專利名稱：一種中度嗜鹽的無機解磷功能菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物。
背景技術(shù)：
濱海鹽土是我國重要土地資源的一部分。我國有長約3000km的海岸線，估計在 15米等深線內(nèi)的淺海與灘涂有2. 1億畝，其中長江口以北的江蘇、山東、河北、遼寧諸省濱 海鹽土面積就達1500萬畝，灘涂面積則難估計。另外，由于氣候等原因，這些數(shù)字每年還在 增加，比如僅十幾年來，黃河河口年平均推進速度為2. 77km，年平均造陸面積為46. 33平方 公里，即年增6. 95萬畝土地。與此相對，從1998年到2007年，我國耕地面積從19. 45億畝 下降至18. 26億畝，隨著人口的不斷增長，人口對土地的壓力將進一步增大。開發(fā)和利用沿 海灘涂等鹽土對于我們緩解人口對耕地的壓力提供了一個可行的方向，也是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn) 中十分迫切和重要的任務(wù)。濱海鹽土的特征是整個土體鹽分含量高，鹽分組成以氯化物為 主，且PH高，可溶性磷酸鹽含量低，絕大部分以難溶性磷酸鹽的形式存在。而在濱海鹽土的 改造利用中，雖然耐鹽作物可以被引入和培養(yǎng)生長，但由于濱海鹽土的高含鹽量、高PH值、 有效N/P和有機質(zhì)含量低等特性嚴(yán)重影響作物生長和種子萌發(fā)率，最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量低， 生態(tài)改造效果不明顯，經(jīng)濟效益不顯著。目前提高土壤中磷的有效性促進植物高產(chǎn)的技術(shù) 主要是施加磷肥，但實踐表明施入土壤中的磷有75-90%很快與土壤中的鈣等結(jié)合，形成難 溶性的磷酸鹽，積累在土壤中，致使磷肥的利用率較低，而化肥的過度投入又會加重土地板 結(jié)，對濱海系統(tǒng)造成面源污染，影響整個系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。事實上，大部分濱海鹽土缺磷是“遺傳學(xué)缺磷”而非“土壤學(xué)缺磷”，其中潛在的磷 庫含量很大，但提供作物生長發(fā)育的磷流卻很小。如何挖掘濱海鹽土潛在磷庫資源，發(fā)展 生態(tài)型農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，是國家區(qū)域農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)的重點和難點，近十年來在這方面的研究受到 國家有關(guān)部門和農(nóng)業(yè)科技界的高度重視。研究表明，土壤磷素循環(huán)是以微生物活動為中心 的，微生物的活動對磷的轉(zhuǎn)化和有效性影響很大在微生物的生命活動將產(chǎn)生有機酸(如 檸檬酸、乳酸、蘋果酸等)，這些有機酸通過螯合土壤中的鈣和降低PH使土壤中的磷酸鈣不 穩(wěn)定，釋放出磷，這種解磷作用最終能夠?qū)⑼寥乐须y溶性的磷酸鹽轉(zhuǎn)化為水溶性有效磷，從 而改善作物磷素營養(yǎng)狀況，促進作物的生長，因此開展高效溶磷微生物的研究并加大該類 微生物肥料的應(yīng)用，對濱海鹽土農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展有重要的理論意義和實際意義。但在我國濱 海鹽土農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，微生物肥料使用率不到20% (發(fā)達國家達到50%)，究其原因主要是菌 種問題。目前市面上磷細菌肥料中的磷細菌多來源于陸源環(huán)境，雖然在普通土壤環(huán)境中解 磷效果好，但不適應(yīng)濱海鹽土的環(huán)境條件，在濱海鹽土中施用時，菌種存活繁殖力低，存活 時間短，解磷效果不穩(wěn)定。在這樣的情況下，本發(fā)明提供的菌種可以很好的在較廣的PH值 和NaCl范圍內(nèi)適應(yīng)生長，并能明顯降低培養(yǎng)環(huán)境的PH值，增加有效磷的含量，這使本發(fā)明 將會有很好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在 于針對目前濱海鹽土農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中缺乏有效磷細菌的問題，而提 供一種能在高鹽、高PH值條件下活躍生長繁殖的無機解磷菌。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的本發(fā)明通過以不同的鹽度和無機磷培養(yǎng)基為富集條件，從我國黃海近海沉積 物中取樣，分離篩選得到多株菌，經(jīng)過多級篩選，獲得一株中度嗜鹽的無機解磷功能菌 YH8 (Kushneria sp.)