專利名稱：表達輪狀病毒類表達顆粒的畢赤酵母、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，特別是，利用酵母系統(tǒng)表達輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，組裝輪狀病毒類病毒顆粒，用于預(yù)防輪狀病毒感染。
背景技術(shù)：
輪狀病毒是全球嬰幼兒嚴重腹瀉病最常見的病原體之一，其主要感染小腸上皮細胞，從而造成細胞損傷，引起腹瀉。輪狀病毒每年在夏秋冬季流行，感染途徑為糞一口途徑， 臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎，呈滲透性腹瀉病，病程一般為7天，發(fā)熱持續(xù)3天，嘔吐2 3天， 腹瀉5天，嚴重出現(xiàn)脫水癥狀。輪狀病毒總共有七種，分別以英文字母編號為A、B、C、D、E、F與G等。人類主要是受到輪狀病毒A種、B種與C種的感染，而其中最常見的是輪狀病毒A種的感染。而這七種輪狀病毒都會在其他動物身上造成疾病。在輪狀病毒A種之中有不同的病毒株，稱之為血清變異株(serovar)。與流行性感冒病毒類似，輪狀病毒使用了雙重的分類系統(tǒng)，依據(jù)病毒體表面的兩個結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)來作分類的。糖蛋白VP7定義了 G型。而對于蛋白酶敏感的蛋白質(zhì)VP4則定義了 P型。P型會以一個數(shù)字來標示出P血清型，并用方括弧內(nèi)部的一個數(shù)字來標示所對應(yīng)的P基因型。G 血清型的表示方法也很類似，但是G基因型的數(shù)字會與G血清型的數(shù)字相同。舉個例來說， “輪狀病毒W(wǎng)a病毒株”(rotavirus strain Wa)就會被標示成“P1A[8]G1”。因為這兩個決定G型跟P型的基因可以被分開傳送而產(chǎn)生后代，所以兩基因不同的組合就會產(chǎn)生各種不同的病毒株。輪狀病毒的基因組包括了 11條獨特的核糖核酸雙螺旋分子，這11條中總共有 18，555個核苷堿基對。每一條螺旋或是分段即是一個基因，并且依照分子尺寸由大到小依次編號為1到11。每一個基因都可以編碼成一種蛋白質(zhì)，而其中第9基因與第11基因比較特別，它們都可以編碼成兩種蛋白質(zhì)。核糖核酸外圍則是包圍了三層二十面體的蛋白質(zhì)衣殼。病毒顆粒大約直徑76. 5nm，并且沒有病毒包膜。有六個病毒蛋白架構(gòu)了整個病毒顆粒 (病毒體)。這些結(jié)構(gòu)蛋白分別被稱為￥ 1、￥ 2、￥ 3、￥ 4、￥ 6與￥ 7。除了這些結(jié)構(gòu)蛋白之外，還有六個非結(jié)構(gòu)性蛋白(nonstructural protein，NSP)，這六個蛋白僅僅在輪狀病毒感染的細胞中制造，而沒有構(gòu)成病毒體的結(jié)構(gòu)。這六個非結(jié)構(gòu)性蛋白分別稱為NSP1、NSP2、 NSP3、 NSP4、NSP5 與 NSP6。由輪狀病毒基因組所編碼的12個蛋白質(zhì)中，至少6個會與核糖核酸結(jié)合。這些蛋白在輪狀病毒復(fù)制時所扮演的角色目前還沒有完全被了解；它們的功用被認為有可能是與病毒體內(nèi)核糖核酸的合成與包裝相關(guān)，或是與將信使核糖核酸輸送至基因體復(fù)制現(xiàn)場相關(guān)，或是與信使核糖核酸轉(zhuǎn)譯與基因調(diào)節(jié)相關(guān)。結(jié)構(gòu)性蛋白VPl蛋白位于病毒體核心，是一種核糖核酸聚合酶。在被感染的細胞中，這種酶會產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)合成所需的信使核糖核酸轉(zhuǎn)錄復(fù)本，以及產(chǎn)生輪狀病毒基因體核糖核酸片段拷貝來提供新產(chǎn)生的病毒體使用。
VP2蛋白形成病毒體的核心層，并且結(jié)合核糖核酸基因體。VP3蛋白是病毒體內(nèi)核的一部分，而且是一種稱為鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶(gimnylyl transferase)的酶。這種酶是一種加帽酶(Capping enzyme)，也就是制作信使核糖核酸轉(zhuǎn)錄后修飾時候所用的5'端帽的酶。這個5'端帽保護病毒的信使核糖核酸免受核酸酶(以核酸為底物的水解酶)水解，使之能夠保持穩(wěn)定。VP4蛋白位于病毒體的表面，突出來而成為一個刺突(spike)。它與細胞表面受體結(jié)合，與病毒粘附細胞有關(guān)。