專利名稱：一種重組畢赤酵母植酸酶高密度工業(yè)發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，具體地涉及一種重組畢赤酵母植酸酶高密度工業(yè)發(fā)酵方 法。
背景技術(shù)：
巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近20幾年發(fā)展起來的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，早期被 用來生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，直到1987年，Cgata等人首次將畢赤酵母用于外源基因的表達(dá) (JMCregg, et al. 1987)。甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母是研究和運用很廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，目前已有超過 400種蛋白得到表達(dá)。這種系統(tǒng)的優(yōu)點包括(1)外源蛋白的高表達(dá)；(2)外源蛋白分泌的 高效率；(3)高效轉(zhuǎn)錄后修飾，例如糖基化；(4)可以實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。醇氧化酶(alcohol oxidase, A0X)是甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，也是 甲醇代謝途徑中的第一個酶。畢赤酵母中有兩種編碼醇氧化酶的基因A0X1和A0X2，其中 AOXl是決定細(xì)胞中醇氧化酶活力的主要因素。AOX啟動子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)了醇氧化酶的表 達(dá)，這其中包含了雙重調(diào)控作用當(dāng)存在抑制性碳源如甘油、葡萄糖時AOX表達(dá)受抑制，外 源基因也處于不表達(dá)狀態(tài)，而以甲醇為唯一碳源時，AOX基因才能高表達(dá)。因此重組畢赤酵 母表達(dá)外源蛋白通常分為三個階段，甘油分批發(fā)酵階段、甘油補(bǔ)料階段和外源基因誘導(dǎo)表 達(dá)階段。巴斯德重組畢赤酵母具有如下的生理特征(1)好氧型菌株，培養(yǎng)時需要大量供 氧。(2)存在Crabtree效應(yīng)，效應(yīng)的臨界值很低，一般在0. Ι-lg/L左右?；|(zhì)濃度超過該 值，對菌體生長有抑制作用的代謝副產(chǎn)物(如乙醇)便會隨之產(chǎn)生，(3)乙醇對菌體生產(chǎn)、 特別是外源蛋白的表達(dá)存在很大的抑制作用。所以在表達(dá)外源蛋白時受很多因素影響，要 考慮菌體自身的因素，還要顧及培養(yǎng)過程中的外部環(huán)境條件，如營養(yǎng)成分、溫度、PH、溶氧濃 度DO、特別是基質(zhì)濃度的影響，如何控制營養(yǎng)物質(zhì)的流加速率，使得發(fā)酵罐中營養(yǎng)物質(zhì)剛好 滿足微生物的需要。在畢赤酵母高密度培養(yǎng)時，目前大多數(shù)采用的是irwitrogen公司提供的FM21基 礎(chǔ)鹽配成含4%甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基，較少用葡萄糖，因為葡萄糖是AOX啟動子的強(qiáng)阻遏性碳 源，其阻遏作用強(qiáng)于甘油。但是葡萄糖是發(fā)酵領(lǐng)域常用的一種培養(yǎng)碳源，其價格和甘油相比 具有很強(qiáng)的競爭優(yōu)勢。因此用相對廉價的葡萄糖替代甘油作為生長碳源成為工業(yè)生產(chǎn)上的 一種理想選擇。因此要實現(xiàn)畢赤酵母細(xì)胞在葡萄糖環(huán)境下的最優(yōu)生長，葡萄糖的初始濃度 以及如何控制葡萄糖的補(bǔ)料速率是關(guān)鍵點。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種重組畢赤酵母植酸酶高密度工業(yè)發(fā)酵方法，從而 可以通過高密度發(fā)酵，高效表達(dá)生產(chǎn)植酸酶。根據(jù)本發(fā)明的重組畢赤酵母植酸酶高密度工業(yè)發(fā)酵方法，包括以下步驟
1)將發(fā)酵工作種子液接種于發(fā)酵罐；2)葡萄糖補(bǔ)料流加階段在0-6小時內(nèi)，以40mL/h的速度流加葡萄糖，6_9小時，以80mL/h流加葡萄糖， 9-12小時，以140mL/h流加葡萄糖，12-14小時，以220mL/h流加葡萄糖，14-16小時，以 320mL/h流加葡萄糖，16-17小時，以500mL/h流加葡萄糖，17小時-補(bǔ)糖結(jié)束，以600mL/h 流加，菌體濕重達(dá)到180g/L后停止補(bǔ)糖，其中所述葡萄糖的濃度為50%、含PTM1UmL/!；3)饑餓階段停止補(bǔ)加葡萄糖后，不補(bǔ)加任何碳源，饑餓10-15分鐘，觀察DO和pH值，當(dāng)DO開 始上升，PH也開始上升時，進(jìn)入誘導(dǎo)階段；4)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶階段以3. OmL/h速度流加甲醇2小時，3. 4mL/h速度流加甲醇2小時，3. 8mL/h速度流 加甲醇2小時，4. 2mL/h速度流加甲醇2小時，4. 6mL/h速度流加甲醇12小時，5. 