。該菌已經(jīng)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC No. 4212，保藏日期為2010年9月30號。中度嗜鹽的無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)通過16S rDNA基因序列比對分析與其最相近的種屬是Kushneria屬的Kushneria aurantia (Genbank AM941746)，同源性為95%，因此該菌為被命名為Kushneria sp.，屬于 Kushneria屬，為好養(yǎng)菌，革蘭氏陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性；在MA培養(yǎng)基(Difco，貨號 212185)上形成淡黃色菌落，菌落為圓形；其DNA基因組的G+C含量是60. Imol % ；其16S rDNA的Genbank登陸號為HQ284161。該菌NaCl生長耐受范圍為0.5-15% (w/v)；該菌能在 PH值為4-9的環(huán)境中生長。本發(fā)明從斜面挑取中度嗜鹽的無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)菌落接種于裝有100ml A液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為105cfu/ml ；28°C、 150rpm/m震蕩培養(yǎng)10天后，將菌液8000rpm/m離心lOmin，取上清夜，利用鉬藍比色法測 定上清夜的有效磷含量，有效磷含量超過280mg/l ；對上清夜進行pH值測定，pH值為5 ； 所述的 A 培養(yǎng)基為葡萄糖 10g, (NH4)2SO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 3g，KCl 0. 3g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 036g, MnSO4 · 7H20 0. 03g, Ca3(PO4)2 12. Og, NaCl 30g，去離子水 1000ml, pH 值 7. 8，在 115°C 滅菌 30min。本發(fā)明的優(yōu)點在于中度嗜鹽的無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)，有較廣的 PH值(4-9)和NaCl (0. 5-15% ) (w/v)生長適應(yīng)范圍，在生長繁殖中能明顯降低培養(yǎng)環(huán)境的 PH值，增加培養(yǎng)環(huán)境有效磷含量。


圖1為本發(fā)明所述菌株在無機磷細菌固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈
具體實施例方式實施例1菌株的篩選純化與保藏樣品采集采樣地點為中國黃海近海(36. 50N，123. 82E)沉積物，樣品采集后，裝 入滅菌的封口聚乙烯袋中，置于冰盒內(nèi)帶回實驗室，-20°C保存。菌株篩選純化將上述采集的樣品，取Ig移入IOOml滅菌海水中震蕩均勻，稀釋成 不同的梯度10_3、10_4和10_5，從中取出ιοομ 1以涂布法接種于高鹽的無機磷細菌固體培養(yǎng) 基中，每個梯度三個重復(fù)，28°c，72h培養(yǎng)后挑選產(chǎn)生透明圈的陽性菌落進一步篩選和純化 驗證。在純化驗證過程中，培養(yǎng)條件為28°C培養(yǎng)7天，選取能穩(wěn)定產(chǎn)生較大透明圈的菌株進 一步純化驗證，經(jīng)過五次篩選，獲得了無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)(見圖1)。所述無機磷細菌固體培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 3g, KCl 0. 3g, FeSO4 · 7H20 0. 036g, MnSO4 · 7H20 0. 03g, Ca3(PO4)2 12. Og, NaCl 30g，瓊脂20g，去離子水1000ml, pH值7. 8，在115°C滅菌30min倒平板，冷卻后備用。本實施例分離得到的無機解磷功能菌YH8YH8 (Kushneria sp.)，屬于Kushneria 屬。為好養(yǎng)菌，革蘭氏陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性；在MA 2216培養(yǎng)基(Difco，貨 號212185)上培養(yǎng)2天后形成淡黃色菌落，菌落為圓形；其DNA基因組的G+C含量是 60. Imol % ；其 16SrDNA 的 Genbank 登陸號為 HQ284161。 