專利名稱：培養(yǎng)吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕霉素發(fā)酵液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)雷帕霉素的方法。
背景技術(shù)：
雷帕霉素(Rapamycin，RPM, RAPA)，又名西羅莫司(Sirolimus)，是在1耵5年由力口拿大Ayerst研究所從吸水鏈霉菌(Sti^pomyces hygroscopicus)中分離出來的三烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它作為一種新型的高效免疫抑制劑引起了廣泛的關(guān)注，同時(shí)它又是一種有效的抗真菌劑并具有抗腫瘤的作用。雷帕霉素是31元環(huán)組成的三烯大環(huán)內(nèi)酯化合物，含有特殊的α、β - 二酮乙哌啶酸胺分子掩蓋的半羧酮，其分子式為C51H79O13，分子量為991。雷帕霉素是一類親酯類抗生素，外觀通常為白色結(jié)晶體。易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，幾乎不溶于乙醚、己烷、石油醚，極微溶于水。在血漿中PH呈低中性，37°C時(shí)降解特別快，在血漿中半衰期為1 5h，在甲醇中不穩(wěn)定。其熔點(diǎn)為183 185°C，比旋光度[a ]D25 = 153° (甲醇)。Vezinia等于1975年發(fā)現(xiàn)它具有抗真菌作用，以后Tanaka等又發(fā)現(xiàn)它是一種極有前途的免疫抑制劑并具有抗腫瘤作用。同時(shí)西羅莫司具有很強(qiáng)的抗移植排斥反應(yīng)，并能與環(huán)孢素協(xié)同延長移植物存活時(shí)間，西羅莫司還能逆轉(zhuǎn)正在進(jìn)行的移植排斥反應(yīng)。另外，西羅莫司還有預(yù)防和治療實(shí)驗(yàn)性自身溶血性貧血的作用。雷帕霉素在防止動(dòng)物器官移植排斥作用的效果大大強(qiáng)于現(xiàn)行臨床廣泛應(yīng)用的環(huán)孢霉素A (cyclosporin A, CsA)，也勝于大環(huán)內(nèi)酯類同類藥物Π(506 (他克莫司)，是臨床上很有潛力的免疫抑制劑。由于RPM和CsA的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，與Π(506既相似，又有差異，RPM 與CsA、FK506等聯(lián)用均有良好的協(xié)同作用，聯(lián)用的益處在于減少了治療方案中各種免疫抑制劑的用量；減少了免疫抑制劑的副作用；增強(qiáng)了免疫抑制劑效果。雷帕霉素的作用機(jī)制和CsA及Π(506均不同。CsA和Π(506分別與細(xì)胞漿內(nèi)環(huán)孢親和素和FKBP12(H(506結(jié)合蛋白)相結(jié)合，抑制Calcineurin(鈣調(diào)磷酸酶)，阻止細(xì)胞因子如白介素-2(IL-2)的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，抑制T細(xì)胞活化的早期階段。RPM與Π(506具有相似的分子結(jié)構(gòu)，也能與FKBP12 結(jié)合，RAPA-FKBP12復(fù)合物與哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)結(jié)合，但它不阻斷T細(xì)胞生長因子的生成，而是阻斷這些因子提供的增生信號(hào)，抑制多種刺激引起的T和B淋巴細(xì)胞的增生，是細(xì)胞停留在細(xì)胞周期Gl期的晚期，阻止這些細(xì)胞進(jìn)入S期。綜上所述，雷帕霉素作為一種高效新型的免疫抑制劑，它在臨床器官移植及治療自身免疫疾病中具有重要的意義。1993年，美國Merck公司通過微生物轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化為雷帕霉素，前期種子液培養(yǎng)后，發(fā)酵液最終產(chǎn)生了 300mg/L的雷帕霉素。印度科學(xué)家從土壤中篩選了高產(chǎn)雷帕霉素鏈霉菌，且副產(chǎn)物極少，在高通氣量的糊精培養(yǎng)基中通過補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)生了 300 310mg/L的雷帕霉素。2004年，印度學(xué)者Vaid等對(duì)一株鏈霉菌進(jìn)行誘變，將植物油作為惟一碳源進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明連續(xù)發(fā)酵144 192h，雷帕霉素的產(chǎn)率可達(dá)到180 330mg/L。 1999年10月20日雷帕霉素在美國上市，為口服液劑型。此后采用伊蘭(Elan)公司的納米晶體技術(shù)制備的Img片劑也已在美國上市。2000年3月雷帕霉素在英國、德國、丹麥等國上市，此外雷帕霉素還在英國以口服混懸劑的方式銷售。由于美國生產(chǎn)的雷帕霉素在我國未能獲得行政保護(hù)，故國內(nèi)企業(yè)可以生產(chǎn)雷帕霉素。