專利名稱：連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號擴增檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生 物學(xué)領(lǐng)域，涉及連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng) 的核酸信號擴增檢測方法。
背景技術(shù)：
核酸檢測已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測以及傳染性疾病的預(yù)防與控制 等很多方面。目前常用的核酸檢測技術(shù)大多基于模板擴增原理，即擴增產(chǎn)物與靶核酸 序列相同，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction，PCR)、環(huán)介導(dǎo)的核 酸等溫擴增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermal Amplification, LAMP)、滾環(huán)擴增技術(shù) (Rolling Cycle Amplification, RCA)、基于核酸序列擴增技術(shù)(Nucleic Acid Sequence Based Amplification, NASBA)、轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的擴增技術(shù)(Transcription Mediated Amplification,TMA)、解鏈酶擴增技術(shù)(Helicase DependantAmp 1 ification,HDA)、鏈置換 擴增技術(shù)(Strand Displacement Amplification，SDA)等。上述核酸擴增方法由于擴增產(chǎn) 物與靶核酸序列相同，因此極易造成產(chǎn)物交叉污染，使核酸檢測經(jīng)常出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。為了避免擴增產(chǎn)物的交叉污染，近年來發(fā)展了一些不擴增靶核酸，而是由靶核酸 引發(fā)其他信號分子擴增，間接地對靶核酸進行檢測的核酸信號擴增檢測方法，如分枝DNA 法(Branch-DNA，B_DNA)、核酸侵入信號擴增實驗(Invader Assay)以及一些基于電化學(xué)檢 測的信號擴增法。其中，B-DNA法及核酸侵入信號擴增實驗均有較高的靈敏度，但它們都需 要合成特殊結(jié)構(gòu)或特殊熒光標(biāo)記的探針，提高了檢測成本；而基于電化學(xué)檢測的信號擴增 法往往靈敏度較低，達不到核酸檢測的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng) 與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號擴增檢測方法。本發(fā)明利用連接反應(yīng)，將核酸侵入反應(yīng)(Invasive reaction)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng) (Nickingreaction)偶聯(lián)，建立了一種新的高靈敏核酸信號擴增檢測方法。在所建立的方法 中首先進行核酸侵入反應(yīng)，該反應(yīng)利用核酸5’外切酶或5’ flap內(nèi)切酶能夠特異識別DNA 雙鏈中上游探針侵入下游雙鏈至少一個堿基形成的探針-靶核酸特異性結(jié)構(gòu)(如附圖1所 示)，并將下游探針5’不匹配片段(稱為flap片段)連同被侵入的堿基切斷，其切割位點 如附圖1中箭頭所指位置；之后利用連接反應(yīng)將切下的flap片段與信號分子(分子信標(biāo)) 上的另一寡核苷酸相連，連接后形成切刻內(nèi)切酶位點；最后進行切刻內(nèi)切酶反應(yīng)。切刻內(nèi)切 酶能夠識別DNA雙鏈特定序列但只切割其中一條單鏈形成一個切口。本發(fā)明具體技術(shù)方案 如下利用連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號擴增檢測方法，依 次包括以下步驟(如圖2所示)