在病毒有傳染性之前，VP4蛋白會被一種可以在內(nèi)臟發(fā)現(xiàn)的蛋白酶改變成VP5*蛋白與VP8*蛋白。VP4蛋白決定了該病毒的毒性(Virulence)，而它也決定了該病毒的P血清型。VP6蛋白形成殼體。它是抗原性強的蛋白質(zhì)，并且可以被用來分辨輪狀病毒的種類。這個蛋白質(zhì)被實驗室用來進行輪狀病毒A種感染的檢測試驗中。VP7蛋白是一種構(gòu)成病毒體外層衣殼的糖蛋白。除了在病毒結(jié)構(gòu)上的功用之外，它也決定該病毒株的G血清型。VP7蛋白質(zhì)跟VP4蛋白質(zhì)一樣，都是免疫的主要靶標，是防止感染的主要途徑。輪狀病毒毒株在各地有很大差異，但人類的輪狀病毒疾病主要是由5種血清型引起的，其中中國以G1P8和G3P8血清型為主。現(xiàn)在上市的輪狀病毒疫苗主要以人-動物重配株和動物減毒株活疫苗為主，這類疫苗應(yīng)用可以導(dǎo)致腸套疊等嚴重副反應(yīng)的發(fā)生。由輪狀病毒不同血清型產(chǎn)生的感染，疫苗的交叉保護性可能較弱，以及目前疫苗可能產(chǎn)生的嚴重副反應(yīng)，強烈需要新的輪狀病毒疫苗來滿足治療和預(yù)防的需要。發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種新血清型的人輪狀病毒類病毒顆粒作為輪狀病毒感染的候選疫苗分子。在本發(fā)明的一個方面，公開了一種人輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達盒，包括以下元件(a)起始信號元件AOX ；(b)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因；(C)終止信號元件TT。優(yōu)選所述輪狀病毒VP2由SEQ ID NO 1編碼；所述輪狀病毒VP4由SEQ ID NO 5 編碼；所述輪狀病毒VP6由SEQ ID NO 2編碼；或所述輪狀病毒VP7由SEQID NO :3或SEQ ID NO :4 編碼。在本發(fā)明的第二個方面，提供了一種用上述表達盒轉(zhuǎn)染的酵母細胞，其特征在于， 所述酵母細胞的染色體內(nèi)整合有上述表達盒，所述表達盒表達輪狀病毒VP2、VP4、VP6和 VP7結(jié)構(gòu)蛋白，所述酵母細胞在甲醇誘導(dǎo)下表達輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，且所述的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白在所述酵母中自行裝配成類病毒顆粒。在該方面的一個優(yōu)選例中，酵母細胞選自畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母。更優(yōu)選的，酵母細胞選自畢赤酵母GS115菌株和KM71菌株。在該方面的另一個優(yōu)選例中，表達盒插入PPIC3.漲質(zhì)粒。本發(fā)明的第三個方面提供了一種制備輪狀病毒類病毒顆粒的方法，包括步驟(i)在適合表達的條件下，培養(yǎng)上述酵母細胞，從而表達輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2、 VP4.VP6 和 VP7 ；和
(ii)從培養(yǎng)物中分離出類病毒顆粒。本發(fā)明的第四個方面提供了用上述方法制備的類病毒顆粒，其由輪狀病毒VP2、 VP4、VP6和VP7蛋白組成。在該方面的一個優(yōu)選例中，VP7蛋白選自Gl或G3血清型。在該方面的另一個優(yōu)選例中，VP4蛋白是P8血清型。在該方面的另一個優(yōu)選例中，輪狀病毒VP2為SEQ ID NO 8 ；所述輪狀病毒VP4為 SEQ ID NO 12 ；所述輪狀病毒VP6為SEQ ID NO 9 ；或所述輪狀病毒VP7選自SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的氨基酸序列。本發(fā)明的第五個方面提供了類病毒顆粒的用途，用于制備預(yù)防或治療輪狀病毒感染的疫苗組合物。本發(fā)明的第六個方面，提供了上述酵母細胞的制備方法，包括步驟a)用上述表達盒插入到pPIC3.漲質(zhì)粒中，使質(zhì)粒同時含有輪狀病毒VP2、VP4、VP6 和VP7結(jié)構(gòu)基因的表達盒；b)用所述表達輪狀病毒VP2、VP4、VP6和VP7的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化酵母細胞，整合入酵母染色體中，從而獲得上述生產(chǎn)輪狀病毒類病毒顆粒的酵母細胞。附圖簡述

