專利名稱：Spg-抗體多聚體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種SPG-抗體多聚體及其制備方法和應(yīng)用。SPG-抗體多聚體為抗血型糖蛋白A單克隆抗體-鏈球菌G蛋白-抗體多聚體的簡(jiǎn)稱。鏈球菌G蛋白簡(jiǎn)稱為SPG。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cell, SC)是一類具有自我更新、高度增值和多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的大小，同時(shí)又可以進(jìn)一步分化成為各種不同的組織細(xì)胞，從而構(gòu)成機(jī)體各種復(fù)雜的組織器官。干細(xì)胞治療技術(shù)，又稱為再生醫(yī)療技術(shù)，是指通過(guò)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行分離，再靶向移植到受損組織或器官中去以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療。臨床開展干細(xì)胞治療的最核心是取得足夠量的，活性好的，純度高的干細(xì)胞。因此，干細(xì)胞提取純化是臨床治療最核心的環(huán)節(jié)，是開展細(xì)胞治療可能性的關(guān)鍵。目前從人血液中分離干細(xì)胞主要有流式細(xì)胞儀，免疫磁珠法，血細(xì)胞分離機(jī)，體外培養(yǎng)等，這些方法存在的問題是第一，分離的干細(xì)胞表面有特異性標(biāo)記不利于臨床應(yīng)用； 第二，只能分離一種類型的干細(xì)胞，不能保留所有類型的干細(xì)胞；第三，分離成本高；第四， 體外培養(yǎng)細(xì)胞污染率高，細(xì)胞可塑性減弱，功能差。有方法用(中國(guó)專利申請(qǐng)200910187212. 4與中國(guó)專利申請(qǐng)200610106875. 5)甲基纖維素或羥乙基淀粉與密度為1. 074 1. 077g/ml的聚蔗糖-泛影葡胺分離液(Ficoll試劑)直接分離干細(xì)胞，此方法雖能除去血漿、血小板、血漿蛋白及絕大多數(shù)紅細(xì)胞，但所得的為所有的有核細(xì)胞，即成熟的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多核細(xì)胞、粒細(xì)胞以及所有的干細(xì)胞、祖細(xì)胞等，不能直接獲取干細(xì)胞，所得細(xì)胞中干細(xì)胞純度差并且有紅細(xì)胞殘留。經(jīng)實(shí)驗(yàn)及眾多文獻(xiàn)表明，經(jīng)上訴方法分離的細(xì)胞中干細(xì)胞所得率一般不高于70%，并且在用臍帶血作為干細(xì)胞來(lái)源時(shí)，所得細(xì)胞中含有的大量淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞，干細(xì)胞純度極低，移植后容易引起移植物抗宿主等免疫反應(yīng)，部分殘留的紅細(xì)胞易引起溶血反應(yīng)，給臨床帶來(lái)巨大的安全隱患。為此，在中國(guó)專利申請(qǐng)200710137781. 9中，對(duì)此問題進(jìn)行改進(jìn)，公開了骨髓臍帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方法，該技術(shù)方案在一定程度上處理骨髓/臍帶血， 可以制得干細(xì)胞/祖細(xì)胞，但是還存在這些問題首先，此專利中Lin抗體掛靠在大分子的羥乙基淀粉或甲基纖維素上涉及到大分子的化學(xué)合成與產(chǎn)物純化，二者反應(yīng)困難，反應(yīng)產(chǎn)物難控制，步驟繁瑣，最終的產(chǎn)率極低，造成抗體的大量浪費(fèi)，成本大大增加。其次，此專利中Lin抗體的具體抗體組成及濃度并未給出，對(duì)最后所分離的細(xì)胞的種類、純度、細(xì)胞質(zhì)量等不能保證；最后，在此專利的據(jù)此實(shí)施方案中，對(duì)抗體在內(nèi)的試劑盒的所有組成成分經(jīng)過(guò) 121° C，35分鐘高壓滅菌，這使所有的抗體蛋白因變性而失活，導(dǎo)致此專利的實(shí)施性存在問題。在中國(guó)專利申請(qǐng)201010022753. 