專利名稱:一種堿性酯酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種堿性酯酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù):
自然界中存在的能夠降解酯類的酶包括脂肪酶(lipase,EC 3. 1. 1.3), 酯酶(esterase)或羧酸酯酶(carboxylesterase,EC 3. 1. 1. 1),以及各種磷脂酶 (phospholipase),它們廣泛存在于微生物、植物種子和動(dòng)物組織中(Jaeger KE, et al. Annu. Rev. Microbiol. 1999,53 :315_351)。脂肪酶可以定義為一類能夠催化具有較長(zhǎng)?;?C原子數(shù)目> 10)的甘油酯類化合物降解和合成的酶,脂肪酶的標(biāo)準(zhǔn)底物是甘油三油酸酯。相反,酯酶則是一類催化具有較短?;?C原子數(shù)目< 10)的甘油酯類化合物的降解和合成(Jaeger KE, et al. FEMS Microbiol. Rev. 1994,15 29-63)。原核生物來源的酯酶具有一個(gè)高度保守五肽序列Gly-X-Ser-X-Gly,其中的絲氨酸和一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基通過氫鍵與一個(gè)組氨酸相連以形成催化三聯(lián)體?;诎被嵝蛄幸约吧锘钚缘谋容^,原核來源的酯酶可以分為 8 個(gè)不同家族(Jaeger KE, et al. Biochem. J. (1999)343,177-183)。酯酶作為重要的工業(yè)用酶,主要應(yīng)用于有機(jī)合成、酯交換、立體異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化和拆分等催化反應(yīng)。酯酶的催化反應(yīng)具有不需要輔酶、穩(wěn)定性好、反應(yīng)條件溫和、方法簡(jiǎn)便、 催化活性高、選擇性強(qiáng)、產(chǎn)物易于分離和易于回收等優(yōu)點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)用于食品加工、新型生物材料、生物傳感器、生物醫(yī)學(xué)、藥物、農(nóng)藥、化妝品和香料的生產(chǎn)等(Jaeger KE, et al. Trends in Biotechnology, 1998,16(9) :396_403 ;中國(guó)專利,CN101225369,2008 年 7 月 23 日;Haki GD, et al.Bioresour. Technol. 2003,89 17-34, JaegerKE, Curr. Opin. Biotechnol. 2002,13 :390_397)?,F(xiàn)有微生物酯酶大多是從可培養(yǎng)的微生物中分離所得(Jtogen Pleiss et al. Journalof Molecular Catalysis B :Enzymatic. 2000,10 (5) :491_508)。國(guó)內(nèi)夕卜許多專利和文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了從不同微生物中分離的酯酶蛋白及編碼基因(Jaeger KE, et al.FEMSMicrobiol. Rev. 1994,15 29-63 ;Arpigny JL, Jaeger KE. Biochem J. 1999, 343:177-183)。我國(guó)學(xué)者孫謐等報(bào)道了來源于海洋微生物Bacillus sp. MP-2的酯酶(CN101225369,2008 年 7 月 23 日);Zhangjian 等報(bào)道了從 Thermoanaerobacter tengcongensis 中分離得至Ij 的一種耐熱酉旨醇基因(Jian Zhang et al. Biotechnology Letters. 2003,25 1463-1467.) ;Yuji Hotta 等從嗜熱古菌Pyrobaculum calidifontis 分離得到一種耐熱酯酶(Yuji Hotta, etal. Appl Environ Microbiol. 2002,68 3925-3931); Alessandra Morana報(bào)道了一種從嗜熱菌Sulflobus solfataricus中得到的酯酶基因(Alessandra Morana, Gene. 2002,283 107-115) ;Young 等 艮道了 Lactobacillus casei CL96 的酯酶基因(Young J. Choi et al. Appl Environ Microbiol. 2004,70(6) 3213-3221) ;Satoshi Kakugawa 等報(bào)道了 Thermotoga maritima 的酯酶基因(Satoshi Kakugawa et al. Appl Microbiol Biotechnol. 2007,74 :585-591)。然而有研究表明,目前環(huán)境中可培養(yǎng)微生物僅占其總量的不到1%,超過99 %的微生物尚未得到分離培養(yǎng)(Manuel Ferrer et al. Current Opinion in Biotechnology. 2005,16(6) :588-593),因此有巨大量的微生物基因資源被我們所遺漏。為了能夠利用這一我們以前從未觸及的巨大基因資源庫(kù),宏基因組學(xué)(Metagenomics)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。