1)核酸侵入信號擴增階段設(shè)計針對靶核酸特異性的一對探針，要求與靶核酸雜 交后，上游探針3’端必須侵入下游探針1個堿基，下游探針有一段翹起片段，稱為5’ flap, 并且其中下游探針與靶核酸互補區(qū)域的解鏈溫度在核酸5’外切酶或5’flap內(nèi)切酶的酶切 反應(yīng)溫度士 1°C范圍內(nèi)，而上游探針與靶核酸互補區(qū)域的解鏈溫度要高于核酸5’外切酶或 5’ flap內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)溫度5 10°C ；所述的靶核酸與所述的上、下游探針在核酸侵入 反應(yīng)體系中雜交形成探針-靶核酸特異性結(jié)構(gòu)，其中下游探針濃度大于上游探針濃度；向 反應(yīng)體系中加入核酸5’外切酶或5’ flap內(nèi)切酶，核酸5’外切酶或5’ flap內(nèi)切酶識別所 述的探針_靶核酸特異性結(jié)構(gòu)，并將下游探針的5’ flap連同與模板配對的第一個堿基切 下，因為所述的酶切反應(yīng)溫度接近下游探針與模板配對部分的熔解溫度，下游探針被切割 后會很快與靶核酸分離，沒有被切割的完整的下游探針會再次與靶核酸雜交，而上游探針 熔解溫度高于反應(yīng)溫度，可以牢固地結(jié)合在靶核酸上，與新雜交的完整的下游探針再次形 成所述的探針-靶核酸特異性結(jié)構(gòu)，進而繼續(xù)被核酸5’外切酶或5’ flap內(nèi)切酶切割，形成 flap片段的積累；2) flap連接階段向步驟1)的反應(yīng)體系中加入連接酶體系及環(huán)狀部分雜交有一 段5’磷酸化的寡核苷酸的分子信標(biāo)，在所述的連接酶體系中連接酶的作用下，步驟1)核酸 侵入信號擴增產(chǎn)生的flap片段會與所述的分子信標(biāo)環(huán)狀部分的5’磷酸化的寡核苷酸相 連，將分子信標(biāo)打開發(fā)出熒光信號，同時連接好的flap片段與信標(biāo)形成的雙鏈上的切刻內(nèi) 切酶識別位點形成，得到能發(fā)出熒光信號且含有切刻內(nèi)切酶識別位點的連接產(chǎn)物；3)切刻內(nèi)切酶信號擴增階段將切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系加入到步驟2)得到的連接 產(chǎn)物中，所述的切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系中的切刻內(nèi)切酶識別所述的切刻內(nèi)切酶識別位點，并 只切割分子信標(biāo)鏈，切割后的分子信標(biāo)兩部分片段與未切割的完整的分子信標(biāo)相比，解鏈 溫度低，在切刻內(nèi)切酶酶切反應(yīng)溫度下會與連接的flap片段分離，使分子信標(biāo)的熒光基團 與淬滅基團分離，新的完整的分子信標(biāo)會再次與連接的flap片段雜交，形成新一輪的切刻 內(nèi)切酶切割循環(huán)，這一過程使熒光信號逐漸增強，從而使靶核酸信號得到擴增4)信號檢測階段對步驟3)擴增得到的靶核酸信號進行檢測。其中，所述的核酸為DNA或RNA。所述的核酸侵入反應(yīng)體系包含MOPS、Tween-20、Nonidet P40、上游探針、下游探 針、MgCl2以及靶核酸。所述的核酸5，外切酶或5，flap內(nèi)切酶選自TaqPol、TthPol, TaqExo, AfuFEN、 PfuFEN、MjaFEN、MthFEN或其他類似的核酸5，外切酶或5，flap內(nèi)切酶，優(yōu)選AfuFEN。所述的連接酶體系包括由132mM Tris-HCl，20mM MgCl2, 2mM DTT,2mM ATP及 15% PEG 6000組成的pH 7. 6連接反應(yīng)緩沖液，5’磷酸化的與分子信標(biāo)環(huán)狀區(qū)域的一半互補的 寡核苷酸片段，分子信標(biāo)，水及連接酶；所述的切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系包括NaCl，20mM、pH7. 9 的Tris-HCl，MgCl2, DTT以及切刻內(nèi)切酶。所述連接酶選自大腸桿菌DNA連接酶、T4DNA連接酶、Taq DNA連接酶、AmpIigase DNA連接酶、9° N DNA連接酶、Ligase-65 DNA連接酶或其他類似的核酸連接酶，優(yōu)選T4 DNA連接酶。所述的切刻內(nèi)切酶選自Nb. BbvCI、Nb. BsmI、Nb. BsrDI、Nb. BtsI、Nt. AlwI、 Nt. BbvCI, Nt. BsmAI, Nt. BspQI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII 或其他類似的切刻內(nèi)切酶，優(yōu)選Nb. BsmI。