4中，公開了 SPA-抗體三聚體、含有該三聚體的細(xì)胞處理試劑盒及其制備方法和用途，該技術(shù)方案在一定程度上處理外周血/骨髓/臍帶血或其他動(dòng)物的血液，可以分離得到有核細(xì)胞或進(jìn)行抗原的檢測(cè)，但是還存在這些不足SPA與免疫球蛋白的結(jié)合譜窄，結(jié)合弱。對(duì)于人類SPA只能與人抗體免疫球蛋白IgG中的IgGp IgG2, IgG4不能與IgG3結(jié)合，造成SPA與人IgG結(jié)合不完全結(jié)合率低。對(duì)于其他動(dòng)物SPA 不能與大鼠、綿羊、山羊、牛、馬、雞、倉(cāng)鼠的IgG結(jié)合，這大大限制了其應(yīng)用。SPG可與人IgG 的所有亞類結(jié)合，也可與幾乎所有哺乳動(dòng)物的IgG結(jié)合，結(jié)合率在98%以上，其結(jié)合譜與結(jié)合能力遠(yuǎn)比葡萄球菌 A 蛋白強(qiáng)[Lew, Α. Μ, Beck D.J and Thomas, L. M. : J. Immunol. Meth. (1991) 136，211-219.]。其次，此專利用于細(xì)胞處理試劑盒分離外周血/骨髓血/臍帶血中的干細(xì)胞時(shí)所用cd3、cdl9、cdl4、cd56單克隆抗體分別能標(biāo)記除去血液中的大部分T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞和NK細(xì)胞，不能除去數(shù)量極大的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。分離的干細(xì)胞中殘留的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞和未除去的大量的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對(duì)其臨床應(yīng)用帶來(lái)巨大的安全隱患。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種SPG-抗體多聚體，本發(fā)明的另一目的是提供上述SPG-抗體多聚體的制備方法，本發(fā)明的第三目的是提供 SPG-抗體多聚體的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種SPG-抗體多聚體，由抗血型糖蛋白A單克隆抗體、SPG與目標(biāo)抗原或其他抗原的抗體偶聯(lián)而成。其中，目標(biāo)抗原的抗體為單克隆抗體，包括抗血清白蛋白抗體、特異性腫瘤抗體和抗傷寒抗體等；用于分離干細(xì)胞/祖細(xì)胞的目標(biāo)抗原的抗體包括淋巴系抗CD2、CD3、CD7、 CD19、CD21、CD24、CD73、CD81,巨核細(xì)胞系抗 CD31、CD41、CD42、CD61、CD63、CD107, NK 系抗 CD16、CD25、CD56、CD158，粒細(xì)胞抗 CD13、CD15、CD16、CD66e、CD66b，單核細(xì)胞抗 CD14、CD52、 CD87中的一種或多種抗原的抗體四聚體的混合物。所述的SPG分子量在22 65KD之間。所述的SPG是與抗血型糖蛋白A單克隆抗體相偶聯(lián)結(jié)合。上述的SPG-抗體多聚體的制備方法，將SPG以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋濃度為 0. lmg/ml，抗血型糖蛋白A單克隆抗體與目標(biāo)抗原的抗體以抗體稀釋液稀釋至0. lmg/ml, 取稀釋后的抗體、SPG蛋白在37°C下混合，反應(yīng)30min 池，得到SPG-抗體多聚體制備，在 2 8°C下保存；其中，目標(biāo)抗原的抗體、鏈球菌G蛋白和抗血型糖蛋白A單克隆抗體的質(zhì)量比為 0. Γ1 1 :10ο上述的SPG-抗體多聚體在制備用于檢驗(yàn)血液中特異性抗原的指示劑中的應(yīng)用。所述的用于檢驗(yàn)血液中特異性抗原的指示劑是通過(guò)將血液中特異性抗原的抗體偶聯(lián)到抗血型糖蛋白A單克隆抗體-鏈球菌G蛋白上，利用紅細(xì)胞作為指示劑，形成肉眼或顯微鏡下可觀察到的玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)的“紅細(xì)胞-抗血型糖蛋白A單克隆抗體-SPG-目標(biāo)抗原的抗體-目標(biāo)抗原”復(fù)合物。