專利名稱：一種用于定向克隆的核苷酸序列及載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種用于定向克隆的核苷酸序列以及利用 所述序列構建的植物基因表達載體。
背景技術：
目前通過基因重組構建質粒或病毒載體時，一般選用雙酶切的方法，即利用兩個 酶切位點不同的限制性內切酶同時對載體進行酶切，以插入外源目的片段。該方法具有定 向克隆的優(yōu)點，可保證插入外源片段的方向，載體及插入片段在雙酶切及連接后，不需要鑒 定插入片段的方向性；并且可以防止載體的自連，提高重組率。但雙酶切方法的缺點是成 本較高，需要同時使用兩種酶；選用的兩種限制性內切酶的酶切效率可能相差較大，對酶切 條件要求較高；而且，如果要在多克隆位點插入多個外源片段時，可能找不到適合的酶切位 點；另外，如果兩種酶的最適反應溫度或反應緩沖液(Buffer)不一樣，或者兩種酶不能在 同一種Buffer中反應時，將涉及到反應溫度和Buffer的選擇甚至要進行分步酶切，增加了 操作的復雜性。而對于單酶切構建重組載體的方法來說，僅用一種限制性內切酶進行酶切和連 接，花費少，對技術的要求低，而且在多克隆位點插入多個片段時，相對雙酶切而言，可供選 擇的酶切位點更多；但是該方法的缺點是不能定向克隆，酶切連接后需測序鑒定是否存在 插入片段及插入片段的方向是否正確，構建正確重組載體的概率小于50%，因此，測序的樣 本量至少是雙酶切法的2倍，測序費用比雙酶切法要高。因此尚需開發(fā)一種操作簡單方便，通過單酶切即能保證外源片段定向克隆(以正 確方向插入)的載體。在單子葉植物表達載體的構建中，常見的啟動子有Ubi啟動子(Plant ubiquitin promoter)、Actin 啟動子(Plant Actin promoter)禾口 Adh_l 啟動子(Maize alcohol dehydrogenase 1 promoter)。其中Ubi (泛素)啟動子以其啟動效率高、甲基化程度低、遺 傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目前，已經從很多泛素基因中分離得到啟動子序列，包括玉 米基因組中的Ubi-1啟動子、水稻泛素RUBQ2啟動子、擬南芥泛素啟動子、向日葵泛素UbBl 啟動子、煙草泛素Ubi. U4啟動子、馬鈴薯泛素Ubi7啟動子、番茄泛素Ubil-1啟動子，大麥 泛素Mubl啟動子。其中，玉米泛素Ubi-1啟動子已經廣泛地應用于玉米、小麥、水稻等單子 葉植物中。而且已有研究表明，玉米的Ubi-1啟動子在雙子葉植物和單子葉植物都有活性。如果能夠將高效的植物基因啟動子和單酶切定向克隆載體相結合，將有可能大大 提高植物基因重組載體的構建效率和植物基因的表達效率。

發(fā)明內容
為了克服現(xiàn)有的雙酶切和單酶切的重組載體構建方法中的缺陷，提高植物基因重 組載體的構建效率和表達效率，發(fā)明人經過大量實驗找到了一種通過單酶切實現(xiàn)載體定向 克隆的方法，并將高效率的玉米Ubi-1啟動子和終止子N0S連接入載體中，由此構建了植物基因表達載體，完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一個方面涉及一種核苷酸序列，其包含同一限制性內切酶的兩個不同的 酶切位點序列，其中所述限制性內切酶選自BstE IKAcc I、Afl III、Ahd I、Xcm I、Tfi I、 Tse I、TspR I、Tthlll I、Sau96 I、ScrF I、SexA I、Sfc I、SgrA I、Sml I、StyD4 I、Sty
I、Styl-HF、RsrII, PfIF I、PflM I、PpuM I、PspG I、Nci I、Nsp I、Mwo I、Hae II、Hinc
II、HinfI、Hpyl88 I、Hpyl88 III、Hpy99 I、HpyCH4 III、Fnu4H I、Eae I、EcoN I、Eco0109 I、Dde I、Dra III、Drd I、AlwN I、ApeK I、Apo I、Ava I、Ava II、BaeG I、Ban I、Ban II、 Blp I、BpulO I、BsaH I、BsaJI、BsiE I、BsiHKA I、Bsl I、BsoB I、Bspl286 I、BstAP I、 BstN I、BstY I、Bsu36 I、Btg I 和 BtsC I，優(yōu)選為 BstE II、Tfi I、Tthlll I、Sau96 I、 ScrF I、SexA I、PspG I、Hae II、Hinc IKHinf I、Eae I、EcoN I、Eco0109 I、Dde I、AlwN I、Ban I、BsaH I、BsaJ I、BsiHKA I和BstY I，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述限制性內 切酶為BstE II。當用所述限制性內切酶進行酶切時，可以同時產生兩個不同的粘性末端。BstE II的識別序列為’其中N表示A或C或G或T的任意堿