所述的分子信標(biāo)一端標(biāo)記熒光基團，選自FAM、HEX、TET、J0E、TAMRA、Cy5或Cy3以 及其他類似的熒光基團，優(yōu)選FAM ；另一端標(biāo)記淬滅基團，選自DABCYL、ECLIPSE、TAMRA或 BHQ以及其他類似的熒光淬滅基團，優(yōu)選DABCYL。所述的切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系中還可以加入表面活性劑聚乙二醇6000 (PEG 6000)、 乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙烯-20脫水山梨醇單月桂酸酯(Tween-20)或抗 氧化劑二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)中的至少一種。這些表面活性劑或抗氧化劑的 加入可以顯著提高切刻內(nèi)切酶反應(yīng)效率。步驟4)所述的檢測可以通過熒光檢測裝置實現(xiàn)，優(yōu)選通過熒光分光光度計或?qū)?時熒光熱循環(huán)儀實現(xiàn)，進一步優(yōu)選通過實時熒光熱循環(huán)儀實現(xiàn)。本發(fā)明的有益效果在本發(fā)明整個核酸信號擴增檢測方法過程中，只有第一步核酸侵入信號擴增中的 上、下游探針需要針對不同模板進行設(shè)計，其它各步驟中的成分均可通用，并且上、下游探 針不需要任何修飾，成本低。由于核酸5’外切酶或5’ flap內(nèi)切酶僅識別上下游探針形成的特異結(jié)構(gòu)，對模板 序列沒有要求，所以本方法可以檢測任意模板，而無序列限制。本發(fā)明信號發(fā)生分子為已經(jīng)發(fā)展成熟并廣泛應(yīng)用的分子信標(biāo)，相對于其它信號擴 增的信號分子(如b-DNA)更加穩(wěn)定，廉價。利用本發(fā)明提供的方法進行核酸檢測時，擴增產(chǎn)物與靶核酸序列無關(guān)，不會造成 擴增產(chǎn)物的交叉污染是本發(fā)明的一大特色。利用本發(fā)明檢測方法，能夠?qū)怂岚行蛄羞M行檢測，并且由于核酸侵入反應(yīng)具有 很高的特異性，可以實現(xiàn)對侵入位點附近的單個堿基差異的核酸序列進行區(qū)分檢測。


圖1關(guān)于核酸侵入反應(yīng)中核酸5’外切酶或5’flap內(nèi)切酶識別的探針-靶核酸特 異性結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是關(guān)于本發(fā)明的連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號 擴增檢測方法的基本原理圖。圖3是關(guān)于實施例1檢測結(jié)果圖。圖4是關(guān)于實施例2檢測結(jié)果圖。圖5是關(guān)于實施例3檢測結(jié)果圖。有關(guān)附圖的詳細說明參見如下詳細描述部分的內(nèi)容。
具體實施例方式實施例1利用連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號擴增檢 測方法檢測人工合成寡核苷酸片段本實施例檢測了不同濃度的人工合成的單鏈DNA模板，用來驗證本發(fā)明所陳述的 核酸檢測方法的可行性并考察了方法的靈敏度，同時本實施例中還檢測了與靶核酸序列完 全不相關(guān)的另外一條寡核苷酸片段，用來驗證本發(fā)明所陳述的方法對序列的特異性。
6
反應(yīng)條件1)核酸侵入信號擴增核酸侵入反應(yīng)體系組成為IOmM MOPS, pH 7. 5,0. 05% Tween-20,0. 05% Nonidet Ρ40，0· 1 μ M 上游探針(序列為:5，-ATG TCA CTT CCC CTT GGT TCT CTC C-3，，即 SEQ ID NO. 1)，1μΜ下游探針(序列為:5，-AGC AGG ACG GGA TCT GGC CTG GTG C-3，，即 SEQ ID NO. 2)，7· 5mM MgCl2,向該體系中分別加入1000、100、10、1、0. 1及Oamol的靶核酸(序列為 5，-CTATTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA T-3，即 SEQ ID NO. 3)， 以及IOpmol與靶核酸序列完全不相關(guān)的另外一條寡核苷酸干擾片段(序列為5’ -TAC GAGACC TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCT ATC AGG CAG T-3，，即 SEQ ID NO. 4)，經(jīng)95°C 孵育5分鐘后，向各管中加入71ng的AfuFEN，63°C反應(yīng)2小時，各管反應(yīng)總體積均為10 μ L。