專利名稱：菲律賓蛤仔大防御素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌肽，具體涉及菲律賓蛤仔大防御素及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗菌肽是一類廣泛存在于整個(gè)生物界的雙親性小分子堿性多肽，是機(jī)體先天免 疫的關(guān)鍵因子。根據(jù)抗菌肽的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗菌特性等，將已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽分為四大 類不含半胱氨酸的線型抗菌肽，如天蠶素、馬蓋寧等；具有半胱氨酸的環(huán)型抗菌肽，如防 御素，抗真菌肽等，可作用于革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌和真菌；富含某一種或兩種氨基酸的抗 菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等，主要作用于革蘭氏陰性 菌；由前體大分子酶解產(chǎn)生的抗菌肽，如肢口綱中鱟的血藍(lán)蛋白。因此抗菌肽可以作用于 革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，也作用于真菌、原蟲、某些病毒和腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還能加速 免疫和傷口愈合過(guò)程?？咕牡淖饔脵C(jī)理與傳統(tǒng)抗生素不同，它的靶位點(diǎn)主要是病原體細(xì) 胞膜，因此不易產(chǎn)生抗藥性，并且抗菌肽對(duì)真核細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒副作用，僅僅作用于原核細(xì) 胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞。由于病原菌對(duì)抗生素逐步產(chǎn)生抗藥性，抗菌肽作為新的抗細(xì) 菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤藥物開辟了廣闊的前景；目前國(guó)外已有4種抗菌肽藥物進(jìn)入 m期臨床，2種進(jìn)入π期臨床測(cè)試。貝類抗菌肽的研究始于1996年，到目前為止共發(fā)現(xiàn)了十余種貝類抗菌肽，主要集 中在貽貝(Mytilus edulis)和紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)上，如貽貝防御素 (MGD)、貽貝素(mytilin)、貽貝肽(Myticin)和貽貝霉素(Mytimycin)，均為富含半胱氨酸 的小分子抗菌肽，在生理PH下帶正電荷。M⑶分離自紫貽貝，M⑶含有38個(gè)氨基酸殘基， 含有2個(gè)半胱氨酸；貽貝素具有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基；貽貝肽具有40個(gè)氨基酸殘基； 貝類霉素分離自貽貝，是一種抗真菌肽，具有12個(gè)半胱氨酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種菲律賓蛤仔大防御素，該菲律賓蛤仔大防 御素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌有效。本發(fā)明還提供了菲律賓蛤仔大防御素的制備方法和應(yīng)用，該制備方法能得到純度 較高的重組的菲律賓蛤仔大防御素，具體可以在開發(fā)抗菌藥物中的得到應(yīng)用。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為菲律賓蛤仔大防御素，包括從感 染病菌的菲律賓蛤仔提取總RNA、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、大防御素基因篩選、基因 克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟得到該大防御素，該大防御素的氨 基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。該大防御素具有94個(gè)氨基酸，含有6個(gè)半胱氨酸；該大防御素與目前報(bào)道的貝類 大防御素具有不同結(jié)構(gòu)，該大防御素缺少前域結(jié)構(gòu)和GAAAVT㈧AA的N末端的疏水結(jié)構(gòu)，6 個(gè)半胱氨酸組成為二硫鍵鍵橋C-X6-C-X3-C-X13 (14) -C-X4-C-C。所述病菌為鰻弧菌。
菲律賓蛤仔大防御素的制備方法，其特征在于包括下述步驟
1)總RNA提取用Trizol試劑從感染鰻弧菌的菲律賓蛤仔(Venerupis phi lippinarum)的血淋巴中提取總RNA，得到RNA，存于_80°C備用；提取方法依 Invitrogen公司的Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行；
2)mRNA純化用OligotexmRNA純化試劑盒將上述RNA純化得到mRNA，純化方法依據(jù) QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；
