專利名稱：含有a型流感特異性啟動子的重組細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中含有A型流感特異性啟動子的重組細(xì)胞及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
流感病毒(influenza virus)基因組由8段分段的RNA組成，每一段病毒RNA和 病毒的NP蛋白及聚合酶復(fù)合體(PA，PBl, PB2)組成病毒核蛋白復(fù)合體(vRNP)。每一段病 毒RNA都包括編碼區(qū)和兩端的非編碼區(qū)(UTR)組成，非編碼區(qū)3’的12個(gè)堿基和5’端的13 個(gè)堿基在八個(gè)片段中是高度保守的，這兩段保守堿基部分互補(bǔ)，形成一個(gè)部分配對的結(jié)構(gòu)， 對于病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制都是必須的，稱為流感病毒的啟動子。
熒光酶編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4所示。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供如下重組質(zhì)粒在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用； 或，如下重組細(xì)胞在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用
所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組 質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；
所述重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如下重組質(zhì)粒在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒 中的應(yīng)用；或，如下重組細(xì)胞在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用
所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組 質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；
所述重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供如下重組質(zhì)粒在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用；或， 如下重組細(xì)胞在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用
所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組 質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；
所述重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞。
所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛妇幋a基因；
所述出發(fā)表達(dá)載體為pR印4載體；
所述出發(fā)細(xì)胞為Hela細(xì)胞；
所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種重組細(xì)胞。
本發(fā)明所提供的重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞；所述 重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；
所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
所述出發(fā)細(xì)胞為Hela細(xì)胞；
所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛妇幋a基因；
所述出發(fā)表達(dá)載體為pR印4載體；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
如下融合基因在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍
由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
如下融合基因在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍
由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
如下融合基因在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍
由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序 列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛妇幋a基因；
所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；
所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
本發(fā)明所提供的含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因的重組細(xì)胞系在感染流 感病毒后可以通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)監(jiān)測流感病毒的繁殖程度，同時(shí)可用于有效篩選抗 流感病毒藥物。


圖1為pR印4-IAV-Luc質(zhì)粒圖譜。
圖2為不同量病毒感染Hela-IAV-Luc細(xì)胞后測量熒光素酶活性結(jié)果。
圖3為檢測已知抗病毒藥物利巴韋林(ribavirin)的抗病毒效果的結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
293T細(xì)胞(腎上皮細(xì)胞)購自ATCC，細(xì)胞系編號為CRL_11268 ；
Hela細(xì)胞(子宮頸癌細(xì)胞)購自ATCC，細(xì)胞系編號為CCL_2 ；
細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium)購自 Gibco 公司，含 有10%的胎牛血清(PAA) ·；培養(yǎng)條件:37°C,5% CO2 ；
A/WSN/33流感病毒毒株(公眾可從中國科學(xué)院微生物學(xué)研究所獲得，記載過 該材料的非專利文獻(xiàn)是 Gabriele Neumann PNAS 1999Generation of influenza A virusesentirely from cloned cDNAs)；
轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000 購自 invitrogen 公司；
熒光素酶活性測量試劑盒購自promega公司；
三氮唑核苷病毒唑(利巴韋林)購自Sigma公司；
潮霉素(Hygromycin)購自Roche 公司。
實(shí)施例1、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒及細(xì)胞系
一、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒及活性驗(yàn)證
1、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒
含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒是通過如下步驟的方法制備得到的
(1)以引物1和引物2組成的引物為引物對，以pGL3載體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得 到DNA片段，該DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
引物1(上游引物)
ATACGTCTCGGGG |AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAAl ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG(序列表中序列 1 所示)；
引物2 (下游引物)
ATACGTCTCATATT jAGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT] TTA CA CGGCGA TCTTTCCGCCC(序列表中序列2所示)(以上上下游引物中下劃線部分含有BsmBI酶切位點(diǎn)， 框線部分為流感啟動子序列，斜體部分為熒光素酶編碼基因序列)。
(2)將步驟(1)得到的DNA片段經(jīng)BsmBI酶切后，連接到經(jīng)BsmBI酶切的pHH21 載體(購自Promega公司)上，得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，抗性篩選，挑 取陽性克隆，將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果表明在 PHH21載體的BsmBI酶切位點(diǎn)上插入了序列表中序列3自5'末端第14到1734位核苷酸 序列，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將該質(zhì)粒命名為pHH21-IAV-Luc質(zhì)粒。
(3)將pHH21-IAV_Luc質(zhì)粒以NheI和PciI內(nèi)切酶(Takara)酶切，回收酶切片段， 以Klenow酶(購自Takara公司)補(bǔ)平末端后連入PvuII內(nèi)切酶消化的pR印4質(zhì)粒(購自 hvitrogen公司)，挑取陽性克隆，將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果表明在PR印4中正確插入了序列表中序列3自5'末端第14到1734位核苷 酸序列，其中，序列表中序列3自5'末端第14-58位和第1712位-1734位為流感啟動子序 列；序列表中序列3自5'末端第59位-1711位為熒光素酶編碼基因序列。將得到的重組 質(zhì)粒命名為pR印4-IAV-Luc (圖1)。
2、含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒的活性驗(yàn)證
為驗(yàn)證該質(zhì)粒的活性，將該質(zhì)粒用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 用細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)細(xì)胞，然后分別感染或不感染A/WSN/33病毒(Μ0Ι = 1)，1 后測量 熒光素酶活性，通過luminometer儀(ftOmega)讀取熒光素酶酶活，結(jié)果未感染病毒組只有 本底活性，而感染病毒組的酶活性高達(dá)數(shù)百萬，這說明該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，可以在RNA 聚合酶I的作用下轉(zhuǎn)錄形成包含流感病毒啟動子及熒光酶的類病毒RNA片段，在有病毒感 染的情況下，病毒的聚合酶就可以啟動熒光酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄而顯示報(bào)告基因活性，該報(bào) 告基因活性就反應(yīng)了流感病毒在細(xì)胞里面的復(fù)制情況。
二、構(gòu)建含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因的細(xì)胞系
1、pR印4-IAV-Luc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞
pR印4-IAV-Luc質(zhì)粒擴(kuò)增后，測量質(zhì)粒濃度，轉(zhuǎn)染20 μ g質(zhì)粒至IOcm培養(yǎng)皿中的 Hela細(xì)胞。同時(shí)，用同樣的方法用空質(zhì)粒pR印4轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)細(xì) 胞。
2、篩選穩(wěn)定表達(dá)流感特異啟動子報(bào)告基因的細(xì)胞
轉(zhuǎn)染36h之后，更換新鮮培養(yǎng)基，并加入200 μ g/ml的潮霉素進(jìn)行篩選，每隔2_3 天換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)維持潮霉素的篩選壓力，三周后獲得穩(wěn)定表達(dá)流感特異啟動子報(bào)告 基因的細(xì)胞系，命名為Hela-IAV-Luc。同時(shí)獲得轉(zhuǎn)空質(zhì)粒對照細(xì)胞系。
3、Hela-IAV-Luc 細(xì)胞的增殖
在獲得Hela-IAV-Luc細(xì)胞系后，增殖細(xì)胞時(shí)潮霉素濃度減半，改為100 μ g/ml潮 霉素，并進(jìn)行細(xì)胞的凍存。
4、Hela-IAV-Luc 細(xì)胞的鑒定
將Hela-IAV-Luc細(xì)胞傳代至12孔板中，過夜培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，以PBS溶液洗 滌后，不接種或接種A/WSN/33病毒(Μ0Ι = 2)，12h后測量熒光酶活性，在不接種病毒時(shí)，只 能檢測到本底的酶活性，而在接種病毒后酶活性高達(dá)數(shù)百萬以上；轉(zhuǎn)空質(zhì)粒對照細(xì)胞系只 能檢測到本底的酶活性。此結(jié)果說明所得到的Hela-IAV-Luc細(xì)胞系能夠反應(yīng)流感病毒在 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。
實(shí)施例2、含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因質(zhì)粒及細(xì)胞系的應(yīng)用
