴增倍數(shù)第6天為20. 7 倍和11. 8倍、第11天為46. 6倍和22. 7倍。通過對比研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用臍帶間充質干細胞與臍帶血血漿，以臍帶血有核細胞為起始細胞，可以高效地體外擴增造血干細胞，且此方法對造血干細胞的分化具有一定
6的抑制或延緩緩作用，因此利用這種技術可以為臨床治療與研究提供成本低廉、擴增簡便、 低免疫原性的造血干細胞。
權利要求
1.人源臍帶血造血干細胞體外高效擴增技術，其特征是聯(lián)合應用臍帶間充質干細胞和臍血血漿，以臍帶血有核細胞為起始細胞進行體外擴增，其過程為培養(yǎng)臍帶間充質干細胞至完全貼壁作為滋養(yǎng)層一換液為含臍血血漿的特定培養(yǎng)基一接種臍帶血有核細胞一培養(yǎng)、 擴增。
2.根據(jù)權利要求1所述的擴增技術，其特征是聯(lián)合應用人臍帶間充質干細胞和人臍血血漿。
3.根據(jù)權利要求2所述的擴增技術，其特征是人臍帶間充質干細胞為第3代以內(包括第3代)的細胞。
4.根據(jù)權利要求1所述的擴增技術，其特征是培養(yǎng)臍帶間充質干細胞至完全貼壁作為滋養(yǎng)層。
5.根據(jù)權利要求1所述的擴增技術，其特征是培養(yǎng)中所用的特定培養(yǎng)基含DMEM/F12、 RPMI1640、FBS和臍帶血血漿。
6.根據(jù)權利要求5所述的擴增技術，其特征是特定培養(yǎng)基中DMEM/F12與RPMI1640按 1 1混合。
7.根據(jù)權利要求5所述的擴增技術，其特征是特定培養(yǎng)基中含10%體積濃度的臍帶血血漿，但不限于此濃度。
8.根據(jù)權利要求1所述的擴增技術，其特征是擴增過程每隔3 4天更換半量培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權利要求1所述的擴增技術，其特征是以人臍帶血有核細胞作為擴增起始細胞。
10.根據(jù)權利要求1所述的擴增技術，其特征是單次培養(yǎng)、擴增周期為10 11天，但不限于此周期。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源臍帶血造血干細胞體外高效擴增技術，本技術聯(lián)合應用臍帶間充質干細胞和臍血血漿進行造血干細胞體外擴增，其過程為培養(yǎng)臍帶間充質干細胞作為滋養(yǎng)層，以含臍血血漿的特定培養(yǎng)液作為造血干細胞的擴增培養(yǎng)基，以臍血有核細胞作為擴增起始細胞，本發(fā)明無需添加外源細胞因子，滋養(yǎng)層無需絲裂霉素C或γ-射線21Gy照射等處理，無需三維技術，即可高效擴增造血干細胞，具有成本低廉、擴增方便、產品低免疫原性等優(yōu)點，是一種適宜規(guī)?；a的技術，此技術的實際應用將會對臨床治療與研究產生重要作用。
文檔編號C12N5/0789GK102465112SQ20101053271
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月1日 優(yōu)先權日2010年11月1日
發(fā)明者張正前 申請人:張正前