3)cDNA模板溶液制備用cDNA Synthesis Kit試劑盒(購(gòu)于Stratagene公司)將上 述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，具體操作方法依試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行包括雙鏈cDNA經(jīng)末 端補(bǔ)平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒(購(gòu)于QIAGEN公司)對(duì)大于IOObp的酶切片段進(jìn)行回收， 回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體(購(gòu)于Invetrogen公司)連接，得到是cDNA質(zhì) 粒，用 ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit 試劑盒(購(gòu)于 Stratagene 公司)對(duì) cDNA 質(zhì)粒進(jìn)行噬菌體包裝、滴度測(cè)定、噬菌體文庫(kù)擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體文庫(kù)加入體積百分終濃 度為7%的二甲基亞砜(DMS0)，得到含大防御素基因的cDNA模板溶液，存于_80°C ；具體包 裝、測(cè)定和擴(kuò)增方法依試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；
4)基因克隆對(duì)上述含大防御素基因的cDNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，PCR 擴(kuò)增的上游引物的核苷酸序列為3’-ACCTCTACCA CTAAGGCATC G_5’，下游引物的核苷酸序 列為3’ -CAAATAGCGA ATGAGTTAGG AA-5’，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(購(gòu)于上海中科開瑞生 物芯片公司)進(jìn)行回收和純化得到PCR純化產(chǎn)物，將所述PCR純化產(chǎn)物與pMD-18T載體(購(gòu) 于大連寶生生物工程有限公司)連接得到克隆質(zhì)粒，克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10F感受態(tài) 細(xì)胞(購(gòu)于北京全氏金生物技術(shù)有限公司)中，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒提取，得到大防御素基因 的克隆質(zhì)粒；
3’端PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR反應(yīng)緩沖液(buffer溶液)2. 5 μ 1、摩爾濃度為25 mM的MgCl2溶液1. O μ 1、摩爾濃度為2. 5 mM的dNTP溶液2. O μ 1、 摩爾濃度為10 μΜ的所述下游引物溶液1 μ 1、摩爾濃度為10 μΜ的通用引物Τ7溶液 1 μ 1、濃度為5 υ/μ 1的Taq DNA聚合酶(polymerase) 0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用 PCR 水定容到 25 μ 1 (16. 3 μ 1 of PCR-grade water)；反應(yīng)在 ABI Veriti (購(gòu) 于ABI公司)中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30 秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；
5’端PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR反應(yīng)緩沖液(buffer溶液)2.5 μ 1、 摩爾濃度為25 mM的MgCl2溶液1. O μ 1、摩爾濃度為2. 5 mM的dNTP溶液2. O μ 1、摩爾 濃度為10 μ M的所述上游引物溶液1 μ 1、摩爾濃度為10 μ M的通用引物Τ3溶液1 μ 、 濃度為5 υ/μ 1的Taq DNA聚合酶(polymerase) 0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用 PCR水定容到25 μ 1,反應(yīng)在BI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5 分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒，60 V退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行 34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；
上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、Taq DNA聚合酶均購(gòu)自Promega公司，通用引物 T7、通用引物T3購(gòu)自上海生工科技有限公司；
5)重組質(zhì)粒構(gòu)建對(duì)大防御素基因的克隆質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)正向引物為