基，當N不同時，可以產生不同的識別序列，酶切后可以產生不同的粘性末端。以BstE II為例，在本發(fā)明中，上述的同一限制性內切酶的兩個不同的酶切位點序 列，即是指當限制性內切酶的識別序列中有可供選擇的堿基時，在選擇不同堿基的情況下， 可以產生不同的識別序列，酶切后可以產生不同的粘性末端。在本發(fā)明中，所述的同一限制性內切酶的兩個不同酶切位點之間至少相隔3個堿 基序列，優(yōu)選為至少相隔6個堿基序列。在本發(fā)明的一個實施例中，兩個位點之間相隔18 個堿基。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的核苷酸序列為 5 , GGATCCGGTTACCTGCAGGACTAGTGGTACCGGTGACC tcaccatcatgtgtaagagctc
3' BamH I BstE II Sbf I Spe I Kpn I BstE IISac I (SEQ ID NO :7)。本發(fā)明的另一方面涉及一種載體，其含有至少一個所述的包含同一限制性內切酶 的兩個不同的酶切位點序列的核苷酸序列。由于通過一次酶切可以產生不同的粘性末端，當載體和插入片段均采用該限制性 內切酶進行酶切時，可以保證插入片段以正確的方向插入載體中，從而提高重組陽性率。所述載體的構建方法，包括在載體的多克隆位點插入上述的含有同一限制性內切 酶的兩個不同酶切位點的序列的步驟。在本發(fā)明中，所述載體可以以一個基本載體為基礎，根據(jù)實際需要添加啟動子、增 強子或終止子等序列，在同一限制性內切酶的兩個不同位點之間可以設計其它的酶切位 點，以增加載體的靈活性和實用性。在本發(fā)明中，所述載體還可操作地連接有玉米泛素啟動子序列；具體地，所述玉米 泛素啟動子序列由SEQ ID NO :3所示序列組成。在本發(fā)明中，所述載體還可操作地連接有N0S終止子序列；具體地，所述N0S終止 子序列由SEQ ID NO 6所示序列組成。在本發(fā)明的一個實施方案中，發(fā)明人以pCAMBIA-1301質粒為 基礎質粒，添加了玉米啟動子Ubi和終止子N0S，其多克隆位點序列為GGATCCGGTTACCTGCAGGACTAGTGGTACCGGTGACC TCACCATCATGTGTAAGAGCTCBamH I
BstE II Sbf I Spe I Kpn I BstE IISac I。 由此構建的載體命名為pll，其為環(huán)狀，且由SEQ ID NO 8所示序列組成。 在本發(fā)明中，所述載體還可操作地連接有外源蛋白基因，所述外源蛋白優(yōu)選為來
自單子葉植物或雙子葉植物的蛋白，更優(yōu)選為來自單子葉植物的蛋白。本發(fā)明的還一方面涉及含有所述連接有外源蛋白基因載體的重組細胞。在本發(fā)明 的一個實施方案中，所述重組細胞為EHA105-pll+A。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明所述的核苷酸序列用于構建載體的用途，以及本發(fā) 明所述的載體在表達外源蛋白中的用途。其中所述外源蛋白為來自單子葉植物或雙子葉植 物的蛋白，更優(yōu)選為來自單子葉植物的蛋白。在本發(fā)明中，術語“可操作地連接”是指將核酸與另外的核酸序列置于在功能上具 有關系的狀態(tài)。這可以是相互連接的基因和控制序列以這樣的方式連接，使得當適當?shù)姆?子被結合到控制序列時，該基因的表達變得可行。例如，如果啟動子控制編碼序列的轉錄， 那么該啟動子將可操作性地與該序列結合。通常，術語“可操作地連接”是指被連接的DNA 序列是相鄰的，并且在分泌性前導序列的情況中，是相鄰的且在閱讀框內。所述序列的連接 是通過在適當?shù)南拗泼肝稽c上進行連接來實施的。如果所述位點不存在，可以使用根據(jù)常 規(guī)方法合成的寡聚核苷酸銜接子或接頭。為了驗證pll的酶切和重組效率，發(fā)明人利用BstE II進行單酶切，分別插入 CaMV35S啟動子序列和潮霉素抗性基因序列，所得到的載體分別命名為pll+A和pll+B。針對pll+A的構建過程，優(yōu)化了連接、轉化的條件，證明37°C連接lh，能夠大大減 少載體自連，進一步增加插入片段成功連入pll載體的可能。這些條件的確定，表明BstE II單酶切系統(tǒng)已經能夠應用于大多數(shù)載體構建實驗，并且成功率較高，而成本與雙酶切及 傳統(tǒng)單酶切法相比大大降低，同時節(jié)省了人力和時間。同時，將pll+A轉化農桿菌，并進一步轉入水稻中，提取水稻根、莖、葉的總RNA，進 行RT-PCR反應，證明CaMV35S啟動子基因在水稻中已成功表達。發(fā)明的有益效果本發(fā)明根據(jù)某些限制性內切酶酶切位點中含有“N”的特性，利用單酶切方法構建 重組載體，既不用考慮緩沖液不兼容的問題，又可以保證外源片段以正確的方向插入，同時 還可以防止載體自連。因此，本發(fā)明與常規(guī)的雙酶切構建載體的方法相比，不僅節(jié)省試劑， 降低了成本，而且節(jié)省時間，同時也保證了外源片段正確插入的陽性率。同時，本發(fā)明將玉米Ubi啟動子和N0S終止子構建入載體中，使載體更有利于單子 葉植物和雙子葉植物基因的表達。關于牛物材料保藏的說明本發(fā)明涉及以下生物材料1.根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105，其于 2009 年 12 月 24 日保 藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保 藏編號為 CCTCC M 209315 ；2. yjCfSH^Bf (Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare) ft^2009 ^ 12月18日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC P200910。