宏基因組學(xué)是指不依賴于微生物的純培養(yǎng),而直接從環(huán)境或共生體中分離出其中所存在的所有基因組DNA,然后將合適大小的DNA片段連接到載體上體,再導(dǎo)入宿主以構(gòu)建宏基因組文庫(kù),之后再基于所構(gòu)建的宏基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選,以期待獲得新穎的酶基因或新穎的活性天然產(chǎn)物(Jo Handelsman et al. Current Opinion in Biotechnology. 2003,14 303-310 ;Manuel Ferrer et al. Current Opinion in Biotechnology. 2005,16(6) :588-593)。從宏基因組文庫(kù)中篩選酯酶,目前有兩種方法一、基于活性的篩選;二、基于序列的篩選。目前已有利用宏基因組學(xué)技術(shù)從土壤、淡水和海洋等環(huán)境中克隆新的酯酶基因的報(bào)道(Lee Sff et al. Appl Microiol Biotechnol. 2004,65 :720-726 Jin-Kyu Rheeet al.Appl Environ Microbiol. 2005,71 :817-825 ;Ravi Ranjan et al. Biochemical andBiophysical Research Communications.2005,335 :57-65 ;F Hardeman et al. FEMSMicrobiology Ecology. 2007,59 :524-534)。海洋環(huán)境,尤其是深海由于其獨(dú)特且多樣的生態(tài)環(huán)境賦予了海洋微生物與其環(huán)境相適應(yīng)的獨(dú)特代謝途徑和基因表達(dá)產(chǎn)物,因此,海洋微生物逐漸成為人們獲取新基因資源的天然寶庫(kù)。我國(guó)幅員遼闊,擁有廣闊的海域,從中獲得新的微生物天然資源已經(jīng)逐漸引起了人們的關(guān)注。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種堿性酯酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的堿性酯酶,命名為L(zhǎng)ipNR,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列為序列表中的序列2 ;(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能催化水解羧酸酯的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中,序列表中序列2由401個(gè)氨基酸殘基組成。為了使(a)中的LipNR便于純化,可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
Γ^Ι
Poly-Arg5-6(通常為 5 個(gè)) RRRRR
Poly-His2-10(通常為 6 個(gè)) HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
4
上述(b)中的LipNR可人工合成,也可先合成其編碼基因,再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述(b)中的LipNR的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子,和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變,和/或在其5'端和/ 或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼LipNR的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。編碼LipNR的基因具體可為如下(a)或(b)或(c)的基因(a)其核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子;(b)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼能催化水解羧酸酯的蛋白的DNA分子;(c)與(a)的基因具有90%以上的同源性,且編碼能催化羧酸酯水解的蛋白的DNA 分子。所述步驟(c)中的基因,與(a)的基因最好有95%以上的同源性。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC,0. 5% SDS,5 XDenhardt,s 液,100ug/ml 鮭魚精 DNA 的溶液中,在65°C下雜交,然后用2 X SSC, 0. 1% SDS和1XSSC,0. 1% SDS各洗膜一次。序列表中的序列1由1203個(gè)堿基組成,自序列1的5'末端第1-1203位核苷酸為編碼序列,編碼具有序列表中序列2所示的蛋白質(zhì),自5'末端第1-3位為起始密碼子。擴(kuò)增上述LipNR基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述LipNR基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的LipNR基因來源于深海環(huán)境,并證實(shí)其在較低的溫度條件下具有良好活性和穩(wěn)定性,適用于化工、食品、生物轉(zhuǎn)化、醫(yī)藥工業(yè)和其它相關(guān)工業(yè)。