5含有Mfe I酶切位點(diǎn)的核苷酸序列3 ’ -CATATGCTGT GTCTGGACCA AAAGCC-5 ’，其中劃線 上的序列表示Mfe I酶切位點(diǎn)，反向引物為含損ο I酶切位點(diǎn)和6個(gè)His純化標(biāo)簽的 3’ -CTCGAGTTAT GGTGGTGGT GGTGGTGGTG ACGTCCTGTA ATGTG-5，核苷酸序列，其中前劃線 上的序列表示Mfe I酶切位點(diǎn)，后劃線上的序列表示6個(gè)His (TGG)純化標(biāo)簽；將擴(kuò)增片 段純化回收，導(dǎo)入PMD18-T simple (購(gòu)于大連寶生生物工程有限公司)載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì) 粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司)中，篩選陽(yáng)性亞克 隆質(zhì)粒，提取陽(yáng)性亞克隆質(zhì)粒，用Mfe I和損ο I (均購(gòu)于NEB公司)雙酶切亞克隆質(zhì)粒，用 膠回收純化試劑盒(大連寶生生物工程有限公司)對(duì)酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，得到編 碼重組蛋白的大防御素重組基因，測(cè)序該大防御素重組基因，該大防御素重組基因的核苷 酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，將該大防御素重組基因?qū)虢?jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體 pET-21a (購(gòu)于Novagen公司)，得到重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒構(gòu)建具體依《分子克隆第三版》操 作方法擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒，60°C 退火30秒，72 °C延伸30秒，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；
7)大防御素重組基因表達(dá)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)-plysS(購(gòu)于 北京全式金生物技術(shù)有限公司)，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)，挑取單克隆重組質(zhì)粒，將單 克隆重組質(zhì)粒接種于200ml Super Optimal Broth (SOB，購(gòu)于上海生工科技有限公司)培 養(yǎng)基中，接種濃度為220rpm，37°C培養(yǎng)至0D600=0. 5-0. 7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)，使終濃度達(dá)到lmmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，4°C，5000rpm，離心lOmin，收集菌液；
8)重組蛋白純化對(duì)上述菌液超聲破碎、離心、提取、GE的HisTrap螯合柱層析純化、洗 脫，得到重組蛋白，即本發(fā)明的菲律賓蛤仔大防御素，經(jīng)測(cè)序，該重組蛋白的氨基酸序列如 序列表SEQ ID N0. 2所示，具體純化方法依蛋白純化試劑盒的說(shuō)明書操作。
本發(fā)明的引物由上海生工科技有限公司合成。菲律賓蛤仔大防御素在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于菲律賓蛤仔大防御素，包括從感染病菌的菲 律賓蛤仔提取總RNA、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、大防御素基因篩選、基因克隆、重組質(zhì) 粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟得到該大防御素，該大防御素的氨基酸序列如 序列表SEQ ID N0. 2所示；該大防御素屬于一類新穎的大防御素，對(duì)海洋來(lái)源的多種革蘭氏 陽(yáng)性和陰性病原微生物均具有很強(qiáng)的抑制活性，具有開發(fā)為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和 飼料添加劑等方面的應(yīng)用價(jià)值；該菲律賓蛤仔大防御素的制備方法，通過(guò)總RNA提取、mRNA 純化、cDNA模板溶液制備、大防御素基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重 組蛋白純化步驟，能得到純度較高的重組的菲律賓蛤仔大防御素。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實(shí)施例菲律賓蛤仔大防御素的制備
一、用Trizol試劑從感染鰻弧菌的菲律賓蛤仔的血淋巴中提取總RNA，得到總RNA，提 取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說(shuō)明書進(jìn)行取菲律賓蛤仔血細(xì)胞50ml，2000g離心lOmin，棄上清，向沉淀細(xì)胞中加入20ml的TRIZOL (Invitrogen)中，用高速分散器將 細(xì)胞分散，室溫下劇烈震蕩10秒；加入4ml氯仿，劇烈震蕩30秒；4°C 10，OOOg高速離心 IOmin ；吸取上清液于一個(gè)新離心管中，加入冰浴過(guò)的等體積異丙醇(約15ml)，置于_20°C 靜置1小時(shí)以上；4°C 10，OOOg高速離心10分鐘；小心棄去上清液；用5ml 70%的乙醇清 洗沉淀；4°C 10，OOOg高速離心10分鐘，小心棄去上清液；真空干燥5分鐘，用約600 μ 1 RNase-free water溶解RNA，待完全溶解后儲(chǔ)存于_8(TC備用。二、用Oligotex mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA，具體純化方法依 QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行包括在37°C水浴加熱Oligotex Suspension,震蕩混勻，室溫放置；70°C水浴加熱OEB Buffe ；向500 μ 1總RNA溶液(RNA 含量約為 2mg)中加入650 μ 1 of OBB buffer, 135 μ 1 of Oligotex Suspension,650 μ 1 of RNase-free water，70°C加熱體系3分鐘；取出反應(yīng)體系后，室溫下放置10分鐘， 15, OOOg離心2分鐘，小心吸走上清液，用600μ 1 0W2重懸Oligotex-mRNA沉淀，劇烈震蕩。 