6mL/h速度 流加甲醇24小時，6. 6mL/h速度流加甲醇24小時，7. 6mL/h速度流加甲醇24小時，8. 6mL/h 速度流加甲醇24小時，9. OmL/h速度流加甲醇24小時，8. 6mL/h速度流加甲醇24小時，其 中，所述甲醇含PTM1UmL/!^因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，包括三個階段葡萄糖補(bǔ)料流加階段、饑餓階段和外源 基因誘導(dǎo)表達(dá)階段。葡萄糖補(bǔ)料流加階段，菌體從接種開始按照一定速率向培養(yǎng)基流加 50%含PTM1UmVL的葡萄糖補(bǔ)料液，菌體利用碳源生長，隨著菌體生長，根據(jù)菌體生長速度 調(diào)整葡萄糖的流加速度，控制培養(yǎng)基中糖的濃度始終在0.5%以下，當(dāng)菌體濕重達(dá)到180g/ L左右后停止補(bǔ)糖。停止補(bǔ)糖后，因殘留的葡萄糖或者代謝中間產(chǎn)物乙醇會影響下一步的誘 導(dǎo)表達(dá)，維持饑餓狀態(tài)15-30分鐘，觀測DO(溶氧)值上升至接近100%，pH值有上升的趨 勢時，開始補(bǔ)加含12ml/L PTM的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體以甲醇為碳源誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶，甲醇濃 度必須得到控制，甲醇濃度過高會對畢赤酵母產(chǎn)生毒害作用，濃度過低，則起不到有效的誘 導(dǎo)效果，在誘導(dǎo)開始后，由于菌體不能馬上適應(yīng)環(huán)境的改變，甲醇無法得到充分利用，所以 前期甲醇流量不能太高，以3. OmL/h速度流加甲醇(含PTM1UmLA^小時，隨著菌體逐步 適應(yīng)甲醇環(huán)境，再慢慢增加甲醇流量。本發(fā)明的優(yōu)點是根據(jù)菌體生長規(guī)律，結(jié)合DO-stat和底物濃度反饋補(bǔ)料方法，不 需要使用昂貴的葡萄糖電極，從接種后就根據(jù)菌體生長速度和濃度，調(diào)整50 %的葡萄糖溶 液補(bǔ)料速度，從而實現(xiàn)高密度發(fā)酵，再通過調(diào)整甲醇的補(bǔ)料速度，實現(xiàn)植酸酶的高效表達(dá)。
具體實施例方式以下為本發(fā)明的實施例，實施例中的重組畢赤酵母，基因型為Mut+。以上實驗所用的各種培養(yǎng)基配方參見表權(quán)利要求
1. 一種重組畢赤酵母植酸酶高密度工業(yè)發(fā)酵方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)將發(fā)酵工作種子液接種于發(fā)酵罐；2)葡萄糖補(bǔ)料流加階段在0-6小時內(nèi)，以40mL/h的速度流加葡萄糖，6-9小時，以80mL/h流加葡萄糖，9_12小 時，以140mL/h流加葡萄糖，12-14小時，以220mL/h流加葡萄糖，14-16小時，以320mL/h流 加葡萄糖，16-17小時，以500mL/h流加葡萄糖，17小時-補(bǔ)糖結(jié)束，以600mL/h流加，菌體 濕重達(dá)到180g/L，其中所述葡萄糖的濃度為50%、含PTM1UmL/!；3)饑餓階段停止補(bǔ)加葡萄糖后，不補(bǔ)加任何碳源，饑餓10-15分鐘，觀察DO和pH值，當(dāng)DO開始上 升，PH也開始上升時，進(jìn)入誘導(dǎo)階段；4)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶階段以3. OmL/h速度流加甲醇2小時，3. 4mL/h速度流加甲醇2小時，3. 8mL/h速度流加甲 醇2小時，4. 2mL/h速度流加甲醇2小時，4. 6mL/h速度流加甲醇12小時，5. 6mL/h速度流加 甲醇24小時，6. 6mL/h速度流加甲醇24小時，7. 6mL/h速度流加甲醇24小時，8. 6mL/h速度 流加甲醇24小時，9. OmL/h速度流加甲醇24小時，8. 6mL/h速度流加甲醇24小時，其中，所 述甲醇含PTM1^mIVLtj
全文摘要
本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，具體地涉及一種重組畢赤酵母植酸酶高密度工業(yè)發(fā)酵方法。根據(jù)本發(fā)明的重組畢赤酵母植酸酶高密度工業(yè)發(fā)酵方法，包括以下步驟1)將發(fā)酵工作種子液接種于發(fā)酵罐；2)葡萄糖補(bǔ)料流加階段；3)饑餓階段；4)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)植酸酶階段。本發(fā)明的優(yōu)點是根據(jù)菌體生長規(guī)律，結(jié)合DO-stat和底物濃度反饋補(bǔ)料方法，不需要使用昂貴的葡萄糖電極，從接種后就根據(jù)菌體生長速度和濃度，調(diào)整50％的葡萄糖溶液補(bǔ)料速度，從而實現(xiàn)高密度發(fā)酵，再通過調(diào)整甲醇的補(bǔ)料速度，實現(xiàn)植酸酶的高效表達(dá)。
文檔編號C12N9/16GK102115735SQ20101054406
公開日2011年7月6日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者劉金山, 史寶軍, 胡愛紅 申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司