2)連接反應(yīng)核酸侵入反應(yīng)結(jié)束后，向核酸侵入反應(yīng)各管中分別加入25μ L的2Χ連接反應(yīng) 緩沖液(132mM Tris-HCl，20mM MgCl2, 2mM DTT,2mM ATP, 15% PEG 6000，pH 7. 6) ,4. 8μ L 10μ M的5’磷酸化的與分子信標(biāo)環(huán)狀區(qū)域的一半互補的寡核苷酸片段(序列為5’-P-ATG CAC TCATCTA-3，，SEQ ID Ν0. 5), 4. 0 μ L 10 μ M 的分子信標(biāo)(序列為5，F(xiàn)AM-CGC ACG CTA GAT GAGTGC ATT CCC GTC CTG CTG CGT GCG-DABCYL-3，，即 SEQ ID Ν0. 6，委托大連寶生物公 司合成)以及5. 7yL水，45°C孵育5分鐘，26°C加入0. 5yL T4連接酶(17. 5units/μ L)， 26。C反應(yīng)15分鐘，各管反應(yīng)總體積為50μ L。3)切刻內(nèi)切酶反應(yīng)連接反應(yīng)結(jié)束后，向各管中加入50 μ L切刻內(nèi)切酶反應(yīng)液，其中包含0.2Μ NaCl, 20mMTris-HCl (pH7. 9), 20mM MgCl2, 2mM DTT，Nb. BsmI 50U，在 60°C反應(yīng)，利用 MJ 0pticon2 實時熒光PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，反應(yīng)90分鐘。實施例1的結(jié)果示于圖3中。圖3的結(jié)果顯示，本發(fā)明所陳述的方法能夠檢測到 0. Iamol的靶核酸序列，并且對于與靶核酸序列完全不相關(guān)的另外一條寡核苷酸干擾片段 的測定沒有得到與空白區(qū)分的信號，說明本發(fā)明對核酸檢測有很好的序列特異性。實施例2利用連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號擴增檢 測方法實現(xiàn)單堿基差異模板的區(qū)分檢測本實施例檢測了與靶核酸在不同位置有一個堿基差異的六條人工合成突變模板 (a 5' -CTATTG CAC CAG GCC AGA AGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACAT—3，，即 SEQ ID N0. 7 ；b 5'-CTA TTG CAC CAG GCC AGT TGA GAG MC CAA GGG GM GTG ACA T-3，，即 SEQID N0. 8 ；c 5' -CTA TTG CAC CAG GCG AGA TGA GAG AAC CAA GGG GAA GTG ACA T-3，，即 SEQ ID N0. 9 ；d 5'-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TCA GAG MC CAA GGG GAA GTGACAT-3，，即 SEQ ID NO. 10 ；e 5' -CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGT GAG AAC CAA GGGGAA GTG ACA T—3，，即 SEQ ID NO. 11 ；f5'-CTA TTG CAC CAG GCC AGA TGA GAG AACCAA CGG GM GTG ACA T-3，， 即SEQ ID N0. 12)，各突變模板的序列與實施例1中的靶核酸序列僅在不同位置處有一個堿 基的差異，各突變點位置如附圖4中字母標(biāo)注所示，各位點均突變?yōu)榕c實施例1中的靶核酸 序列對應(yīng)位點互補的堿基，即a處為A、b處為T、c處為G、d處為C、e處為T、f處為C，用 來考察本發(fā)明中的方法檢測核酸時區(qū)分單堿基差異的能力。反應(yīng)條件