然后將懸濁液移入放在1. 5ml離心管中的spin column內(nèi)，15，000g離心1分鐘，將spin column轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml離心管中，加入600 μ 1 0W2，15，000g離心1分鐘，將進(jìn)入離 心管的液體丟棄，將spin column轉(zhuǎn)移到另一新的1. 5ml離心管中；向spin column中加入 50 μ 1已經(jīng)加熱到70°C的OEB buffer，輕輕混勻，15，OOOg離心1分鐘；向spin column再加 入50 μ 1 OEB buffer,混勻后15，000g離心1分鐘；回收離心管中的mRNA溶液約100 μ 1。三、用cDNA Synthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶切片段，具體 操作依試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行包括雙鏈cDNA經(jīng)末端補(bǔ)平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷 酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切等，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對(duì)大于 IOObp的酶切片段進(jìn)行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA 質(zhì)粒，用ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒對(duì)cDNA質(zhì)粒進(jìn)行噬菌體包裝、 滴度測(cè)定和噬菌體文庫(kù)擴(kuò)增，具體方法參照說(shuō)明書進(jìn)行，擴(kuò)增后的文庫(kù)加入終濃度為7%的 DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于-80°C備用。逆轉(zhuǎn)錄方法包括一鏈cDNA合成在RNase-free的200 μ 1離心管中依次需用試 劑混勻，然后加入30 μ 1 poly (A)+ RNA (5 μ g)，混勻，室溫下放置10分鐘，使引物與模 板充分退火，向體系中加入1.5μ 1的一鏈合成酶StrataScript RT (50U/μ 1)，終體積達(dá) 到50μ 1，輕輕混勻反應(yīng)體系，離心數(shù)秒，42°C溫育1小時(shí)。二鏈合成在冰上依次向含有一 鏈cDNA的離心管中加入需用反應(yīng)物反應(yīng)，再向反應(yīng)體系中加入2μ 1 RNase H(l. 5U/y 1), 11 μ 1 DNA polymerase I (9. OU/μ 1)，輕輕混勻反應(yīng)體系，離心數(shù)秒，16°C放置2. 5小時(shí)后 立即將反應(yīng)體系置于冰上。補(bǔ)平cDNA末端向二鏈合成體系中加入需用反應(yīng)物，快速震蕩 反應(yīng)體系離心后，于72°C反應(yīng)30分鐘；加入200μ1酚一氯仿[1:1 (ν/ν)]，震蕩混勻體系， 室溫下高速離心2分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中；加入等體積的氯仿，震蕩混勻，室溫下 高速離心2分鐘，然后轉(zhuǎn)移上清至新管中；加入下列試劑使cDNA沉淀，并震蕩體系20 μ 1 3Μ sodium acetate, 400 μ 1 100% (ν/ν) ethanol, - 20°C 沉淀過(guò)夜；4°C高速離心 60 分 鐘，小心棄去上清，保留沉淀；加入500 μ 1的70%乙醇輕輕洗滌沉淀，室溫高速離心2分 鐘；輕輕吸去乙醇，在真空離心機(jī)中干燥沉淀；用9 μ 1含有EcoR I adapters的溶液溶解 沉淀并于4°C放置至少30分鐘。EcoR I接頭的連接向體系中加入下列成分1 μ 1 10Χ ligase buffer, 1 μ 1 IOmM rATP, 1 μ 1 Τ4 DNA ligase (4U/μ 1)，離心后 8 °C 放置過(guò)夜；700C 30分鐘滅活連接酶。磷酸化EcoR I末端離心反應(yīng)物2秒，室溫放置5分鐘冷卻，加 入下列反應(yīng)物用于磷酸化接頭1 μ 1 IOXligase buffer, 2 μ 1 IOmM rATP,5y 1 sterile water, 2 μ 1 T4 polynucleotide kinase (5U/μ 1)，37°C溫育 30 分鐘，70°C 30 分鐘滅活激 酶，離心2秒后室溫放置5分鐘冷卻。Xho I內(nèi)切酶酶切向體系中加入下列成分28 μ 1 Xho I buffer supplement, 3 μ 1 Xho I (40U/μ 1)，37°C溫育 1· 5 小時(shí)，加入 125 μ 1 的 100% (ν/ν)乙醇，_20°C放置過(guò)夜，4°C離心60分鐘，棄去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1 ddH20溶 解沉淀。cDNA片段回收方法從濃度為1. 