據(jù)了解，自2001年至今，國家食品藥品監(jiān)督管理局已先后批準(zhǔn)了 7家企業(yè)生產(chǎn)雷帕霉素，其中浙江新昌制藥廠、福建科瑞藥業(yè)、杭州中美華東制藥、華北制藥科研開發(fā)公司4家為雷帕霉素原料藥廠。目前，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的發(fā)酵水平均不高，最高產(chǎn)量在600mg/L-700mg/L。杭州中美華東醫(yī)藥股份有限公司已經(jīng)投入工業(yè)化生產(chǎn)(中國專利 CN200810019207. 8)，在10噸、50噸發(fā)酵罐上培養(yǎng)吸水鏈霉菌發(fā)酵能力在600mg/L左右。張薇等在《雷帕菌素高產(chǎn)菌株的推理選育與發(fā)酵新工藝研究》(2009年浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文)一文中公開了菌種選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化，在20噸發(fā)酵罐中發(fā)酵能力為700mg/L。由此可知，目前雷帕霉素生物發(fā)酵生產(chǎn)存在的不足在于雷帕霉素生物發(fā)酵單位不高，不利于提取純化，不能充分滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有雷帕霉素生產(chǎn)技術(shù)的不足，從而提供一種能夠更好地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵方法，具體包括一套培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件的控制方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明對(duì)吸水鏈霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)ACCC No. 40417進(jìn)行了平板培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)、種子罐種子培養(yǎng)和發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。具體實(shí)施過程如下a.平板培養(yǎng)將吸水鏈霉菌菌種接種于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，接種后恒溫培養(yǎng)5-7天；b.搖瓶種子培養(yǎng)在三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基，滅菌后接入平板培養(yǎng)所得的吸水鏈霉菌菌種，放置在立式搖床上，220-230rpm條件下培養(yǎng)50_70h，得搖瓶種子培養(yǎng)液；c.種子罐種子培養(yǎng)將搖瓶種子培養(yǎng)液按照種子罐培養(yǎng)基體積的11% -15%接種量接種于種子罐培養(yǎng)基，200-210rpm條件下培養(yǎng)35_46h，得種子罐種子液；d.發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)將種子罐種子液按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的11% -15%接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，初始攪拌轉(zhuǎn)速為180-220rpm，培養(yǎng)72_96h，菌體濕重0. 22-0. 23g/ml 時(shí)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為255-300rpm，培養(yǎng)105_150h ；發(fā)酵罐培養(yǎng)總時(shí)間170_230h。優(yōu)選的上述培養(yǎng)吸水鏈霉菌(Str印omyces hygroscopicus ACCC No. 40417)發(fā)酵生產(chǎn)雷帕霉素發(fā)酵液的方法，具體包括以下步驟a.平板培養(yǎng)將吸水鏈霉菌菌種接種于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿后，接種后于 28°C恒溫培養(yǎng)5-7天，取出放于4°C冰箱保存；b.搖瓶種子培養(yǎng)在250mL三角瓶中裝入50mL種子培養(yǎng)基，滅菌后接入4°C冰箱保存的吸水鏈霉菌菌種，放置在立式搖床上29°C，220-230rpm條件下培養(yǎng)50_70h，得搖瓶種子培養(yǎng)液；c.種子罐種子培養(yǎng)將搖瓶種子培養(yǎng)液按照種子罐培養(yǎng)基體積的11% -15%接種量接種于種子罐培養(yǎng)基，于29°C，200-2IOrpm條件下培養(yǎng)35_46h，得種子罐種子液；d.