1、病毒粒子數(shù)量與熒光素酶活性線性關(guān)系區(qū)間確認(rèn)
在96孔板中每孔接種15000個(gè)Hela-IAV-Luc細(xì)胞，15小時(shí)后分別感染不同數(shù)量 的流感病毒(A/WSN/33流感病毒毒株)，感染12小時(shí)后通過Meady-Glo Luciferase檢測 試劑盒在glomax儀(promega公司)讀取每孔中熒光素酶發(fā)光量(熒光素酶發(fā)光量與樣品 中熒光素酶活性成正比)，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果取平均值，得到的結(jié)果如圖2和表1所示。 在病毒數(shù)量和細(xì)胞數(shù)量比例(MOI)低于40時(shí)，熒光素酶發(fā)光量與MOl兩者之間就是正對應(yīng) 關(guān)系，MOI低于5時(shí)，兩者之間是線性關(guān)系(y = 32873x+62007,R2 = 0. 984)。在應(yīng)用96孔 板檢測每孔接種15000個(gè)細(xì)胞數(shù)時(shí)，能檢測到的病毒粒子數(shù)可達(dá)9375個(gè)。
MOI =病毒粒子個(gè)數(shù)與細(xì)胞個(gè)數(shù)的比值。
表權(quán)利要求
1.如下重組質(zhì)粒在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用；或，如下重組細(xì)胞在制備檢 測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；所述重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞。
2.如下重組質(zhì)粒在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用；或，如下重組細(xì)胞在 制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；所述重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞。
3.如下重組質(zhì)粒在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用；或，如下重組細(xì)胞在篩選抗流感病 毒藥物中的應(yīng)用所述重組質(zhì)粒是在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT ；所述重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入所述重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞。
4.根據(jù)1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于 所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛妇幋a基因； 所述出發(fā)表達(dá)載體為PR印4載體；所述出發(fā)細(xì)胞為Hela細(xì)胞； 所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
5.一種重組細(xì)胞，是向出發(fā)細(xì)胞中轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒，得到的重組細(xì)胞；所述重組質(zhì)粒是 在出發(fā)表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)間插入如下融合基因，得到的重組質(zhì)粒；所述融合基因，是由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核 苷酸序列為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組細(xì)胞，其特征在于 所述出發(fā)細(xì)胞為Hela細(xì)胞；所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛妇幋a基因； 所述出發(fā)表達(dá)載體為PR印4載體；所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
7.如下融合基因在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序列 為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
8.如下融合基因在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序列 為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
9.如下融合基因在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用由片段1、報(bào)告基因和片段2依次連接構(gòu)成的融合基因；片段1的核苷酸序列 為 AGTAGAAACAGGGTAGATAATCACTCACTGAGTGACATCGGTAAA，片段 2 的核苷酸序列為 AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCT。
10.根據(jù)7-9中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述報(bào)告基因?yàn)闊晒馑孛妇幋a基因；所述流感病毒為A/WSN/33流感病毒；所述融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3自5'末端第14到1734位所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了含有A型流感特異性啟動子的重組細(xì)胞及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的重組細(xì)胞的應(yīng)用為所述重組細(xì)胞在制備檢測流感病毒的試劑盒中的應(yīng)用、所述重組細(xì)胞在制備篩選抗流感病毒藥物的試劑盒中的應(yīng)用或所述重組細(xì)胞在篩選抗流感病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的含有A型流感特異性啟動子的報(bào)告基因的重組細(xì)胞在感染流感病毒后可以通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)監(jiān)測流感病毒的繁殖程度，同時(shí)可用于有效篩選抗流感病毒藥物。
文檔編號C12Q1/68GK102031305SQ201010532889
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者劉婷, 葉昕, 張軍杰, 李剛, 童曉梅 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所