圖1為重組質(zhì)粒pFOS: LipNR的構(gòu)建示意圖。圖2為重組質(zhì)粒pUC18: LipNR的構(gòu)建示意圖。圖3為重組質(zhì)粒pET28b: LipNR的構(gòu)建示意圖。圖4為重組蛋白LipNR的酯催化底物選擇性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 深海沉積物宏基因組DNA的提取 深海沉積物取自中國(guó)南海,水深778. 5米,經(jīng)度110 ° 22.47' E,緯度 17° 33.35' N。稱取 5g 沉積物樣品,加入 13. 5ml DNA 提取液(IOOmmol Tris-HCl, IOOmmol EDTA, IOOmmol 磷酸鈉,1. 5mol NaCl, lg/100ml CTAB, ρΗ8. 0),再加入 100 μ 1 蛋白酶K(10mg/ml),225rpm水平搖床37°C振蕩30分鐘,然后加入1. 5ml 20g/100ml的SDS, 65°C水浴2小時(shí),每隔15-20分鐘輕柔顛倒幾次,室溫6000Xg離心10分鐘;收集上清,轉(zhuǎn)移至50ml離心管,沉淀中加入4. 5ml DNA提取液和0. 5ml 20g/100ml SDS,65°C水浴10分鐘,6000Xg離心10分鐘,收集上清與上次上清合并;重復(fù)上述操作,收集上清與前兩次上清合并;上清與等體積的氯仿-異戊醇混合液(氯仿與異戊醇體積比24 1)混合,離心, 吸取水相轉(zhuǎn)移至另一 50ml離心管,以0. 6倍體積的異丙醇室溫沉淀1小時(shí),16000Xg離心20分鐘,收集沉淀,用冷70% (體積百分濃度)乙醇溶液洗滌沉淀,沉淀晾干后重懸于滅菌去離子水,脈沖場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA片段。實(shí)施例2 深海沉積物宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建與篩選將上述粗提DNA進(jìn)行脈沖場(chǎng)瓊脂糖凝膠電泳,電洗脫純化回收36-481Λ大片段 DNA,用 CopyContro1 Fosmid Library Production Kits 的 End-Repair Enzyme Mix 進(jìn)行末端補(bǔ)平。然后以0. 5XTE緩沖液(Tris-HCl/EDTA, ρΗ8· 0)進(jìn)行點(diǎn)透析2小時(shí),換 30g/100ml PEG8000濃縮DNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度,按插入片段分子數(shù)pCC2F0S 載體(美國(guó)EPICENTRE公司)分子數(shù)為1 10的比例以i^ist-Link DNA連接酶室溫2小時(shí)進(jìn)行連接,再次以0. 5XTE緩沖液(Tris-HCl/EDTA,pH8. 0)進(jìn)行點(diǎn)透析2小時(shí),換30g/100ml PEG8000濃縮DNA,取10 μ 1連接后的DNA加入到25 μ 1冰上融化的MaxPlax Lambda Packaging Extracts,30 °C, 90 分鐘溫育后力口入另夕卜 25 μ 1 MaxPlaxLambda Packaging Extracts,30°C,90分鐘溫育,加入PDB緩沖液(IOmM Tris-HCl [pH8. 3], IOOmM NaCl和 IOmM MgCl2)至終體積1ml。取大腸桿菌EPI300-T1K單菌落(美國(guó)EPICENTRE公司)接入LB液體培養(yǎng)基220rpm,37°C過夜培養(yǎng)進(jìn)行活化。5ml過夜培養(yǎng)物加入到50ml新鮮LB培養(yǎng)基(含 IOmM MgS04),37°C,220rpm振蕩至0D_ = 0. 8-1.0。取50μ 1 包裝后混合物加入950μ 1 上述培養(yǎng)的大腸桿菌,370C,20分鐘溫育,取部分菌液涂布于含12. 5 μ g/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基, 37°C過夜培養(yǎng)計(jì)算文庫(kù)克隆數(shù);剩余菌液加入終濃度20ml/100ml的甘油,儲(chǔ)存于_80°C。取部分文庫(kù)涂于添加終質(zhì)量百分濃度為的三丁酸甘油酯、終質(zhì)量百分濃度為1 %阿拉伯膠和終濃度為12. 5μ g/ml氯霉素的LB固體培養(yǎng)基,30°C培養(yǎng)M-48小時(shí),菌落周圍有透明圈的即為陽性克隆,結(jié)果獲得一個(gè)陽性克隆,將此陽性克隆命名為 EPI300LipNR。將EPI300LipNR劃線分離單菌落接入含12. 5 μ g/ml氯霉素的5ml液體LB 培養(yǎng)基,并加入 5μ 1 的 1000 X CopyControl Autoinduction Solution,37°C,200rpm 培養(yǎng) 17小時(shí)后,使用OMEGA公司的小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,此質(zhì)粒命名為pFOS: LipNR, 圖1為pFOS: LipNR的構(gòu)建示意圖,酶切分析證明pFOS: LipNR含有的插入片段,大小約為 36kb。將pFOS: LipNR以Sau3AI部分酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收2-31Λ DNA片段。取2μ 1回收的DNA片段加入0. 5μ 1 BamHI酶切后去磷酸化處理的質(zhì)粒pUC18(北京Tiangen公司),以T4 DNA連接酶于16°C過夜連接;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (北京 Tiangen公司)感受態(tài)細(xì)胞,涂于添加了終濃度100 μ g/ml氨芐青霉素、終質(zhì)量百分濃度