0%的瓊脂糖凝膠上將DNA帶切下，將大約250mg 的膠塊放入1.5ml離心管中，加入相當(dāng)于3倍膠塊體積的Buffer QXl JfQIAEX II劇烈震 蕩30秒，充分混勻，向含有膠塊的Buffer QXl中加入60μ1 QIAEX II，50°C加熱10分鐘， 溶解膠塊；每2分鐘震蕩一次，保持溶液始終為黃色；13，OOOrpm離心30秒，小心吸去上清 液；用500 μ 1 Buffer QXl清洗沉淀，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30秒并小心吸去上清液； 用500 μ 1 PE Buffer清洗沉淀2次，重懸沉淀，13，OOOrpm離心30秒，棄上清液，真空干燥 15分鐘至沉淀變白，加入20 μ 1 ρΗ8. 5的IOmM Tris-Cl溶液室溫下溶解5分鐘。cDNA 與載體(Uni-ZAP XR vector，Invetrogen)連接在另一干凈的 200μ1 離心管中依次加入下列試劑2· 5μ 1 resuspended cDNA OlOOng), 0. 5 μ 1 IOXligase buffer, 0. 5 μ 1 IOmM rATP (ρΗ7. 5)，1. 0 μ 1 Uni-ZAP XR vector (1 μ g) ,0. 5μ 1 Τ4 DNA Iigase (4υ/μ1)。12°C放置過(guò)夜。噬菌體文庫(kù)的包裝從-80°C冰箱中取出包裝蛋白，迅速用手握住融化，立即加 入4μ 1重組cDNA，用微量移液器吸頭混勻體系(不要產(chǎn)生氣泡)，離心5秒，室溫(22°C)溫 育2小時(shí)，加入500 μ 1的SM buffer和20 μ 1氯仿，輕輕混勻反應(yīng)體系。快速離心數(shù)秒， 沉淀蛋白碎片，轉(zhuǎn)移上清至新管中。包裝反應(yīng)的滴度測(cè)定在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化 鈉10g，胰蛋白胨log，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，ρΗ7· 5)上將菌株XLl-Blue MRF，劃線 培養(yǎng)，37°C過(guò)夜培養(yǎng)；用LB液體培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化鈉10g，胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，pH7. 5)培養(yǎng)單克隆菌落，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜；4°C，IOOOg下離心10分鐘沉 淀細(xì)菌。用25ml IOmM MgS04重懸細(xì)菌；用10 mM MgSO4重懸XLl-Blue MRF，細(xì)胞，使?jié)?度達(dá)到0D600 = 0. 5 ；將包裝產(chǎn)物按下列比例與宿主菌混合(1) 1 μ 1包裝產(chǎn)物+ 200 μ 1 XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5) ；(2)0. 1μ 1 包裝產(chǎn)物 + 200 μ 1 XLl-Blue MRF，(OD600 = 0. 5);將混合體系置于37°C溫育15分鐘使噬菌體充分附著在宿主細(xì)胞表面；加入3ml融化 狀態(tài)下約48 °C的NYZ上層培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有氯化鈉5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵 母提取物5g，瓊脂糖7g，pH7. 5);迅速鋪在干燥預(yù)熱過(guò)的NYZ瓊脂培養(yǎng)基(1升培養(yǎng)基含有 氯化鈉5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺10g，酵母提取物5g，瓊脂粉15g，ρΗ7· 5)上，靜置10分 鐘后，倒置于37°C過(guò)夜培養(yǎng)；8小時(shí)后可見噬菌斑；分別計(jì)數(shù)兩個(gè)平板的噬菌斑數(shù)目，計(jì)算 其滴度(每毫升生長(zhǎng)的噬菌斑數(shù)目，pfu/ml )。30°C 200rpm條件下，用LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)XLl-Blue MRF’細(xì)胞50ml ； IOOOg 離心宿主細(xì)胞10分鐘；用25ml 10 mM MgS04重懸細(xì)胞，測(cè)定600納米可見光下菌液吸光 度，然后用10 mM MgS04將菌液稀釋至濃度為0D600 = 0. 5 ；將含有大約5X104 pfu噬菌 體顆粒的懸濁液與600 μ 1濃度為0D600 = 0. 5的XLl-Blue MRF，細(xì)胞混合，置于Falcon
82059聚丙烯管中，37°C溫育混合液15分鐘，使噬菌體充分附著在宿主菌表面；將混合液加 入約48°C的6. 5ml液態(tài)NZY上層培養(yǎng)基中，混勻后倒入新鮮的150mmNZY瓊脂糖培養(yǎng)基平 板上，靜置平板十分鐘，倒轉(zhuǎn)平板置于37°C約8小時(shí)(噬菌斑直徑不超過(guò)2mm)；在每塊平 板上倒入大約IOml SM緩沖液(1升緩沖液中含有5. 8g NaCl, 2. Og MgS04 · 7H20，50. Oml IM Tris-HCl[pH 7. 5], 5.0 ml 2%[w/v]白明膠)，4°C放置過(guò)夜；將所有平板上的SM緩沖液 回收入新的聚丙烯管中，每塊平板再用2ml SM緩沖液清洗一次并回收上清液；向回收液中 加入終濃度為5% (ν/ν)的氯仿，室溫下放置15分鐘，混勻，500g離心10分鐘去除細(xì)胞碎 片，將上清液轉(zhuǎn)移至新聚丙烯管中，并重復(fù)步驟8、9至上清液澄清，加入終濃度為7% (ν/ν) DMS0，儲(chǔ)存于-80°C。測(cè)定擴(kuò)增文庫(kù)滴度(方法同前)。