圖1顯示了重組G1P8酵母菌破菌液的蛋白質(zhì)印跡分析。其中各泳道為1 陰性酵母菌對照；2 蛋白Marker ；3-6 :1號-4號4個重組G1P8酵母菌的破菌液。圖2顯示了重組酵母菌的蔗糖密度梯度離心分析。其中各泳道如下1 陰性對照； 2 蛋白標記(Marker) ；3-7 陰性酵母菌梯度離心收樣；8 蛋白標記；9 1號酵母菌離心上樣原樣；10-14 :1號酵母菌梯度離心收樣；15 :2號酵母菌離心上樣原樣；16-20 :2號酵母菌密度梯度離心收樣；21 3號酵母菌離心上樣原樣；22- ，25 蛋白標記；26-27 3號酵母菌密度梯度離心收樣；28 4號酵母菌離心上樣原樣；29-33 4號酵母菌密度梯度離心收樣。 其中丨號和4號酵母克隆形成VLP顆粒的可能性較大。圖3顯示了重組G1P8酵母菌(GS115菌株，1號克隆)的分子篩分析。圖4顯示了重組G1P8酵母菌(1號克隆)分子篩收樣的蛋白質(zhì)印跡鑒定。各泳道樣品如下1 =GlPS酵母菌破菌上清；2 破菌上清超濾濃縮；3 超濾棄液；4 蛋白標記； 5-8 分子篩第一個蛋白峰；9-19 分子篩第二個峰；13 蛋白標記。分子篩的第1個和第2 個蛋白峰收集的樣品經(jīng)蛋白質(zhì)印跡鑒定，第1個蛋白峰的收樣可見輪狀病毒VP6蛋白特異性條帶G1000)，可能包含形成的VLP ；第2個蛋白峰的收樣未見特異性輪狀病毒VP6蛋白條帶。圖5顯示了重組G1P8酵母菌(KM71菌株)表達蛋白的分子篩分析。圖6顯示了重組G1P8酵母菌(KM71菌株)分子篩收樣的蛋白質(zhì)印跡鑒定。其中各泳道樣品如下1 :G1P8酵母菌破菌液超濾濃縮(1 5稀釋后上樣)；2-:GlP8酵母菌破菌液超濾前；3 蛋白標記；4 蛋白標記；5-13 分子篩第一個蛋白峰收樣；14 陰性對照；15 蛋白標記；16-23:分子篩第二個蛋白峰收樣。破菌液經(jīng)蛋白質(zhì)印跡分析，可見分子篩第1和第2個峰均含有輪狀病毒VP6蛋白。圖7a顯示了圖3中第一個蛋白峰和圖7b顯示了圖5中第一個蛋白峰的透射電鏡觀察(X30000)結(jié)果。在第一個蛋白峰樣品中，均可見直徑在50-100nm之間，如箭頭所指，
5大小不均一的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)。圖3和圖5的第2個蛋白峰中均未見明顯的顆粒結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式1.類病毒顆粒通過體外基因重組技術(shù)獲得的類病毒顆粒(Virus-like particle, VLP)具有天然病毒的外部結(jié)構(gòu)及中和抗原成分，但不包含病毒DNA/RNA，因此VLP在體內(nèi)不會復(fù)制，提高了疫苗應(yīng)用的安全性，同時，VLP具有極好的免疫原性。由類病毒顆粒組成的亞單位疫苗逐漸成為預(yù)防病毒感染的重要候選疫苗分子。現(xiàn)在乙肝病毒和人巨細胞病毒VLP已經(jīng)通過美國藥監(jiān)局的許可。發(fā)明人經(jīng)過核苷酸及氨基酸同源性比較，選取與國際標準毒株及亞洲毒株同源性較大的中國地方人輪狀病毒毒株作為VP2、VP6、VP4(P8血清型)、VP7(G1和G3血清型)的 DNA模板鏈(見下文表1)，DNA序列根據(jù)畢赤酵母密碼子使用頻率表(見下文表幻進行了調(diào)整，構(gòu)建了含有人輪狀病毒VP2、VP4、VP6和VP7蛋白的重組畢赤酵母菌，組成G1P8和G3P8 不同的血清型，并在酵母系統(tǒng)內(nèi)自我組裝成類病毒顆粒(VLP)，對這些VLP進行了研究，作為進一步制備疫苗的工具。1.開發(fā)流程下面提供了開發(fā)特定血清型的輪狀病毒VLP的流程輪狀病毒VP2、VP4、VP6和VP7蛋白DNA模板序列的確定一基因優(yōu)化，全基因合成 —上游構(gòu)建質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株，形成雙層或三層輪狀病毒顆粒一誘導(dǎo)表達，及鑒定一VLP的下游純化2.抗體的制備在獲得了完整的特定血清型的類病毒顆粒后，通過純化回收，這些類病毒顆粒用其接種個體獲得保護性免疫。這種免疫方法和驗證免疫力的研究可參見下述文獻。[1] Offit PA, Dudzik KI.非感染性輪狀病毒(RRV株)在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的針對輪狀病毒感染 ^Ι^Ψ^^&Μ^· (Noninfectious rotavirus (strain RRV) induces an immune response in mice which protects against rotavirus challgenge.)