1)核酸侵入信號擴增核酸侵入反應(yīng)體系組成為IOmM MOPS, pH 7. 5,0. 05% Tween-20,0. 05% Nonidet P40，0. 1 μ M 上游探針(SEQ ID NO. 1)，1 μ M 下游探針(SEQ ID NO. 2)，7. 5mM MgCl2,向該體 系中分別加入IOOamol的靶核酸(同實施例1的靶核酸片段SEQ ID NO. 3)及含有單堿基突 變的模板，以及不含模板的空白對照，經(jīng)95°C孵育5分鐘后，向各管中加入71ng的AfuFEN， 63°C反應(yīng)2小時，各管反應(yīng)總體積均為10yL。2)連接反應(yīng)
核酸侵入反應(yīng)結(jié)束后，向核酸侵入反應(yīng)各管中分別加入25μ L的2Χ連接反應(yīng) 緩沖液(132mM Tris-HCl，20mM MgCl2, 2mM DTT,2mM ATP, 15% PEG 6000，pH 7. 6) ,4. 8μ L 10μΜ的5’磷酸化的與分子信標(biāo)環(huán)狀區(qū)域的一半互補的寡核苷酸片段(SEQ ID NO. 5), 4. OyL 10 μ M的分子信標(biāo)(SEQ ID NO. 6)以及5. 7 μ L水，45°C孵育5分鐘，26°C加入0. 5 μ L Τ4連接酶(17. 5unitS/l·! L)，26°C反應(yīng)15分鐘，各管反應(yīng)總體積為50 μ L03)切刻內(nèi)切酶反應(yīng)連接反應(yīng)結(jié)束后，向各管中加入50 μ L切刻內(nèi)切酶反應(yīng)液，其中包含0.2Μ NaCl, 20mMTris-HCl (pH7. 9), 20mM MgCl2, 2mM DTT，Nb. BsmI 50U，在 60°C反應(yīng)，利用 MJ 0pticon2 實時熒光PCR儀每分鐘檢測一次熒光信號，反應(yīng)90分鐘。實施例2的檢測結(jié)果示于圖4中。圖4結(jié)果表明，本專利提供的核酸檢測方法能 夠?qū)崿F(xiàn)對單堿基差異的不同模板的區(qū)分檢測，堿基突變位置越靠近侵入位點，與完全匹配 的模板的檢測結(jié)果差異越大，說明本方法具有極高的檢測特異性。實施例3 PEG 6000、Nonidet P-40、Tween-20以及抗氧化劑DTT提高切刻內(nèi)切酶
反應(yīng)效率本發(fā)明提供了提高切刻內(nèi)切酶反應(yīng)效率的方法，通過向切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系中分 別引入表面活性劑聚乙二醇6000 (PEG 6000)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙 烯-20脫水山梨醇單月桂酸酯(Tween-20)或抗氧化劑二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT) 能夠顯著提高切刻內(nèi)切酶信號擴增的效率。本實施例僅針對切刻內(nèi)切酶反應(yīng)，考察所述添 加劑對切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的反應(yīng)效率的提高作用，沒有進行本發(fā)明提供方法中所述三個步驟 中的步驟1)核酸侵入信號擴增和步驟2) flap連接，而是將分子信標(biāo)和一條與分子信標(biāo)環(huán) 狀區(qū)域互補的人工合成的flap連接產(chǎn)物加入到發(fā)明提供方法中所述三個步驟中的步驟3) 切刻內(nèi)切酶信號擴增的反應(yīng)體系中，然后加入不同的所述添加劑，考察它們對切刻內(nèi)切酶 反應(yīng)效率的影響。反應(yīng)條件向切刻內(nèi)切酶反應(yīng)液(0. IM NaCl, IOmM Tris-HCl, pH7. 9, IOmM MgCl2, ImM DTT, Nb. BsmI 50U)中加入 4. 0 μ L 10 μ M 的分子信標(biāo)(SEQ ID Ν0. 6)，1. 0 μ L 0. 1 μ M 的與分子 信標(biāo)環(huán)狀區(qū)域互補的人工合成的flap連接產(chǎn)物(序列為5’ -AGC AGG ACG GGA ATG CAC TCATCT A-3，即SEQ ID N0. 13)，不同濃度的表面活性劑聚乙二醇6000 (PEG 6000)、乙基苯 基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙烯-20脫水山梨醇單月桂酸酯(Tween-20)或抗氧化 劑二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)，反應(yīng)總體積用水補到100 μ L，在60°C反應(yīng)，利用MJ Opticon 2實時熒光PCR儀每2分鐘檢測一次熒光信號，反應(yīng)200分鐘，與不加表面活性 劑及抗氧化劑的反應(yīng)作對比。