四、cDNA模板溶液中大防御素基因的確認(rèn)用Exassist Helper Phage和SOLR菌 株均購(gòu)于Stratagene公司)從Uni-ZAP XR Vector上體外切割pBluescript噬菌粒(進(jìn)行 體外切割；然后質(zhì)粒cDNA的大規(guī)模提取和測(cè)序分析獲得目的EST序列，對(duì)上述EST測(cè)序結(jié) 果，用BLASTn和BLASTx程序分析，根據(jù)相似性分析結(jié)果尋找出大防御素基因片段。五、對(duì)上述含大防御素基因的cDNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，PCR擴(kuò) 增的上游引物的核苷酸序列為3’ -ACCTCTACCA CTAAGGCATC G-5’，下游引物的核苷酸序 列為3’ -CAAATAGCGA ATGAGTTAGG AA_5’，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化得到 PCR純化產(chǎn)物，將所述PCR純化產(chǎn)物與pMD-18T載體連接得到克隆質(zhì)粒，克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸 桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒提取，得到大防御素基因的克隆質(zhì)粒；3’端 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR buffer溶液2.5 μ 1、摩爾濃度為25 mM的 MgCl2溶液1. 0 μ 1、摩爾濃度為2. 5 mM的dNTP溶液2. 0 μ 1、摩爾濃度為10 μ M的下游 引物溶液1 μ 1、摩爾濃度為10 μ M的通用引物Τ7溶液1 μ 1、濃度為5 U/μ 1的Taq DNA polymerase 0.2 μ 1，cDNA模板(文庫(kù))溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1;反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性 30秒，60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5，端 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR buffer溶液2.5 μ 1、摩爾濃度為25 mM的 MgCl2溶液1.0 μ 1、摩爾濃度為2. 5 mM的dNTP溶液2.0 μ 1、摩爾濃度為10 pmol/μ 的 上游引物溶液1 μ 1、摩爾濃度為10 pmol/μ 1的通用引物Τ3溶液1 μ 1、濃度為1 U/μ 1 的 Taq DNA polymerase 0.2 μ 1，所述 cDNA 模板溶液 1 μ 1，用 PCR 水定容到 25 μ 1， 反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循 環(huán)94°C變性30秒，60 V退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72°C延 伸10分鐘；
六、對(duì)大防御素基因的克隆質(zhì)粒再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)正向引物為含有Mfe I酶切 位點(diǎn)的核苷酸序列3，-CATATGCTGT GTCTGGACCA AAAGCC-5，，反向引物為含損ο I酶切位點(diǎn) 和 6 個(gè) His 純化標(biāo)簽的核苷酸序列3，-CTCGAGTTAT GGTGGTGGTG GTGGTGGTG ACGTCCTGTA ATGTG-5’ ；將擴(kuò)增片段純化回收，導(dǎo)入pMDIS-T simple載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿 菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性亞克隆質(zhì)粒，提取陽(yáng)性亞克隆質(zhì)粒，用Mfe I和損ο I雙酶 切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白 的大防御素重組基因，測(cè)序該大防御素重組基因，該大防御素重組基因的核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO. 1所示，將該大防御素重組基因?qū)虢?jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-21a，得
9到重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒構(gòu)建具體依《分子克隆第三版》操作方法擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94°C 預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；
七、將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21-plysS中，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)，挑 取單克隆重組質(zhì)粒，將單克隆重組質(zhì)粒接種于200ml Super Optimal Broth培養(yǎng)基中，接種 濃度為220rpm，37°C培養(yǎng)至0D600=0. 5-0. 7，加入IPTG，使終濃度達(dá)到lmmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng) 3 h，4°C，5000rpm，離心 lOmin，收集菌液；