上述的SPG-抗體多聚體在制備用于分離提取骨髓/臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。所述的用于分離提取骨髓/臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒是通過(guò)將血液中目標(biāo)抗原的抗體偶聯(lián)到抗血型糖蛋白A單克隆抗體-鏈球菌G蛋白上，形成“紅細(xì)胞-抗血型糖蛋白A單克隆抗體-SPG-目標(biāo)抗原的抗體-靶細(xì)胞”復(fù)合物，再通過(guò)血沉過(guò)程和密度梯度離心的方法將血液中紅細(xì)胞和靶細(xì)胞除去。一種基于上述的SPG-抗體多聚體得用于分離提取骨髓/臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒，包括細(xì)胞稀釋液、SPG-抗體多聚體溶液和細(xì)胞分離液；上述三種溶液分開保存。 其中，細(xì)胞稀釋液為質(zhì)量/體積百分比濃度為0. 85-0. 9%的生理鹽水；細(xì)胞分離液為密度為1. 077g/ml的聚蔗糖400#_泛影酸鈉溶液，PH為7-7. 8。其中，SPG-抗體多聚體溶液中的目標(biāo)抗原為單克隆抗體，包括淋巴系抗⑶2、⑶3、⑶7、⑶19、⑶21、OTM、⑶73、⑶81，巨核細(xì)胞系抗 CD31、CD41、CD42、CD61、CD63、CD107, NK 系抗 CD16、CD25、CD56、CD158，粒細(xì)胞抗 ⑶13、⑶15、⑶16、⑶66e、⑶66b，單核細(xì)胞抗⑶14、⑶52、⑶87中的一種或多種抗原的抗體四聚體的混合物。上述的骨髓/臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒的使用方法，首先用細(xì)胞稀釋液將骨髓/臍帶血按1 1的比例進(jìn)行稀釋，然后加入抗血型糖蛋白A單克隆抗體-鏈球菌G蛋白-抗體多聚體，緩慢搖勻，靜置30分鐘，取上清液離心濃縮，將濃縮液加入到細(xì)胞分離液， 離心30分鐘，收取細(xì)胞層洗滌2-4次即可使用。一種基于SPG-抗體多聚體的檢驗(yàn)血液中特異性抗原的試劑盒，包括抗體稀釋液和SPG-抗體多聚體溶液；其中，SPG-抗體多聚體溶液中的目標(biāo)抗原的抗體為抗腫瘤抗體、 抗豬瘟病毒抗體或牛腹瀉病毒抗體。上述的SPG-抗體多聚體的檢驗(yàn)血液中特異性抗原的試劑盒的使用方法，將 SPG-抗體多聚體進(jìn)行稀釋，加入到待測(cè)液中，37°C下30min后形成肉眼或顯微鏡下可見的經(jīng)典玫瑰花環(huán)狀，即為陽(yáng)性。當(dāng)某種疾病患者體內(nèi)出現(xiàn)特異性抗原，將目標(biāo)抗原對(duì)應(yīng)的單克隆抗體偶聯(lián)到抗血型糖蛋白A單克隆抗體-SPG上形成“抗血型糖蛋白A單克隆抗體-SPG-抗目標(biāo)抗原抗體” 即SPG-抗體多聚體。過(guò)濾除菌后2 8°C保存。使用時(shí)將SPG-抗體多聚體進(jìn)行稀釋，加入到待測(cè)液中，37°C下30min后形成肉眼或顯微鏡下可見的經(jīng)典玫瑰花環(huán)狀“抗血型糖蛋白A 單克隆抗體-SPG-抗目標(biāo)抗原抗體-目標(biāo)抗原”復(fù)合物。在鏈球菌菌株的細(xì)胞壁中含有一種能與免疫球蛋白(IgG) Fc段特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，被稱為IgG Fc段受體蛋白或鏈球菌G蛋白(簡(jiǎn)稱SPG)。這類蛋白質(zhì)能特異地與Fc段結(jié)合而不影響IgG分子的Fab段與抗原分子的結(jié)合，與葡萄球菌A蛋白(簡(jiǎn)稱SPA)相比，SPG 更易與IgG相結(jié)合，親和力強(qiáng)，結(jié)合譜廣。SPG除能與人IgGpIgGylgGpIgQ四個(gè)亞類全部相結(jié)合，還能與幾乎除雞以外的所有哺乳動(dòng)物的IgG相結(jié)合。SPA只能與人IgG1UgG2UgG4 不與占8%的人IgG3結(jié)合，不與小鼠IgG1以及其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如大鼠、綿羊、山羊、馬及雞等的IgG結(jié)合，因此其應(yīng)用有一定的局限性。