菌株保藏該菌已經(jīng)于2010年9月30號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生 物研究所，保藏號為CGMCC No. 4212。在實驗室中，該菌株長期保藏方式為將菌株加入含 30%甘油的MB 2216培養(yǎng)基(Difco，貨號279110)培養(yǎng)基中，在_80°C保存；短期保藏方式 為將菌株接種在MA 2216培養(yǎng)基斜面上，在4°C保存?zhèn)溆?。實施?無機解磷功能菌YH8鹽度及PH值生長耐受性試驗一、鹽度生長耐受性試驗鹽度梯度培養(yǎng)基配置以無鹽LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中補充NaCl得到鹽度 分別為 0,0. 5，1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,8. 0，10. 0，12. 0，15. 0,20. 0,25. 0 及 30. 0 % (w/ ν)的一系列鹽度梯度培養(yǎng)基，pH值7. 8，在115°C滅菌30min后冷卻備用。所述無鹽LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨1(^，酵母膏58，蒸餾水10001111，？!1值7.4-7.8將無機解磷功能菌YH8以105CfU/ml濃度接種于鹽度梯度培養(yǎng)基，每個梯度設(shè)三 個重復(fù)，接種后在28°C條件下振蕩培養(yǎng)10d，記錄菌株生長情況，菌株YH8在NaCl濃度為 0. 5，1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,8. 0，10. 0，12. 0，15. 0% (w/v)的培養(yǎng)條件下可以生長。二、pH值生長耐受性試驗pH值梯度培養(yǎng)基配置以MB 2216培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中加5M NaOH或2M HCl溶液調(diào)整其pH值得到pH值分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的一系列鹽度 梯度培養(yǎng)基，在115°C滅菌30min后冷卻備用將無機解磷功能菌YH8以105CfU/ml濃度接種于pH值梯度培養(yǎng)基，每個梯度設(shè)三 個重復(fù)，接種后在28°C條件下振蕩培養(yǎng)10d，記錄菌株生長情況，菌株YH8在pH值為4. 0， 5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的培養(yǎng)條件下可以生長。實驗結(jié)果表明無機解磷功能菌YH8有較廣的pH值和NaCl生長適應(yīng)范圍，該菌 NaCl生長耐受范圍為0.5-15% (w/v)；該菌能在pH值為4_9的環(huán)境中生長。實施例3無機解磷功能菌YH8解磷能力測定一、制備無機解磷功能菌YH8解磷發(fā)酵液本實施案例分實驗組和空白對照組。實驗組將無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)以105cfu/ml濃度接種于裝有 IOOml無機磷細菌解磷液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，設(shè)三個重復(fù)，28°C、150rpm/m震蕩培 養(yǎng)10天得到解磷發(fā)酵液。用奧立龍M0DEL818型PH計測定發(fā)酵液PH值?？瞻讓φ战M對照中不接種無機解磷功能菌YH8。無機磷細菌解磷液體培養(yǎng)基配置葡萄糖10g，(NH4) 2S04 0. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 3g， KC10. 3g, FeSO4 · 7H20 0. 036g, MnSO4 · 7H20 0. 03g, Ca3(PO4)2 12. Og, NaCl 30g，去離子水 1000ml, pH值7. 8，在115°C滅菌30min冷卻后備用。二、有效磷測定