八、對(duì)上述菌液超聲破碎、離心、提取、GE的HisTrap螯合柱層析純化、洗脫，得到重 組蛋白，即本發(fā)明的菲律賓蛤仔大防御素，經(jīng)測(cè)序，該重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示；在收集的菌體沉淀，加入適量的菌體裂解液(0.5M NaCl, 5mM咪唑，IOmM Tris. HCl pH8. 0，lmg/ml溶菌酶)重懸沉淀，向體系中加入lmg/ml的溶菌酶，室溫放置半 小時(shí)；超聲波處理，條件為20W，處理60次，每次2秒，間隔14秒；用15 %的SDS-PAGE分 離膠電泳分析(Laemmli, 1970)上清和沉淀，Coomassie brilliant blue R-250后用凝膠 成像系統(tǒng)照相。應(yīng)用例
將菲律賓蛤仔大防御素加入試管中制成濃度為2 μ g/ml抗菌肽液共9管，分別接種金 黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、芽孢桿菌、鰻弧菌、牙鲆腸弧菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、 膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌和溝腸桿菌各5ul，使每管最終菌液濃度約為5X105CFU/ml，培養(yǎng)24 小時(shí)后，利用酶標(biāo)儀測(cè)定600nm的光吸收值，確定MIC值，得到如表1所示的結(jié)果，從表1 中可以看出，菲律賓蛤仔大防御素對(duì)上述三種革蘭氏陽(yáng)性菌和上述6種革蘭氏陰性菌都有 效，說(shuō)明本發(fā)明的菲律賓蛤仔大防御素是一種廣譜抗菌肽，且療效較好。表1 菲律賓蛤仔大防御素抗菌素療效表
受試菌MIC值金黃色葡萄球菌3. 3μΜ藤黃微球菌>26. 3μΜ芽孢桿菌26. 3μΜ鰻弧菌26. 3μΜ牙鲆腸弧菌6. 6μΜ惡臭假單胞菌3. 3μΜ奇異變形桿菌>26. 3μΜ膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌26. 3μΜ溝腸桿菌>26. 3μΜ
權(quán)利要求
菲律賓蛤仔大防御素，包括從感染病菌的菲律賓蛤仔提取總RNA、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、大防御素基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟得到該大防御素，其特征在于該大防御素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔大防御素，其特征在于該菲律賓蛤仔大防御素具有 94個(gè)氨基酸，含有6個(gè)半胱氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔大防御素，其特征在于所述病菌為鰻弧菌。
4.權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔大防御素的制備方法，其特征在于包括下述步驟1)總RNA提取用Trizol試劑從感染鰻弧菌的菲律賓蛤仔的血淋巴中提取總RNA，得 到總RNA，存于-80°C備用；2)mRNA純化用OligotexmRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA ；3)cDNA模板溶液制備用cDNASynthesis Kit試劑盒將上述mRNA逆轉(zhuǎn)錄并酶切為酶 切片段，用QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit純化試劑盒對(duì)大于IOObp的酶切片段 進(jìn)行回收，回收的酶切片段與Uni-ZAP XR vector載體連接，得到cDNA質(zhì)粒，cDNA質(zhì)粒用 ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒進(jìn)行噬菌體文庫(kù)包裝、滴度測(cè)定、噬菌體 文庫(kù)擴(kuò)增，擴(kuò)增后的噬菌體文庫(kù)加入二甲基亞砜，加入的二甲基亞砜體積百分終濃度為7%， 得到含大防御素基因的cDNA模板溶液，存于-80°C備用；4)基因克隆對(duì)上述含大防御素基因的cDNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，PCR 擴(kuò)增的上游引物的核苷酸序列為3’-ACCTCTACCA CTAAGGCATC G_5’，下游引物的核苷酸序 列為3’ -CAAATAGCGA ATGAGTTAGG AA_5’，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收和純化得到 PCR純化產(chǎn)物，將所述PCR純化產(chǎn)物與pMD-18T載體連接得到克隆質(zhì)粒，克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸 桿菌T0P10F感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒提取，得到大防御素基因的克隆質(zhì)粒；3’端 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μ 1、摩爾濃度為25 mM的 MgCl2溶液1.0 μ 1、摩爾濃度為2.5 mM的dNTP溶液2.0 μ 1、摩爾濃度為10 μ M的所 述下游引物溶液1 μ 、摩爾濃度為 ο μΜ的通用引物Τ7溶液1 μ 、濃度為5υ/μ1的 Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1 ；反應(yīng)在ABI Veriti 中進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒， 60 °C退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5’端PCR擴(kuò) 增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為10 X PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μ 1、摩爾濃度為25 mM的MgCl2溶 液1.0 μ 1、摩爾濃度為2. 