現(xiàn)在已基本肯定SPG比SPA對(duì)IgG的結(jié)合更為優(yōu)越，是一種有效地IgG結(jié)合物，在免疫學(xué)研究方面可取代SPA。據(jù)推測(cè)，SPG分子中至少有2個(gè)以上的IgG結(jié)合點(diǎn)，其與IgG 的結(jié)合開始速度很快，30 45min結(jié)合律超過(guò)50%。通過(guò)計(jì)算G蛋白與多克隆抗體IgG反應(yīng)的平衡常數(shù)并與SPA進(jìn)行比較，結(jié)果G蛋白對(duì)各種IgG的親和常數(shù)較SPA高。SPG與IgG 結(jié)合率可達(dá)98%?？梢?，與SPA相比SPG更易與IgG反應(yīng)，親和力強(qiáng)，結(jié)合譜廣。采用不同的處理方法得到的SPG分子量亦不同，用木瓜蛋白酶水解SPG可得到 34KD和36KD兩種蛋白；用胃蛋白酶、胰蛋白酶處理可得到^KD、35KD、42KD的分子。而完整的SPG蛋白分子量為64 65KD，具有功能活性的最小分子為22KD。本發(fā)明充分利用了 SPG的上述性質(zhì)，將目前為止SPA所不能夠完全解決或解決不好的問題，例如人類IgG3的結(jié)合檢測(cè)，鼠類IgG的檢測(cè)，羊IgG的檢測(cè)等等都得到了很好的解決。有益效果本發(fā)明用來(lái)分離提取干/祖細(xì)胞是采用負(fù)選與密度梯度離心相結(jié)合的方法，優(yōu)點(diǎn)是能將骨髓或臍帶血中的紅細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬等免疫細(xì)胞除盡，真正做到杜絕移植后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，所收集的干細(xì)胞/祖細(xì)胞純度純度高， 并且最終分離的細(xì)胞中不含試劑盒中的任何成分，臨床應(yīng)用安全性極好；并且收集的干/ 祖細(xì)胞表面沒有任何標(biāo)記，分離的干細(xì)胞/祖細(xì)胞種類全，細(xì)胞數(shù)量大，回收率在85%以上； 細(xì)胞活性強(qiáng)，臺(tái)盼藍(lán)染色活檢細(xì)胞存活率高于98%。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是SPG是一種新型抗體Fc段結(jié)合蛋白，其與抗體的結(jié)合譜廣，應(yīng)用范圍遠(yuǎn)高于SPA ；產(chǎn)物SPG-抗體多聚體制備簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速(60分鐘)，反應(yīng)條件要求低(室溫即可)，結(jié)合牢固穩(wěn)定性好，適宜濃度下產(chǎn)物得率高達(dá)100%，不會(huì)造成抗體的浪費(fèi)，大大降低成本，減輕患者負(fù)擔(dān)。本發(fā)明方法實(shí)用， 分離速度快，試劑穩(wěn)定性好，易于保存運(yùn)輸，可工業(yè)化生產(chǎn)，易于推廣，可廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室與臨床細(xì)胞損傷性疾病的研究與治療，是臨床迫切需要的一種干細(xì)胞的分離方法。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。以下實(shí)施例所使用的材料如下 實(shí)施例1 SPG-抗體多聚體的制備
SPG-抗體多聚體的制備，將SPG以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋濃度為0. lmg/ml，抗血型糖蛋白A單克隆抗體以抗體稀釋液稀釋至0. lmg/ml,目標(biāo)抗原的抗體以抗體稀釋液稀釋至 0. lmg/ml，在37°C下混合上述3種稀釋液，反應(yīng)30min 池，得到SPG-抗體多聚體，在2 8°C下保存；其中目標(biāo)抗原的抗體、SPG和抗血型糖蛋白A單克隆抗體的質(zhì)量比為0. 1 :1 10。SPG分子量在22 65KD之間。SPG是與抗血型糖蛋白A單克隆抗體相偶聯(lián)結(jié)合。目標(biāo)抗原的抗體為單克隆抗體，包括抗血清白蛋白抗體、特異性腫瘤抗體和抗傷寒抗體等。