發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)將種子罐種子液按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的11% -15%接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，于29°C，初始攪拌轉(zhuǎn)速為180-220rpm，培養(yǎng)72_96h，待菌體濕重為0. 22-0. 23g/ml時(shí)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至255_300rpm，培養(yǎng)105_150h ；發(fā)酵罐培養(yǎng)總時(shí)間170_230h， 其中，在培養(yǎng)24h和48h時(shí)，分別一次性補(bǔ)加兩種物質(zhì)濃度為1. 的丙氨酸和濃度為 0.5%的賴氨酸。上述步驟所用培養(yǎng)基分別含有以下組份(1)固體培養(yǎng)基含有燕麥片、葡萄糖、酵母抽提物、碳酸鈣和瓊脂。(2)種子培養(yǎng)基含有可溶性淀粉、蛋白胨、酵母抽提物、花生粕和甘油。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉、黃豆餅粉、蛋白胨、葡萄糖、K2HPO4, KH2PO4和NaCL。上述步驟所用培養(yǎng)基的組份含量為(1)固體培養(yǎng)基含有燕麥片30_48g、葡萄糖15_25g、酵母抽提物5_18g、碳酸鈣 l-4g 和瓊脂 10-20g, pH 為 6. 8-7. 4。(2)種子培養(yǎng)基含有可溶性淀粉30_48g、蛋白胨2_8g、酵母抽提物5_16g、花生粕 4-15g、甘油 4-15g 和碳酸鈣 l_4g，pH 為 6. 7-7. 3。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉9_18g、黃豆餅粉4_15g、蛋白胨3_10g、葡萄糖 28-42g、K2HP040-8g、KH2PO4I-IOg 和 NaCLl_4g、碳酸鈣 l_5g 和泡敵 l_6g，pH 為 6. 5-7. 3。上述步驟所用培養(yǎng)基的最優(yōu)配方為(1)固體培養(yǎng)基的pH為7. 2，并且每升固體培養(yǎng)基含有燕麥片40g、葡萄糖20g、酵母抽提物log、碳酸鈣2g和瓊脂16g。(2)種子培養(yǎng)基的pH為7.0，并且每升種子培養(yǎng)基含有可溶性淀粉40g、蛋白胨 5g、酵母抽提物10g、花生粕10g、甘油IOg和碳酸鈣2g。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6. 9，并且每升發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉13g、黃豆餅粉 10g、蛋白胨 6g、葡萄糖 35g、K2HP043g、KH2P043g 和 NaCLlg、碳酸鈣 3g 和泡敵 3g。搖瓶種子培養(yǎng)基與種子罐種子培養(yǎng)基配方相同，本文統(tǒng)一命名為種子培養(yǎng)基。通過培養(yǎng)基的選擇及培養(yǎng)條件的控制，尤其轉(zhuǎn)速的控制，本發(fā)明能夠在培養(yǎng)吸水鏈霉菌過程中產(chǎn)生含有較高濃度雷帕霉素的發(fā)酵液，在100L發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中得到的發(fā)酵液的雷帕霉素平均濃度達(dá)到了 908. 69mg/L，在1000L發(fā)酵罐的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中得到的發(fā)酵液的雷帕霉素平均濃度達(dá)到了 895. 28mg/L，更有利于雷帕霉素的提取工作，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
具體實(shí)施例方式為了更好的說明本發(fā)明，下面通過實(shí)施例予以進(jìn)一步說明，但本發(fā)明絕不僅限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1100L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)(一 )培養(yǎng)基的配制固體培養(yǎng)基配方為每升固體培養(yǎng)基含有燕麥片40g、葡萄糖20g、酵母抽提物 10g、碳酸鈣2g和瓊脂16g，pH為7. 2。配制0. 6L。種子培養(yǎng)基配方為每升種子培養(yǎng)基含有可溶性淀粉40g、蛋白胨5g、酵母抽提物 10g、花生粕log、甘油IOg和碳酸鈣2g，pH為7. 0。配制7L。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為每升發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉13g、黃豆餅粉10g、蛋白胨6g、 葡萄糖 35g、K2HP043g、KH2P043g 和 NaCLlg、碳酸鈣 3g 和泡敵 3g，pH 為 6. 9。配制 60L。