圖1 pCAMBIA-1301質粒結構示意2 pll質粒結構示意3 pJET質粒結構示意4 pJET+A酶切后的CaMV35S啟動子片段與酶切的pll質粒連接轉化后的PCR 產物電泳圖M 分子量標準DL2000 ；泳道1_24為挑取單菌落檢測。圖5重組載體pll+B酶切后電泳圖M 分子量標準D15000 ；泳道1 單菌落質粒酶切結果圖6經轉化pll+A重組載體的水稻的RT-PCR檢測r, s, 1非轉基因水稻的根、莖、葉表達情況R，S，L轉化重組載體pll+A水稻的根、莖、葉表達情況上排為CaMV35S啟動子基因，下排為Actin內參。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產品。實施例1 P11載體構建1.玉米Ubiquitin啟動子片段的PCR擴增和pMD18_T+Ubi重組載體的構建Ubi啟動子PCR擴增使用植物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN新型植物基因組DNA提取試劑盒，目 錄號DP320-02)提取玉米品種 B73(Zea mays mays cv. B73)的基因組 DNA(http: //www. maizeRdb. org/)，根據(jù)Ubi啟動子在玉米B73 gDNA中的序列，分別在首尾設計一對PCR 特異性擴增引物(上游引物 F1 GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT(SEQ ID N0:1)，加限制 性酶切位點PstI和保護堿基，下游引物R1 GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC(SEQ ID NO 2)，加 限制性酶切位點Pst I和保護堿基)。以上述提取的玉米B73的gDNA為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。如表1所示。表1基因啟動子擴增的PCR體系_組成體積(ii 1)_基因組DNA0.2dNTPs (2. 5mM)210 X Ex Buffer (含鎂離子)2. 5引物 Fl(50iiM)1
弓丨物 Rl(50iiM)Ex taq 聚合酶ddH20_
0. 2
補齊至25 u 1PCR擴增程序為94°C預變性5min，然后以94°C變性45s，55°C退火50s，72°C延伸 90s，進行35個反應循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR擴增產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收 試劑盒(目錄號:DP209-03)純化回收。pMD18-T+Ubi重組載體的構建將上述得到的PCR擴增產物進行T/A克隆(pMD18-T質粒，TaKaRa，D103A)，轉化大 腸桿菌，挑取陽性克隆由深圳華大基因科技有限公司測序，證明正確。其中Ubi序列如下 TGCAGCGTGACCCGGTCGl] gcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattacca
CATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAAT AATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGG ACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAA TAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGAC TAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTT ATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAA AACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACC AACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCC TCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTG AGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCG CTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGC GCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCC CCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGT TTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGT TCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATT TCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTT TGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGG AGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGT TACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATAT ACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGT AGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTAC GAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGA TGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATT ATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGC
TATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTT |GTTTGGTGTTACTT| (SEQ ID NO 3)下劃線為酶切位點，方框為引物序列。
7
其中，T/A克隆的連接條件如下T/A連接體系 lOiil，其中pMD18-T1 U 12 X solution I 5u 1PCR擴增產物 10-20ng，根據(jù)其濃度定連接酶1 ii 1ddH20補齊至 10 P 1于16 °C在節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上，得到 pMD18-T+Ubi重組載體。將經過上述連接后的產物按照如下方法轉化大腸桿菌從超低溫冰箱中取出按照《分子克隆實驗指南》(第三版，科學出版社)所示氯 化鈣法制備的感受態(tài)細胞100 iil DH5a (中國科學院昆明動物研究所董楊提供；或者可從 例如上海生工購得)，冰上融化后，加入lOiU如上所得的連接產物，即pMD18-T+Ubi重 組載體，輕輕攪勻，冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，加入600 u 1 4°C預冷的S0C培養(yǎng) 基(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)，37°C 220rpm復蘇45min， 8000rpm離心30s，去上清，留取150 yl，用剩下的150 yl上清重懸沉淀后的混合物，輕輕 吹勻，玻璃珠涂布LB (卡那霉素)平板(具體配方詳見《分子克隆實驗指南》，第三版，科學 出版社)，37°C倒置培養(yǎng)16-24h。獲得含有pMD18-T+Ubi克隆載體的重組大腸桿菌，命名為 DH5a -Ubi02. pCAMBIA-1301+Ubi 重組載體的構建按照TIANGEN普通質粒小提試劑盒(目錄號DP103_03)的操作手冊，從上述步驟 1構建的轉化有啟動子Ubi的大腸桿菌DH5 a -Ubi中提取帶有玉米Ubi啟動子序列的克隆 載體pMD18-T+Ubi ；純化后用相應的限制性內切酶Pst I (NEB)進行酶切，然后用TIANGEN瓊 脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209-03)回收相應的啟動子片段。同時用限制性內切酶Pst I酶切pCAMBIA-1301質粒(中國科學院昆明動物研究 所董楊提供；或者可從例如上海國瑞基因科技有限公司購得，該公司的pCAMBIA-1301質粒 白勺帛女臺jfeiJUThe CAMBIA Bios (biological open source) Licensee，AustraliEi)

酶切體系 ddH20
10X buffer 3 Pst I
克隆載體pMD18-T+Ubi或 pCAMBIA-1301 質粒
50 u 1 34. 9 u 1 5u 1
0. 1 u 1(10U) lOu 1( < lOOOng)
將回收的啟動子片段Ubi與回收的載體片段根據(jù)T4連接酶(TaKaRa，D2011A)操
作說明，按照如下條件進行連接連接體系10XT4 buffer回收的 pCAMBIA-1301 質?；厥盏膯幼覷bi插入片段ddH20
10 u 1 1 u 1 1 u 1 (20ng)
10-20ng，根據(jù)其濃度定 補齊至9. 5iil