用于分離干細(xì)胞/祖細(xì)胞的目標(biāo)抗原的抗體包括淋巴系抗⑶2、⑶3、⑶7、⑶19、 CD21、CD24、CD73、CD81，巨核細(xì)胞系抗 CD31、CD41、CD42、CD61、CD63、CD107，NK 系抗 CD16、 CD25、CD56、CD158，粒細(xì)胞抗 CD13、CD15、CD16、CD66a、CD66b,單核細(xì)胞抗 CD14、CD52、CD87 中的一種或多種抗原的抗體四聚體的混合物。其中SPG-抗體多聚體中一種或多種目標(biāo)抗原的單克隆抗體四聚體混合物濃度，淋巴系抗⑶2、⑶3、⑶7、⑶19、⑶21、⑶M、⑶73、⑶81 為 3ng/ml,巨核細(xì)胞系抗 CD31、CD41、CD42、CD61、CD63、CD107 為 3ng/ml, NK 系抗 CD16、 CD25、CD56、CD158 為 3ng/ml，粒細(xì)胞抗 CD13、CD15、CD16、CD66a、CD66b 為 4ng/ml，單核細(xì)胞抗 CD14、CD52、CD87 為 2ng/ml。實(shí)施例2 用于分離提取骨髓/臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒該試劑盒包含SPG-抗體多聚體溶液、細(xì)胞稀釋液、細(xì)胞分離液。SPG-抗體多聚體溶液的制備方法同實(shí)施例1，其中，目標(biāo)抗原的抗體、鏈球菌G蛋白和抗血型糖蛋白A單克隆抗體的質(zhì)量比為0. 1 1 :10。
目標(biāo)抗原的抗體包括2ng/ml 淋巴系抗 CD2、CD3、CD7、CD19、CD21、CD24、CD73、 CD81，2ng/ml 巨核細(xì)胞系抗 CD31、CD41、CD42、CD61、CD63、CD107, lng/mlNK 系 CD16、CD25、 CD56、CD158，2ng/ml 粒細(xì)胞抗 CD13、CD15、CD16、CD66b，lng/ml 單核細(xì)胞抗 CD14、CD52、CD87
中的一種或多種單克隆抗體四聚體的混合物。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將SPG-抗體多聚體溶液稀釋至l g/ml，2 8°C下保存。細(xì)胞稀釋液選用PBS 將氯化鈉8g，氯化鉀0. 2g，十二水磷酸氫二鈉2. 9g，磷酸二氫鉀0. 2g溶解在IOOOml去離子水中即可，使用時(shí)用0. 5M的碳酸鈉調(diào)節(jié)PH=7. 2。細(xì)胞分離液為泛影葡胺-聚蔗糖400#溶液，有0. 3 1. 5%的泛影葡胺與8%的聚蔗糖400#組成的水溶液，其密度為1. 077g/ml, PH=7. 0 7. 8。上訴抗體試劑經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌，細(xì)胞稀釋液，細(xì)胞分離液等經(jīng)過(guò)12rC，30min高溫高壓滅菌，檢測(cè)內(nèi)毒素彡0. 5EU/ml，無(wú)菌操作后，分別存放于試劑盒中。使用時(shí)將含有枸櫞酸鈉抗凝的人骨髓/臍帶血200ml加入到含有200ml的細(xì)胞稀釋液的500ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，之后加入100ml l g/ml的SPG-抗體多聚體溶液中緩慢搖勻，靜置30分鐘，形成“紅細(xì)胞-抗血型糖蛋白A單克隆抗體-SPG-目標(biāo)抗原的抗體”復(fù)合物，通過(guò)血沉過(guò)程除去紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多核細(xì)胞、粒細(xì)胞與成熟的單核細(xì)胞，之后用含有細(xì)菌過(guò)濾功能的電動(dòng)細(xì)胞移液器將上清液移至50ml的無(wú)菌離心管中，在低溫(4°C)水平式離心機(jī)中2500轉(zhuǎn)，5分鐘離心濃縮，棄上清液，用生理鹽水重懸沉淀至離心管底部的細(xì)胞， 收集至一管中。另取兩支50ml離心管，每支加入細(xì)胞分離液20ml，將上述用生理鹽水重懸的細(xì)胞液沿離心管壁緩慢加入，之后2000轉(zhuǎn)離心30分鐘。離心后收取離心管中間絮狀細(xì)胞層至新的離心管中，用生理鹽水洗滌2-4次，再用生理鹽水稀釋至所需要的體積即可使用。