臨床微生物學(xué)雜志，1989, 27(5) :885-888 ； [2]McNeal MM, Sheridan JF, Ward RL.腹膜內(nèi)免疫針對小鼠輪狀病毒感染的保護作用(Active protection against rotavirus infection of mice following intraperitoneal immunization.)病毒學(xué)雜志，1992,191 (1) :150-157 ; [3]Ciarlet Μ, Crawford SE, Barone C，等.輪狀病毒亞單位疫苗經(jīng)胃腸外免疫家兔所誘導(dǎo)的保護性免疫 (Subunit rotavirus vaccine administered parenteralIy to rabbits induces active protective immunity.)病毒學(xué)雜志，1998，72 (11) :9233-9246 ； [4] 0，Neal CM, Crawford SE, Estes MK，等，輪狀病毒樣顆粒經(jīng)粘膜免疫誘導(dǎo)的保護性應(yīng)答(Rotavirus virus-like particles administered mucosally induce protective immunity.)病毒學(xué)雜志，1997, 71(11) :8707-8717o3.組合物本發(fā)明的類病毒顆?？梢耘c其他組分聯(lián)合配制成組合物。例如，本發(fā)明的類病毒顆粒與佐劑一起混合，或者在施用前混合，或者可以在佐劑之前或之后施用，以提高免疫力。類病毒顆粒還可以與其他的添加成分混合，例如溶劑、抗菌劑、藥物學(xué)上可接受的載體、脂質(zhì)體、穩(wěn)定成分、色素、調(diào)味劑等一起混合，以方便施用。4.藥盒本發(fā)明的類病毒顆粒，以及組合物還可以制成藥盒用于施給需要免疫的個體。藥盒可含有說明書，以指示施用方案。藥盒中的各組分可以放置在不同容器中，也可以是混合的。這些成分可以同時、先后或間隔施用。利用類病毒顆粒免疫個體，以及各種免疫方案都是本領(lǐng)域技術(shù)人員水平范圍內(nèi)可以確定的。5.等價物本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)，或能確保不超過使用常規(guī)實驗，來理解本文所述的發(fā)明實施方式的許多等價方式。本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請都在說明書中以相同的程度引入，如同各獨立出版物、專利或?qū)＠暾埵翘貏e和分開在本文中引入的一樣。實施例材料和方法1質(zhì)粒及菌株pPIC3. 5K質(zhì)粒(購自Invitrogen)、大腸桿菌toplO、畢赤酵母GS115菌株及畢赤酵母KM71菌株購自hvitrogen公司。2.試齊[JT4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶 EcoR I、Not I、Mlu I、Bgl IKBspE I 禾口 BamH I 購自i^ermentas公司，DNA標記和蛋白標記均為!^ermentas公司產(chǎn)品，DNA凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品，抗VP6單克隆抗體-輪狀病毒衣殼(2B4)為Santa Cruz產(chǎn)品，DEAE Sepharose FF層析填料和AKTA純化系統(tǒng)購自GE公司。實施例1輪狀病毒VP蛋白結(jié)構(gòu)基因的優(yōu)化及合成通過Blast軟件分析，經(jīng)過核苷酸及氨基酸同源性比較，選取與國際標準毒株及亞洲毒株同源性較大的中國地方人輪狀病毒毒株作為VP2、VP6、VP4 (P8血清型)、VP7 (Gl和 G3血清型)的DNA模板鏈(表1)。DNA序列根據(jù)畢赤酵母密碼子使用頻率表(表幻，將目的基因全部同義替換，并去除一些AT富含區(qū)，調(diào)整GC含量為45-50%。同時將序列中與重組質(zhì)粒構(gòu)建有關(guān)的酶切位點(EcoR I ,Not I、Mlu I、Bgl II、BspE I和BamH I )進行同義突變。5’端添加Kozak(ACCATG或ACCGCCATG)序列，3’端添加終止密碼子。將優(yōu)化好的各個VP蛋白的結(jié)構(gòu)基因送南京金斯特生物科技有限公司合成。表1人輪狀病毒VP結(jié)構(gòu)蛋白模板鏈的選取_結(jié)構(gòu)蛋白模板_VP2/VP6 蛋白人 Wa 株VP7 蛋白(Gl 血清型)Chi-87 株VP7蛋白(G3血清型)北京97，S48株VP4 蛋白(P8 血清型)97，B53 株_表2畢赤酵母偏好密碼子使用表