( 二 )吸水鏈霉菌的平板培養(yǎng)固體培養(yǎng)基配置好后裝入三角瓶內(nèi)(lx750mL)，121°C滅菌21分鐘，同時(shí)將干凈的培養(yǎng)皿包好121°C滅菌21分鐘。然后待所滅菌的固體培養(yǎng)基稍冷卻后，每個(gè)滅菌后的培養(yǎng)皿倒入固體培養(yǎng)基約50mL，備用。將吸水鏈霉菌菌種接種于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，將接種后的培養(yǎng)皿放置在 28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)或生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5-7天后，取出放于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?三)250mL搖瓶種子培養(yǎng)在250mL三角瓶中裝入50mL的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入4°C冰箱保存的吸水鏈霉菌菌種，放置在立式搖床上29°C、230rpm培養(yǎng)58h，得搖瓶種子培養(yǎng)液，備用。(四)IOL種子罐的種子培養(yǎng)在IOL種子罐中裝入種子培養(yǎng)基7L，滅菌后接入搖瓶種子培養(yǎng)液800mL，在溫度 290C，通氣量1 0. 5，罐壓0. 05MPa,攪拌轉(zhuǎn)速210rpm的條件下培養(yǎng)46h，得到IOL種子罐
種子培養(yǎng)液。(五)100L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)在100L的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基70L，實(shí)罐滅菌后移入8L由IOL種子罐制備的種子培養(yǎng)液，在通氣量1 0.5，罐壓0.05MPa，溫度29°C，初始攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm條件下， 發(fā)酵培養(yǎng)72h，菌體濕重0. 22-0. 23g/ml時(shí)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為260rpm，培養(yǎng)108h。發(fā)酵罐培養(yǎng)總時(shí)間180h。在發(fā)酵過程中，菌絲生長階段，選擇發(fā)酵培養(yǎng)24h和48h時(shí)分別一次性補(bǔ)加兩種物質(zhì)濃度為1. 的丙氨酸和濃度為0. 5%的賴氨酸。按上述方法分別生產(chǎn)五批產(chǎn)品，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，收集五批發(fā)酵液，分別各取發(fā)酵液2ml，離心后，用3ml80%丙酮萃取，萃取液用高效液相色譜分析，得到五批發(fā)酵液中每批發(fā)酵液的雷帕霉素的濃度，平均濃度為908. 69mg/L。數(shù)據(jù)見表1。 表1、100L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果
權(quán)利要求
1.培養(yǎng)吸水鏈霉菌(Str印omyceshygroscopicus ACCC No. 40417)發(fā)酵生產(chǎn)雷帕霉素發(fā)酵液的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.平板培養(yǎng)將吸水鏈霉菌菌種接種于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，接種后恒溫培養(yǎng) 5-7 天;b.搖瓶種子培養(yǎng)在三角瓶中裝入種子培養(yǎng)基，滅菌后接入平板培養(yǎng)所得的吸水鏈霉菌菌種，放置在立式搖床上，220-230rpm條件下培養(yǎng)50_70h，得搖瓶種子培養(yǎng)液；c.種子罐種子培養(yǎng)將搖瓶種子培養(yǎng)液按照種子罐培養(yǎng)基體積的11%-15%接種量接種于種子罐培養(yǎng)基，200-210rpm條件下培養(yǎng)35_46h，得種子罐種子液；d.發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)將種子罐種子液按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的11%-15%接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，初始攪拌轉(zhuǎn)速為180-220rpm，培養(yǎng)72_96h，菌體濕重0. 22-0. 23g/ml時(shí)， 調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為255-300rpm，培養(yǎng)105_150h ；發(fā)酵罐培養(yǎng)總時(shí)間170_230h。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)吸水鏈霉菌(Str印omyceshygroscopicus ACCC No. 40417)發(fā)酵生產(chǎn)雷帕霉素發(fā)酵液的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.