實(shí)施例3 用于分離提取骨髓/臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒該試劑盒包含SPG-抗體多聚體溶液、細(xì)胞稀釋液、細(xì)胞分離液。SPG-抗體多聚體溶液制備方法同實(shí)施例1，其中，目標(biāo)抗原的抗體、SPG和抗血型糖蛋白A單克隆抗體的質(zhì)量比為1 :1 :10。目標(biāo)抗原的抗體包括4ng/ml 淋巴系抗 CD2、CD3、CD7、CD19、CD21、CD24、CD73、 CD81，3ng/ml 巨核細(xì)胞系抗 CD31、CD41、CD42、CD61、CD63、CD107，4ng/ml NK 系 CD16、CD25、 CD56、CD158，5ng/ml 粒細(xì)胞抗 CD13、CD15、CD16、CD66b，3ng/ml 單核細(xì)胞抗 CD14、CD52、CD87
中的一種或多種單克隆抗體四聚體的混合物。用PBS將SPG-抗體多聚體溶液稀釋至l g/ml，2 8°C下保存。細(xì)胞稀釋液選用0. 85 0. 9%的生理鹽水(市售)
細(xì)胞分離液為泛影葡胺-聚蔗糖400#溶液，有0. 3 1. 5%的泛影葡胺與8%的聚蔗糖 400#組成的水溶液，其密度為1. 077g/ml, PH=7. 0 7. 8。上訴抗體試劑經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌，細(xì)胞稀釋液，細(xì)胞分離液等經(jīng)過(guò)12rC，30min高溫高壓滅菌，檢測(cè)內(nèi)毒素彡0. 5EU/ml，無(wú)菌操作后，分別存放于試劑盒中。使用方法同實(shí)例2。實(shí)施例4 抗原檢測(cè)試劑盒
腫瘤細(xì)胞存在著與正常組織不同的抗原成分，通過(guò)檢測(cè)這種抗原成分或用這種抗原成分誘導(dǎo)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，可以達(dá)到診斷和治療腫瘤的目的，但這方面研究沒有取得明顯的進(jìn)展。本發(fā)明提供了一種利用SPG-抗體多聚體溶液生產(chǎn)腫瘤快速檢測(cè)的試劑盒。
該試劑盒包含有SPG-抗體多聚體溶液、抗體稀釋液。SPG-抗體多聚體溶液制備SPG用無(wú)菌PBS液稀釋至濃度為0. lmg/ml，將抗紅細(xì)胞單克隆抗體與抗腫瘤抗體用抗體稀釋液稀釋至0. lmg/ml，其中抗腫瘤抗體、抗紅細(xì)胞單克隆抗體和SPG蛋白的質(zhì)量比為3 3 :1。取上述濃度與質(zhì)量比的抗體、SPG在37°C下反應(yīng) 30分鐘 2小時(shí)，得到SPG-抗體多聚體，用PBS將SPG-抗體多聚體溶液稀釋至l g/ml， 2 8°C下保存?？贵w稀釋液為含有0. Γ %牛血清白蛋白，0. 1%明膠的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，PH為 7. 2。使用時(shí)將樣本加入到SPG-抗體多聚體溶液中，搖勻后37°C下靜置40分鐘，肉眼可看到凝集現(xiàn)象，取樣本顯微鏡下觀察有花環(huán)聚集沉淀即為陽(yáng)性。實(shí)施例5 抗原檢測(cè)試劑盒
豬瘟俗稱“爛腸瘟“是一種具有高度傳染性疫病，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染傳染病。其具有高度傳染性和致死性，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。該試劑盒包含有抗體稀釋液、SPG-抗體多聚體溶液。SPG-抗體多聚體溶液SPG用無(wú)菌PBS液稀釋至濃度為0. lmg/ml，將抗紅細(xì)胞單克隆抗體與抗豬瘟病毒抗體用抗體稀釋液稀釋至0. lmg/ml，其中牛腹瀉病毒抗體、抗紅細(xì)胞單克隆抗體和SPG蛋白的質(zhì)量比為3 3 :1。取上述濃度與質(zhì)量比的抗體、SPG在37°C下反應(yīng)30分鐘 2小時(shí)，得到SPG-抗體多聚體，用PBS將SPG-抗體多聚體溶液稀釋至l g/ ml，2 8°C下保存?？贵w稀釋液為含有0. Γ %牛血清白蛋白，0. 1%明膠的磷酸鹽緩沖液，PH為7. 2。使用時(shí)將樣本加入到SPG-抗體多聚體溶液中，搖勻后37°C下靜置30分鐘，取樣本顯微鏡下觀察有花環(huán)聚集沉淀即為陽(yáng)性，即感染了豬瘟病毒。實(shí)施例5 抗原檢測(cè)試劑盒