有效磷測定采 用鉬藍比色法測定1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、l、2、3、5mL，用蒸餾水稀釋到10ml，然后加 入200uL的抗壞血酸溶液混勻后放置15min，加入200uL的混合溶液混勻，20min后測定 0D800nm 值。2)解磷發(fā)酵液有效磷測定將上述解磷發(fā)酵液8000rpm/m離心lOmin，取上清夜 20uL稀釋到10ml，然后加入200uL的抗壞血酸溶液混勻后放置15min，加入200uL的混合溶 液混勻，20min后測定0D800nm值。標(biāo)準(zhǔn)溶液配IOOmmol/L的KH2PO4母液，使用液濃度為1 OOumol/L。抗壞血酸溶液10克溶于IOOmL水中?；旌先芤?2. 5mL鉬酸銨溶液加2. 5mL酒石酸銻鉀，然后用6mol/L的硫酸定容至 100ml。鉬酸銨溶液10克溶于IOOmL水中。酒石酸銻鉀6克溶于200mL水中。測定結(jié)果表明，實驗組發(fā)酵液pH從初始7. 8下降到5. 0，有效磷含量超過280mg/ 1 ；空白對照組中PH維持7. 8，有效磷含量為lmg/1。
權(quán)利要求
1.一種中度嗜鹽的無機解磷功能菌，其特征在于中度嗜鹽的無機解磷功能菌 YH8 (Kushneria sp.)屬于Kushneria屬，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，保藏號為CGMCC No. 4212，保藏日期為2010年9月30號。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種中度嗜鹽的無機解磷功能菌，其特征在于中度嗜鹽的 無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陰性，接觸酶陽性；在MA 培養(yǎng)基(Difco，貨號212185)上形成淡黃色菌落，菌落為圓形；其DNA基因組的G+C含量是 60. Imol % ο
3.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種中度嗜鹽的無機解磷功能菌，其特征在于中度嗜鹽的 無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp. )NaCl生長耐受范圍為0. 5-15% (w/v)。
4.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種中度嗜鹽的無機解磷功能菌，其特征在于中度嗜鹽的 無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)能在pH值為4_9的環(huán)境中生長。
5.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種中度嗜鹽的無機解磷功能菌，其特征在于從斜面 挑取中度嗜鹽的無機解磷功能菌YH8 (Kushneria sp.)菌落接種于裝有100ml A液體培 養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為105Cfu/ml ；觀°C、150rpm/m震蕩培養(yǎng)10天后，將菌液 8000rpm/m離心lOmin，取上清夜，利用鉬藍比色法測定上清夜的有效磷含量，有效磷含量 超過^Omg/l ；對上清夜進行pH值測定，pH值為5 ；所述的 A 培養(yǎng)基為葡萄糖 10g, (NH4)2SO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 3g，KCl 0. 3g， FeSO4 · 7Η200· 036g, MnSO4 · 7H20 0. 03g, Ca3 (PO4) 2 12. Og, NaCl 30g，去離子水 1000ml, pH 值 7. 8，在 115°C滅菌 30min。
全文摘要
本發(fā)明涉及保藏號為CGMCC No.4212的一種中度嗜鹽的無機解磷功能菌YH8，本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。目前我國濱海鹽土種植中缺乏有效的無機解磷菌。本發(fā)明涉及的菌株分離自海底沉積物，其能在pH值為4-9、NaCl濃度為0.5-15％(w/v)的環(huán)境中生長。本發(fā)明涉及的菌株具有溶解磷酸鈣的能力，實驗室培養(yǎng)結(jié)果表明該細菌能使初始pH值為7.8，可溶性磷濃度為0的含磷酸鈣的培養(yǎng)基中最終可溶性磷濃度達到280mg/l，pH值降至5。本發(fā)明提供的無機解磷菌菌株YH8由于有較廣的pH值和NaCl生長適應(yīng)范圍，可適應(yīng)濱海鹽土生存環(huán)境，并能明顯降低培養(yǎng)環(huán)境的pH值，這使本發(fā)明十分有意義。
文檔編號C12N1/20GK102051340SQ201010546338
公開日2011年5月11日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者孫修勤, 張進興, 曲凌云, 朱鳳玲, 洪旭光 申請人:國家海洋局第一海洋研究所