5 mM的dNTP溶液2.0 μ 1、摩爾濃度為10 μ M的所述上游引物 溶液1 μ 1、摩爾濃度為10 μ M的通用引物Τ3溶液1 μ 1、濃度為5 U/μ 1的Taq DNA聚合 酶0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1，反應(yīng)在BI Veriti 中 進(jìn)行，反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒，60 V 退火30秒，72°C延伸60秒，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；5)重組質(zhì)粒構(gòu)建對(duì)大防御素基因的克隆質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增正向引物為含有 Nde I酶切位點(diǎn)的的核苷酸序列3’-CATATGCTGT GTCTGGACCA AAAGCC-5’，反向引物為含 有損ο I 酶切位點(diǎn)的的核苷酸序列3，-CTCGAGTTAT GGTGGTGGTG GTGGTGGTG ACGTCCTGTA ATGTG-5，，所述反向引物含有6個(gè)His純化標(biāo)簽TGG，將擴(kuò)增片段純化回收，導(dǎo)入pMD18_T simple載體，構(gòu)建亞克隆質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性亞克隆質(zhì)粒， 提取陽(yáng)性亞克隆質(zhì)粒，用Mfe I和損ο I雙酶切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)生的目的片段純化回收，得到編碼重組蛋白的大防御素重組基因，測(cè)序該大防御素重組基 因，該大防御素重組基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，將該大防御素重組基因 導(dǎo)入經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-21a，得到重組質(zhì)粒；6)大防御素重組基因表達(dá)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)-plysS中，篩 選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)序確認(rèn)，挑取單克隆重組質(zhì)粒，將單克隆重組質(zhì)粒接種于200ml Super Optimal Broth培養(yǎng)基中，接種濃度為220rpm，37 °C培養(yǎng)至0D600=0. 5-0. 7，加入異丙 基-β -D-硫代半乳糖苷，使終濃度達(dá)到lmmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，4°C，5000rpm，離心lOmin， 收集菌液；7)重組蛋白純化對(duì)上述菌液超聲破碎、離心、提取、GE的HisTrap螯合柱層析純化、洗 脫，得到重組蛋白，即本發(fā)明的菲律賓蛤仔大防御素，經(jīng)測(cè)序，該重組蛋白的氨基酸序列如 序列表SEQ ID NO. 2所示。
5.權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔大防御素在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了菲律賓蛤仔大防御素及其制備方法和應(yīng)用，包括從感染病菌的菲律賓蛤仔提取總RNA、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、大防御素基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟得到該大防御素，該大防御素的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；該大防御素屬于一類新穎的大防御素，對(duì)海洋來(lái)源的多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性病原微生物均具有很強(qiáng)的抑制活性，具有開發(fā)為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應(yīng)用價(jià)值；該菲律賓蛤仔大防御素的制備方法，通過(guò)總RNA提取、mRNA純化、cDNA模板溶液制備、大防御素基因篩選、基因克隆、重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組基因表達(dá)和重組蛋白純化步驟，能得到純度較高的重組的菲律賓蛤仔大防御素。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101985469SQ20101053308
公開日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者李太武, 李成華, 蘇秀榕, 趙建民 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)