T4 ligase (TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1于16°C節(jié)能型智能恒溫槽(寧波新芝，SDC-6)中連接8h以上。轉化方法同步驟1。得到重組載體？041^認-1301+證土。分別以Fl和Rl為引物對所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi進行PCR檢測，然后送 深圳華大基因科技有限公司測序，證明所得重組載體pCAMBIA-1301+Ubi中含有所需啟動 子Ubi且啟動子是以正向插入到載體中的。3. NOS終止子的PCR擴增和pMD18_T+N0S重組載體的構建根據(jù)pCAMBIA-1301質粒中NOS終止子的序列，分別在首尾設計一對PCR特異性擴 增引物(上游引物F2 GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA(SEQ ID NO :4)，加限制性酶切位點 Sac I 和保護堿基，下游引物 R2 :GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT(SEQ ID NO :5)，加限制性 酶切位點EcoR I和保護堿基)。以上述提取的pCAMBIA-1301質粒為模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶進行PCR擴增。反應體系如表2所示。表 權利要求
一種核苷酸序列，其包含同一限制性內切酶的兩個不同的酶切位點序列，其中所述限制性內切酶選自BstE Ⅱ、Acc I、Afl Ⅲ、Ahd I、Xcm I、Tfi I、Tse I、TspR I、Tth111 I、Sau96 I、ScrF I、SexA I、Sfc I、SgrA I、Sml I、StyD4 I、Sty I、StyI HF、Rsr Ⅱ、PflF I、PflM I、PpuM I、PspG I、Nci I、Nsp I、Mwo I、Hae Ⅱ、Hinc Ⅱ、Hinf I、Hpy188 I、Hpy188 Ⅲ、Hpy99 I、HpyCH4 Ⅲ、Fnu4H I、Eae I、EcoN I、EcoO109 I、Dde I、Dra Ⅲ、Drd I、AlwN I、ApeK I、Apo I、Ava I、Ava Ⅱ、BaeG I、Ban I、Ban Ⅱ、Blp I、Bpu10 I、BsaH I、BsaJ I、BsiE I、BsiHKA I、Bsl I、BsoB I、Bsp1286 I、BstAP I、BstN I、BstY I、Bsu36 I、Btg I和BtsC I，優(yōu)選為BstE Ⅱ、Tfi I、Tth111 I、Sau96 I、ScrF I、SexA I、PspG I、Hae Ⅱ、Hinc Ⅱ、Hinf I、Eae I、EcoN I、EcoO109 I、Dde I、AlwN I、Ban I、BsaH I、BsaJ I、BsiHKA I和BstY I，更優(yōu)選為BstE Ⅱ。
2.權利要求1的核苷酸序列，其中所述的同一限制性內切酶的兩個不同酶切位點序列 之間至少間隔3個核苷酸序列，優(yōu)選為至少間隔6個核苷酸序列。
3.權利要求1 的核苷酸序列，其為 5 ‘ GGATCCGGTTACCTGCAGGACTAGTGGTACCGGTGACCTCA CCATCATGTGTAAGAGCTC3‘ (SEQ ID NO :7)。
4.一種載體，其含有至少一個權利要求1-3任一項所述的核苷酸序列。
5.權利要求4的載體，其還可操作地連接有玉米泛素啟動子序列；具體地，所述玉米泛 素啟動子序列可以是SEQ ID NO :3所示序列。
6.權利要求4的載體，其還可操作地連接有N0S終止子序列；具體地，所述N0S終止子 序列可以是SEQ ID NO 6所示序列。
7.權利要求4的載體，其為環(huán)狀，且由SEQID NO :8所示序列組成。
8.權利要求4的載體，其還可操作地連接有外源蛋白基因，所述外源蛋白優(yōu)選為來自 單子葉植物或雙子葉植物的蛋白，更優(yōu)選為來自單子葉植物的蛋白。
9.一種重組細胞，其含有權利要求4-8任一項所述的載體。
10.權利要求1-3任一項所述核苷酸序列用于構建載體的用途。
11.權利要求4-8任一項所述的載體在表達外源蛋白中的用途。
12.權利要求11的用途，其中所述外源蛋白為來自單子葉植物或雙子葉植物的蛋白， 更優(yōu)選為來自單子葉植物的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種用于定向克隆的核苷酸序列以及利用所述序列構建的、通過單酶切即能實現(xiàn)定向克隆的載體，所述載體還可操作地連接有玉米泛素啟動子序列和NOS終止子序列。本發(fā)明還涉及所述用于定向克隆的核苷酸序列用于構建載體的用途，以及所述載體用于植物基因特別是單子葉植物或雙子葉植物基因表達的用途。與雙酶切載體相比，本發(fā)明的單酶切載體既降低了成本，又節(jié)約了時間。
文檔編號C12N15/11GK101979545SQ20101054190
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權日2010年11月12日
發(fā)明者倪雪梅, 全志武, 張耕耘, 李華 申請人:深圳華大基因科技有限公司