牛病毒性腹瀉(粘膜病)是由病毒引起的傳染病，各種年齡的牛都易感染、以幼齡牛易感性最高。傳染來(lái)源主要是病畜。病牛的分泌物、排泄物、血液和脾臟等都含有病毒，以直接接觸或間接接觸方式傳播。該試劑盒包含有抗體稀釋液、SPG-抗體多聚體溶液。SPG-抗體多聚體溶液SPG用無(wú)菌PBS液稀釋至濃度為0. lmg/ml，將抗紅細(xì)胞單克隆抗體與牛腹瀉病毒抗體用抗體稀釋液稀釋至0. lmg/ml，其中牛腹瀉病毒抗體、抗紅細(xì)胞單克隆抗體和SPG蛋白的質(zhì)量比為3 3 :1。取上述濃度與質(zhì)量比的抗體、SPG在37°C下反應(yīng)30分鐘 2小時(shí)，得到SPG-抗體多聚體，用PBS將SPG-抗體多聚體溶液稀釋至l g/ ml，2 8°C下保存?？贵w稀釋液為含有0. Γ %牛血清白蛋白，0. 1%明膠的磷酸鹽緩沖液，PH為7. 2。使用時(shí)將樣本加入到SPG-抗體多聚體溶液中，搖勻后37°C下靜置30分鐘，取樣本顯微鏡下觀察有花環(huán)聚集沉淀即為陽(yáng)性，即感染了牛病腹瀉病毒。實(shí)施例6檢驗(yàn)血液中特異性抗原的指示劑。瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，及時(shí)準(zhǔn)確、快速簡(jiǎn)便的診斷對(duì)瘧疾的防治有重要意義，這不僅可以降低重癥患者和死亡的發(fā)生，改善愈后，還可用于瘧疾的流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)控疫情、控制和預(yù)防大規(guī)模暴發(fā)流行。傳統(tǒng)的厚薄血膜涂片顯微鏡檢查法耗時(shí)費(fèi)力，需要專業(yè)人員，運(yùn)用免疫學(xué)新技術(shù)研制瘧疾診斷試劑盒具有快速、敏感、特異、穩(wěn)定的診斷的特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，易學(xué)易會(huì)，對(duì)瘧疾的臨床診斷、治療、有效防控及研究均極其有利， 有廣闊的發(fā)展前景。該試劑盒包含有抗體稀釋液、SPG-抗體多聚體溶液。SPG-抗體多聚體溶液SPG用無(wú)菌PBS液稀釋至濃度為0. lmg/ml，將抗紅細(xì)胞單克隆抗體與抗惡性瘧原蟲HRP- II抗原單克隆抗體用抗體稀釋液稀釋至0. lmg/ml，其中抗惡性瘧原蟲HRP- II抗原單克隆抗體、抗紅細(xì)胞單克隆抗體和SPG蛋白的質(zhì)量比為3 3 :1。 取上述濃度與質(zhì)量比的抗體、SPG在37°C下反應(yīng)30分鐘 2小時(shí)，得到SPG-抗體多聚體， 用PBS將SPG-抗體多聚體溶液稀釋至l g/ml，2 8°C下保存?？贵w稀釋液為含有0. Γ %牛血清白蛋白，0. 1%明膠的磷酸鹽緩沖液，PH為7. 2。使用時(shí)將樣本血液加入到SPG-抗體多聚體溶液中，搖勻后37°C下靜置30分鐘，取樣本顯微鏡下觀察有花環(huán)聚集沉淀即為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種SPG-抗體多聚體，其特征在于由抗血型糖蛋白A單克隆抗體、SPG與目標(biāo)抗原的抗體偶聯(lián)而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體，其特征在于所述的SPG與抗血型糖蛋白 A單克隆抗體相偶聯(lián)結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體，其特征在于所述的SPG分子量為 22 6OT)。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體的方法，其特征在于將SPG以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為0. lmg/ml，抗血型糖蛋白A單克隆抗體以抗體稀釋液稀釋至 0. lmg/ml,目標(biāo)抗原的抗體以抗體稀釋液稀釋至0. lmg/ml，在37°C下混合稀釋后3種溶液， 反應(yīng)30min 池，得到SPG-抗體多聚體溶液，在2 8°C下保存；其中，目標(biāo)抗原的抗體、鏈球菌G蛋白和抗血型糖蛋白A單克隆抗體的質(zhì)量比為0. Γ :1 :10。