三丁酸甘油酯和終質(zhì)量百分濃度阿拉伯膠的LB固體培養(yǎng)基,37°C培養(yǎng)16小時(shí),菌落周圍有明顯水解圈的即為陽性克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒,命名為PUC18: LipNR,圖2為 PUC18 LipNR的構(gòu)建示意圖,酶切鑒定,重組質(zhì)粒pUC18 LipNR含有的外源DNA片段,大小約為2. 01Λ,含pUC18: LipNR的大腸桿菌命名為大腸桿菌DH5 α LipNR。將重組質(zhì)粒pUC18::LipNR在華大基因進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序得到插入片段總長(zhǎng)度 1. 91Λ,含有一個(gè)1203堿基的開放閱讀框,經(jīng)分析該開放閱讀框的核苷酸序列含有1203堿基的推定LipNR編碼基因,LipNR基因如序列1所示,其編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)。 序列比對(duì)表明此蛋白為脂肪酶/酯酶超家族的蛋白,與已有數(shù)據(jù)庫(kù)中Dethiosulfovibrio ρ印tidovorans DSM 11002的酯酶具有最高相似性25%。實(shí)施例3 =LipNR基因的獲得
人工合成一對(duì)引物L(fēng)ipNR-f(5,~GTCCATATGAAAACCGGCCG~3’ )和 LipNR_r(5,-CC CAAGCTTATCAAGATTTTCG-3,),以pUC18: LipNR為模板按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得大小約為1. 2kb的兩端含有限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物25 μ 1體系(含有 2. 5μ 1 TAKARA 10XPCR buffer, 0. 2mM dNTP, 1. 5U TAKARA rTaq,0. 4μΜ LipNR-f, 0. 4 μ M LipNR-r, 1 μ 1模板)下95°C預(yù)變性4分鐘,接著25輪循環(huán)的95°C變性1分鐘、55°C退火1 分鐘、72°C延伸1分鐘,最后額外延伸10分鐘。將PCR產(chǎn)物測(cè)序表明,該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行NdeI和HindIII雙酶切后,與經(jīng)過同樣酶切的質(zhì)粒ρΕΤ2^ (+) (N0VAGEN)在T4DNA連接酶作用下16°C連接半小時(shí),獲得重組質(zhì)粒pET28b: :LipNR,圖3 為重組質(zhì)粒pET28b: LipNR的構(gòu)建示意圖。重組質(zhì)粒pET28b: LipNR轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (N0VAGEN),涂于添加終濃度為50 μ g/L的卡那霉素、終質(zhì)量百分濃度1 %的三丁酸甘油酯、終質(zhì)量百分濃度的阿拉伯膠的LB培養(yǎng)基上,37°C培養(yǎng)16小時(shí),根據(jù)透明圈獲得陽性克隆,將陽性克隆進(jìn)行鑒定,將鑒定正確的陽性克隆命名為BL21LipNR。將載體 pET28b (+)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21,得到的重組菌BL21-28b,作為對(duì)照。同時(shí),人工合成序列表中序列1的核苷酸,并在其兩端加入限制性內(nèi)切酶NdeI和 HindIII酶切位點(diǎn),按照上述方法將合成片段用插入經(jīng)過同樣酶切的質(zhì)粒pET28b(+)中, 獲得重組載體,將重組載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,將驗(yàn)證正確的載體命名為pET28b::LipNR-l, 將pET28b::LipNR-I轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21獲得的鑒定正確的重組BL21菌命名為 BL21LipNR-l。將重組菌BL21LipNR-l、BL21LipNR和BL21_28b單菌落分別接種于添加終濃度為 50 μ g/L的卡那霉素、終質(zhì)量百分濃度的三丁酸甘油酯、終質(zhì)量百分濃度的阿拉伯膠的LB培養(yǎng)基上,37°C培養(yǎng)16小時(shí)。結(jié)果表明,重組菌BL21LipNR-l和BL21LipNR接種處均產(chǎn)生了透明圈,而BL21-2 沒有產(chǎn)生透明圈。說明重組菌BL2 ILipNR-I、BL2 ILipNR所含的質(zhì)粒中具有可表達(dá)酯酶的基因,該基因?yàn)榫哂行蛄?中所示的核苷酸序列的LipNR基因。重組菌BL21LipNR-l、BL21LipNR和BL21_28b單菌落分別接種于含50 μ g/L卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基中,37°C振蕩培養(yǎng)16小時(shí)后,按體積百分比為接種量轉(zhuǎn)接新鮮含50 μ g/ml卡那霉素的50ml LB液體培養(yǎng)基中,37°C振蕩培養(yǎng)至0D_ = 0. 6,加入終濃度為0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),37°C振蕩培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)4小時(shí)后,將培養(yǎng)物在12,000轉(zhuǎn)/分鐘下離心15分鐘。傾去上清,獲得菌體沉淀。將菌體沉淀用磷酸緩沖液溶液洗滌兩次,并溶于裂解緩沖液中(NaCl 500mM,咪唑 20mM, Na2HPO4 20mM,pH 7. 