其中加入的PEG 6000的濃度為3. 75% 表示g/100mL)，Nonidet P-40 的的濃度為 0. 005% 表示 g/IOOmL)，Tween-20 的濃度為 0. 005% 表 示 g/IOOmL)，DTT 的濃度為 0. 5mM。 實施例3的檢測結(jié)果示于圖5中。圖5結(jié)果表明，加入一定量的的表面活性劑聚 乙二醇6000(PEG 6000)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)、聚氧乙烯-20脫水山梨醇單 月桂酸酯(Tween-20)以及抗氧化劑二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)能夠使切刻內(nèi)切酶 信號擴增的效率顯著提高。
權(quán)利要求
利用連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于依次包括以下步驟1)核酸侵入信號擴增階段設(shè)計針對靶核酸特異性的一對探針，要求與靶核酸雜交后，上游探針3’端必須侵入下游探針1個堿基，下游探針有一段翹起片段，稱為5’flap，并且其中下游探針與靶核酸互補區(qū)域的解鏈溫度在核酸5’外切酶或5’flap內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)溫度±1℃范圍內(nèi)，而上游探針與靶核酸互補區(qū)域的解鏈溫度要高于核酸5’外切酶或5’flap內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)溫度5～10℃；所述的靶核酸與所述的上、下游探針在核酸侵入反應(yīng)體系中雜交形成探針 靶核酸特異性結(jié)構(gòu)，其中下游探針濃度大于上游探針濃度；向反應(yīng)體系中加入核酸5’外切酶或5’flap內(nèi)切酶，核酸5’外切酶或5’flap內(nèi)切酶識別所述的探針 靶核酸特異性結(jié)構(gòu)，并將下游探針的5’flap連同與模板配對的第一個堿基切下，因為所述的酶切反應(yīng)溫度接近下游探針與模板配對部分的熔解溫度，下游探針被切割后會很快與靶核酸分離，沒有被切割的完整的下游探針會再次與靶核酸雜交，而上游探針熔解溫度高于反應(yīng)溫度，可以牢固地結(jié)合在靶核酸上，與新雜交的完整的下游探針再次形成所述的探針 靶核酸特異性結(jié)構(gòu)，進而繼續(xù)被核酸5’外切酶或5’flap內(nèi)切酶切割，形成flap片段的積累；2)flap連接階段向步驟1)的反應(yīng)體系中加入連接酶體系及環(huán)狀部分雜交有一段5’磷酸化的寡核苷酸的分子信標(biāo)，在所述的連接酶體系中連接酶的作用下，步驟1)核酸侵入信號擴增產(chǎn)生的flap片段會與所述的分子信標(biāo)環(huán)狀部分的5’磷酸化的寡核苷酸相連，將分子信標(biāo)打開發(fā)出熒光信號，同時連接好的flap片段與信標(biāo)形成的雙鏈上的切刻內(nèi)切酶識別位點形成，得到能發(fā)出熒光信號且含有切刻內(nèi)切酶識別位點的連接產(chǎn)物；3)切刻內(nèi)切酶信號擴增階段將切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系加入到步驟2)得到的連接產(chǎn)物中，所述的切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系中的切刻內(nèi)切酶識別所述的切刻內(nèi)切酶識別位點，并只切割分子信標(biāo)鏈，切割后的分子信標(biāo)兩部分片段與未切割的完整的分子信標(biāo)相比，解鏈溫度低，在切刻內(nèi)切酶酶切反應(yīng)溫度下會與連接的flap片段分離，使分子信標(biāo)的熒光基團與淬滅基團分離，新的完整的分子信標(biāo)會再次與連接的flap片段雜交，形成新一輪的切刻內(nèi)切酶切割循環(huán)，這一過程使熒光信號逐漸增強，從而使靶核酸信號得到擴增；4)信號檢測階段對步驟3)擴增得到的靶核酸信號進行檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述的核酸為DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述的核酸侵入反應(yīng)體 系包含MOPS、Tween-20、Nonidet P40、上游探針、下游探針、MgCl2以及靶核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述的核酸5’外切酶 或 5，flap 內(nèi)切酶選自 TaqPol、TthPol, TaqExo, AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN 或 MthFEN ；優(yōu)選 AfuFEN。