5.權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體在制備用于分離提取骨髓/臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。
6.一種基于權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體的用于分離提取骨髓/臍帶血干細(xì)胞 /祖細(xì)胞的試劑盒，其特征在于包括細(xì)胞稀釋液、SPG-抗體多聚體溶液和細(xì)胞分離液；其中，SPG-抗體多聚體溶液中的目標(biāo)抗原的單克隆抗體，包括淋巴系抗⑶2、⑶3、⑶7、⑶19、 CD21、CD24、CD73、CD81，巨核細(xì)胞系抗 CD31、CD41、CD42、CD61、CD63、CD107，NK 系抗 CD16、 CD25、CD56、CD158，粒細(xì)胞抗 CD13、CD15、CD16、CD66a、CD66b,單核細(xì)胞抗 CD14、CD52、CD87 中的一種或多種抗原的抗體四聚體的混合物。
7.權(quán)利要求5所述的基于權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體的用于分離提取骨髓/ 臍帶血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的試劑盒的使用方法，其特征在于首先用細(xì)胞稀釋液將骨髓/臍帶血按1 1的比例進(jìn)行稀釋，然后加入SPG-抗體多聚體溶液，緩慢搖勻，靜置30分鐘，取上清液離心濃縮，將濃縮液加入到細(xì)胞分離液，離心30分鐘，收取細(xì)胞層洗滌2-4次即可使用。
8.權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體在制備用于檢驗(yàn)血液中特異性抗原的指示劑中的應(yīng)用。
9.一種基于權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體的檢驗(yàn)血液中特異性抗原的試劑盒，其特征在于包括抗體稀釋液和SPG-抗體多聚體溶液；其中，SPG-抗體多聚體溶液中的目標(biāo)抗原的抗體為抗腫瘤抗體、抗豬瘟病毒抗體或牛腹瀉病毒抗體。
10.權(quán)利要求9所述的基于權(quán)利要求1所述的SPG-抗體多聚體的檢驗(yàn)血液中特異性抗原的試劑盒的使用方法，其特征在于將SPG-抗體多聚體進(jìn)行稀釋，加入到待測(cè)液中，37°C 下30min后形成肉眼或顯微鏡下可見的經(jīng)典玫瑰花環(huán)狀，即為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種SPG-抗體多聚體及其制備方法和應(yīng)用。該SPG-抗體多聚體由抗血型糖蛋白A單克隆抗體、SPG與目標(biāo)抗原的抗體偶聯(lián)而成。該多聚體一端通過(guò)抗血型糖蛋白A單克隆抗體與紅細(xì)胞相偶聯(lián)，另一端通過(guò)目標(biāo)細(xì)胞表面抗原或其他抗原的抗體與目標(biāo)抗原相偶聯(lián)，之后靜置通過(guò)紅細(xì)胞沉淀來(lái)檢測(cè)目標(biāo)抗原，或通過(guò)密度梯度離心來(lái)去除血液中成熟的有核細(xì)胞與紅細(xì)胞，保留所有的干細(xì)胞/祖細(xì)胞。本發(fā)明用來(lái)分離提取干/祖細(xì)胞是采用負(fù)選與密度梯度離心相結(jié)合的方法，收集的干/祖細(xì)胞表面沒有任何標(biāo)記，細(xì)胞活性好，方法簡(jiǎn)單實(shí)用，可工業(yè)化生產(chǎn)，易于推廣，可廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室與臨床細(xì)胞損傷性疾病的研究與治療，前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102167746SQ201010542698
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2010年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月11日
發(fā)明者劉洋洋, 姜東成 申請(qǐng)人:姜東成