4),用超聲破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎,12,000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集上清。取預(yù)裝Iml鎳離子親和層析柱填料的HistrapFF柱(美國(guó)GE公司),先用10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液(NaCl 500mM,咪唑20mM,Na2HP0420mM, pH 7.4)平衡柱子,流速控制為lml/min。將超聲破碎產(chǎn)物離心所得上清與5X結(jié)合緩沖液以體積比4 1混勻,調(diào)節(jié)pH 為7.4。用0.45 μ m無菌濾頭過濾后上柱,流速為lml/min。用結(jié)合緩沖液沖洗柱子,直至洗下的溶液的蛋白特異吸收值達(dá)到穩(wěn)定的基線水平。用含500mM咪唑的洗脫緩沖液(NaCl 500mM,咪唑500mM,Na2HP0420mM, pH 7. 4)沖洗柱子,收集洗脫液,獲得純化的LipNR蛋白溶液,將純化的LipNR蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明,重組菌BL21LipNR_l、BL21LipNR表達(dá)的蛋白均為單一條帶,分子量約為45,420道爾頓。而相應(yīng)的攜帶pET28b (+)空質(zhì)粒的BL21_28b在SDS-PAGE 膠的同樣位置沒有這條重組表達(dá)的蛋白條帶。實(shí)施例4 重組菌BL21LipNR-l、BL21LipNR的酯水解活性向LB培養(yǎng)基中添加終質(zhì)量百分濃度的三丁酸甘油酯,終質(zhì)量百分濃度的阿拉伯膠(用作乳化三丁酸甘油酯),高壓滅菌后,加入終濃度為50yg/ml卡那霉素,鋪制平板。平板冷卻后涂布8μ 1 500mM IPTG,待吸干后分別點(diǎn)種重組菌重組菌BL21LipNR_l、 BL2ILipNR 和 BL21-28b, 30°C培養(yǎng) 36 小時(shí)。配置添力口 p_nitrophenyl butyrate 或 p_nitrophenyl caprate, 0. 1 紅, ρΗ7· 2-7. 3的50mM Tris-HCl溶液。分裝Iml該溶液至1. 5ml EP管,分別加入重組LipNR 蛋白和BL21-28b菌體裂解物,37°C反應(yīng)30min。觀察結(jié)果如圖4所示,表明重組菌重組菌BL21LipNR、BL2ILipNR-I在三丁酸甘油酯瓊脂平板上均形成明顯的透明圈(圖中A所示為BL21LipNR-l),對(duì)照(重組菌BL21_28b) 無透明圈(圖中B所示);而加入重組LipNR蛋白的含p-nitrophenylbutyrate (圖中D所示)或p-nitrophenyl caprate (圖中E所示)顏色均可由紅變黃,說明這兩種底物都可以被重組LipNR蛋白水解,產(chǎn)生了自由酸,使得pH降低,導(dǎo)致溶液顏色變黃,而加入BL21-28b 菌體裂解物的含p-nitrophenyl butyrate溶液孵育后顏色未發(fā)現(xiàn)顯著變化(圖中C所示)。這證明了 LipNR基因表達(dá)的重組蛋白具有酯水解活性,且對(duì)含長(zhǎng)短碳鏈的酯均有一定活性。
權(quán)利要求
1.一種蛋白,是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列為序列表中的序列2;(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且能催化水解羧酸酯的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因,其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?a)或(b)或(c)的基因(a)其核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子;(b)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼能催化水解羧酸酯的蛋白的DNA分子;(c)與(a)的基因具有90%以上的同源性,且編碼能催化水解羧酸酯的蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白在催化水解羧酸酯中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2或3所述基因在制備催化水解羧酸酯的酯酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酯酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明公開的酯酶是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)其氨基酸序列為序列表中的序列2;(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且能催化水解羧酸酯的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了編碼該酯酶的基因。本發(fā)明的酯酶適用于化工、食品、生物轉(zhuǎn)化、醫(yī)藥工業(yè)和其它相關(guān)工業(yè)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102465118SQ20101054391
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月10日
發(fā)明者代煥琴, 傅成章, 張立新, 謝峰, 郭徽 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所