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述的連接酶體系包括 由 132mM Tris-HCl，20mM MgCl2, 2mM DTT,2mM ATP 及 15% PEG 6000 組成的 pH 7. 6 的連接 反應(yīng)緩沖液，5’磷酸化的與分子信標(biāo)環(huán)狀區(qū)域的一半互補的寡核苷酸片段，分子信標(biāo)，水及 連接酶；所述的切刻內(nèi)切酶反應(yīng)體系包括NaCl，20mM、pH7. 9的Tris-HCl，MgCl2, DTT以及 切刻內(nèi)切酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述連接酶選自大 腸桿菌DNA連接酶、T4DNA連接酶、Taq DNA連接酶、Ampligase DNA連接酶、9° N DNA連接 酶或Ligase-65DNA連接酶，優(yōu)選T4 DNA連接酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述的切刻內(nèi)切 酶選自 Nb. BbvCI、Nb. BsmI、Nb. BsrDI、Nb. BtsI、Nt. AlwI、Nt. BbvCI、Nt. BsmAI、Nt. BspQI、 Nt. BstNBI 或 Nt. CviPII，優(yōu)選 Nb. BsmI。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述的分子信標(biāo)一端標(biāo) 記熒光基團，選自FAM、HEX、TET、J0E、TAMRA、Cy5或Cy3，優(yōu)選FAM ；另一端標(biāo)記淬滅基團，選 自 DABCYL、ECLIPSE、TAMRA 或 BHQ，優(yōu)選 DABCYL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于所述的切刻內(nèi)切酶反應(yīng) 體系中還可以加入表面活性劑聚乙二醇6000、乙基苯基聚乙二醇、聚氧乙烯-20脫水山梨 醇單月桂酸酯或抗氧化劑二硫蘇糖醇中的至少一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸信號擴增檢測方法，其特征在于步驟4)所述的檢測可 以通過熒光檢測裝置實現(xiàn)，優(yōu)選通過熒光分光光度計或?qū)崟r熒光熱循環(huán)儀實現(xiàn)，進一步優(yōu) 選通過實時熒光熱循環(huán)儀實現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了連接反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)與切刻內(nèi)切酶反應(yīng)的核酸信號擴增檢測方法。本發(fā)明核酸信號擴增檢測方法包括1)核酸侵入信號擴增階段，形成flap片段的積累；2)flap連接階段，將flap片段與分子信標(biāo)上的另一寡核苷酸相連，形成切刻內(nèi)切酶位點；3)切刻內(nèi)切酶信號擴增階段，切刻內(nèi)切酶只切割分子信標(biāo)鏈，使分子信標(biāo)的熒光基團與淬滅基團分離，新的完整的分子信標(biāo)會再次與連接的flap片段雜交，從而使靶核酸信號得到擴增；4)靶核酸信號檢測階段。利用本發(fā)明檢測方法，能夠?qū)怂岚行蛄羞M行檢測，并且由于核酸侵入反應(yīng)具有很高的特異性，可以實現(xiàn)對侵入位點附近的單個堿基差異的核酸序列進行區(qū)分檢測。
文檔編號C12Q1/44GK101974638SQ201010540150
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者周國華, 武海萍, 鄒秉杰, 馬寅姣 申請人:華東醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所