平板培養(yǎng)將吸水鏈霉菌菌種接種于含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，接種后于28°C恒溫培養(yǎng)5-7天后，取出放于4°C冰箱保存；b.搖瓶種子培養(yǎng)在250mL三角瓶中裝入50mL種子培養(yǎng)基，滅菌后接入4°C冰箱保存的吸水鏈霉菌菌種，放置在立式搖床上，于29 °C，220-230rpm條件下培養(yǎng)50_70h，得搖瓶種子培養(yǎng)液；c.種子罐種子培養(yǎng)將搖瓶種子培養(yǎng)液按照種子罐培養(yǎng)基體積的11%-15%接種量接種于種子罐培養(yǎng)基，于29°C，200-2IOrpm條件下培養(yǎng)35_46h，得種子罐種子液；d.發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)將種子罐種子液按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基體積的11%-15%接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，于29 °C，初始攪拌轉(zhuǎn)速為180-220rpm，培養(yǎng)72_96h，菌體濕重 0. 22-0. 23g/ml時(shí)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為255_300rpm，培養(yǎng)105_150h ；發(fā)酵罐培養(yǎng)總時(shí)間170_230h， 其中，在培養(yǎng)24h和48h時(shí)分別一次性補(bǔ)加濃度為1. 的丙氨酸和濃度為0. 5%的賴氨酸。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)基含有燕麥片、葡萄糖、酵母抽提物、碳酸鈣和瓊脂。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)基含有燕麥片30-48g、葡萄糖 15-25g、酵母抽提物 5-18g、碳酸鈣 l-4g 和瓊脂 10_20g，pH6. 8-7. 4。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述固體培養(yǎng)基的PH為7.2，并且每升固體培養(yǎng)基含有燕麥片40g、葡萄糖20g、酵母抽提物10g、碳酸鈣2g和瓊脂16g。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所采用的種子培養(yǎng)基含有可溶性淀粉、蛋白胨、酵母抽提物、花生粕和甘油。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所采用的種子培養(yǎng)基含有可溶性淀粉 30_48g、蛋白胨2-8g、酵母抽提物5-16g、花生粕4_15g、甘油4_15g和碳酸鈣l_4g，pH為 6. 7-7. 3。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所采用的種子培養(yǎng)基的pH為7.0，并且每升種子培養(yǎng)基含有可溶性淀粉40g、蛋白胨5g、酵母抽提物10g、花生粕10g、甘油IOg和碳酸鈣2g。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉、黃豆餅粉、蛋白胨、葡萄糖、K2HPO4、KH2PO4 和 NaCL。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉9-18g、黃豆餅粉 4-15g、蛋白胨 3-10g、葡萄糖 28-42g、K2HP040_8g、KH2PO4I-IOg 和 NaCLl_4g、碳酸鈣 l-5g 和泡敵 l_6g，pH 為 6. 5-7. 3。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.9，并且每升發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉13g、黃豆餅粉10g、蛋白胨6g、葡萄糖35g、K2HP043g、KH2P043g和 NaCLlg、碳酸鈣3g和泡敵3g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的培養(yǎng)吸水鏈霉菌生產(chǎn)雷帕素發(fā)酵液的方法。本發(fā)明通過發(fā)酵培養(yǎng)微生物菌株吸水鏈霉菌(Strepomyces hygroscopicus ACCC No.40417)，得到含有雷帕霉素的發(fā)酵液。通過本發(fā)明所述方法制得的雷帕霉素發(fā)酵液效價(jià)高，因而更有利于提取，可以更好地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/55GK102453737SQ20101054011
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者趙麗麗, 趙志全 申請(qǐng)人:山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司