權(quán)利要求
1.一種人輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達盒，其特征在于，包括以下元件(a)起始信號元件Α0Χ;(b)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因；(c)終止信號元件TT。
2.如權(quán)利要求1所述的人輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達盒，其特征在于，所述輪狀病毒VP2 由SEQ ID NO :1編碼；所述輪狀病毒VP4由SEQID NO 5編碼；所述輪狀病毒VP6由SEQ ID NO 2編碼；或所述輪狀病毒VP7由SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4編碼。
3.一種用權(quán)利要求1所述的表達盒轉(zhuǎn)染的酵母細胞，其特征在于，所述酵母細胞的染色體內(nèi)整合有權(quán)利要求1的表達盒，所述表達盒表達輪狀病毒VP2、VP4、VP6和VP7結(jié)構(gòu)蛋白，所述酵母細胞在甲醇誘導(dǎo)下表達輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白，且所述的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白在所述酵母中自行裝配成類病毒顆粒。
4.如權(quán)利要求3所述的酵母細胞，其特征在于，所述酵母細胞選自畢赤酵母、釀酒酵母或漢遜酵母。
5.如權(quán)利要求4所述的酵母細胞，其特征在于，所述酵母細胞選自畢赤酵母GS115菌株和KM71菌株。
6.如權(quán)利要求3-5任一所述的酵母細胞，其特征在于，所述表達盒插入pPIC3.漲質(zhì)粒。
7.一種制備輪狀病毒類病毒顆粒的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(i)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3所述的酵母細胞，從而表達輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白 VP2.VP4.VP6 禾口 VP7 ；禾口( )從培養(yǎng)物中分離出類病毒顆粒。
8.一種用權(quán)利要求7所述的方法制備的類病毒顆粒，其特征在于，所述類病毒顆粒由輪狀病毒VP2、VP4、VP6和VP7蛋白組成。
9.如權(quán)利要求8所述的類病毒顆粒的用途，其特征在于，用于制備預(yù)防或治療輪狀病毒感染的疫苗組合物。
10.權(quán)利要求3所述的酵母細胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括步驟a)用權(quán)利要求1所述的表達盒插入到PPIC3.漲質(zhì)粒中，使質(zhì)粒同時含有輪狀病毒 VP2、VP4、VP6和VP7結(jié)構(gòu)基因的表達盒；b)用所述表達輪狀病毒VP2、VP4、VP6和VP7的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)化酵母細胞，整合入酵母染色體中，從而獲得權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)輪狀病毒類病毒顆粒的酵母細胞。
全文摘要
本發(fā)明是一種表達輪狀病毒類表達顆粒的畢赤酵母、其制備方法及用途，公開了一種人輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達盒，包括以下元件(a)起始信號元件AOX；(b)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因；(c)終止信號元件TT。還公開了用其轉(zhuǎn)染的酵母細胞，用該酵母細胞制備輪狀病毒類病毒顆粒的方法，以及用該方法制備的類病毒顆粒，其用于制備預(yù)防或治療輪狀病毒感染的疫苗組合物的用途。還公開了上述酵母細胞的制備方法。
文檔編號C12N15/63GK102465137SQ20101053385
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者張群, 樓覺人, 竺滿溢 申請人:上海生物制品研究所有限責(zé)任公司