專利名稱：一種從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從褐環(huán)粘蓋牛肝菌[Suillus luteus]中提取藥用活性物質(zhì)的方 法，以及提取物在抗氧化、抗腫瘤保健產(chǎn)品、藥品開發(fā)中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥制備技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
可食用大型真菌具有食用、藥用雙重功效，除含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)外，還含多糖、小 分子次生代謝物等多種生理活性成分，具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌等 生理功效。大型真菌屬于“創(chuàng)造系數(shù)”很高的生物資源，它所含的次生代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)多 樣且新穎，這種化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性對于現(xiàn)代保健品、藥物和農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要， 近年來受到研究者廣泛關(guān)注。目前對大型真菌天然活性物質(zhì)的研究與開發(fā)主要集中在多糖 領(lǐng)域，市場上以食藥用菌多糖為原料的保健產(chǎn)品很多，其中，靈芝多糖、香菇多糖、茯苓多糖 和裂褶菌多糖等注射液做為癌癥患者治療的輔助藥物，已在臨床上得到正式應(yīng)用。國內(nèi)外 對大型真菌中小分子活性物質(zhì)的研究多采用單一有機(jī)溶劑萃取，常用的有乙醇、甲醇、乙酸 乙酯等，然后以獲得的粗提物為材料，進(jìn)行功效研究。由于小分子種類及結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，單 一有機(jī)溶劑獲得的萃取物并不能全面反映小分子活性物質(zhì)的種類。牛肝菌在大型真菌中是 一個較大的家族，種類繁多，其中有著名的食用菌美味牛肝菌，也有一些有毒的種類。褐環(huán) 粘蓋牛肝菌(Suillus luteus)，中文別名土色牛肝菌、褐環(huán)乳牛肝菌，是一種可食用牛肝 菌，也是我國野生食用菌出口的主要品種之一。目前國內(nèi)已有對其人工馴化栽培的研究。資料記載此菌含有膽堿(choline)及腐胺 (putrescine)等生物堿；對小鼠肉瘤180和艾氏癌的抑制率為90%和80%。該菌與落葉 松、喬松、云南松、高山松等形成外生菌根。Le0n F.等(2008)分析了該菌子實(shí)體的乙醇提 取物，從中分離純化到11種小分子化合物。國內(nèi)未見對該菌的研究報道，只有以黃白粘蓋 牛肝菌(Suillus placidus)為材料的《粘蓋牛肝菌素的制備方法及應(yīng)用》專利(申請?zhí)?200610053593.3)。因此，對褐 環(huán)粘蓋牛肝菌進(jìn)行深入研究，尋找從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的簡單方法，進(jìn) 而開展活性提取物質(zhì)的應(yīng)用，對開發(fā)利用真菌資源具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法。本發(fā)明的目的還在于提供上述方法獲得的提取物在抗氧化、抗腫瘤保健產(chǎn)品及藥 物中的應(yīng)用。本發(fā)明采取的技術(shù)構(gòu)思如下在化學(xué)、生物化合物分離制備技術(shù)領(lǐng)域，液_固萃取 法是利用溶劑對固體混合物中所需成分的溶解度大，對雜質(zhì)的溶解度小的原理，把固體物 質(zhì)放于溶劑中長期浸泡而達(dá)到萃取的目的。本發(fā)明提供的方法是采用極性不同的三種有機(jī) 溶劑，即非極性的石油醚、中極性的乙酸乙酯、極性的乙醇，分步萃取褐環(huán)粘蓋牛肝菌的子實(shí)體，獲得極性不同的萃取物，即藥用活性物質(zhì)。分析不同極性萃取物的抗氧化、抗腫瘤效 果。然后，采用層析法，分離、純化抗氧化、抗腫瘤單一組分，為抗氧化、抗腫瘤保健產(chǎn)品或藥 品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。層析法是利用不同的物質(zhì)在固定相與流動相中不同的平衡分配系 數(shù)來進(jìn)行分離的一種方法。在層析分離中，試樣混合物在固定相和流動相之間連續(xù)不斷地 進(jìn)行分配平衡，不同的化合物由于它們之間的理化性質(zhì)的差異，在兩相中存在的量也各不 相同因而得到分離。具體的，本發(fā)明所說的從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法一取烘干后的褐環(huán)粘蓋牛肝菌子實(shí)體干粉，與石油醚按質(zhì)量體積比(0. 1 1) 20 (g mL)比例混合后，進(jìn)行以下步驟(A)操作攪拌2h，靜置過夜，濾紙過濾收集上 清液，重復(fù)操作3 5次，合并上清液，將合并后的上清液于40 45°C減壓濃縮，得到褐色 粘稠石油醚提取物；然后用真空干燥箱干燥得石油醚提取物浸膏，稱重，計算產(chǎn)率。將子實(shí)體粉末濾 盡，烘干備用。本發(fā)明還可以采取方法二 將方法一得到的石油醚提取物采用300-400目硅膠 柱，石油醚與乙酸乙酯按體積比為8 1混合液做洗脫液，三次層析后獲得石油醚單一組分 提取物，命名為ns7。經(jīng)質(zhì)譜、核磁分析，確定該單一組的分子式為C28H4tlO4,分子量為440，結(jié) 構(gòu)式(見附

圖1)。該物質(zhì)與粘蓋牛肝菌素(Suillin)為同分異構(gòu)體(見附圖2)。本發(fā)明還可以采取方法三將方法一萃取后的子實(shí)體干粉與乙酸乙酯按質(zhì)量體積 比(0. 1 1) 20(g mL)比例混合后，重復(fù)方法一中的步驟㈧操作攪拌2小時，靜 置過夜，濾紙過濾收集上清液，重復(fù)操作3 5次，合并上清液，將合并后的上清液于40 45°C減壓濃縮，獲得乙酸乙酯提取物浸膏，稱重，計算產(chǎn)率。將子實(shí)體粉末濾盡，烘干備用。本發(fā)明還可以采取方法四將方法三萃取后的子實(shí)體干粉與無水乙醇按質(zhì)量體積 比(0. 1 1) 20(g mL)比例混合后，重復(fù)方法一中的步驟㈧操作攪拌2小時，靜 置過夜，濾紙過濾收集上清液，重復(fù)操作3 5次，合并上清液；將合并后的上清液于40 45°C減壓濃縮，獲得乙醇提取膏狀物，稱重并計算產(chǎn)率。各方法提取物的得率=[每種提取物的質(zhì)量(g)/子實(shí)體干粉的質(zhì)量(g)] X100%各提取方法得到的提取物的得率見表1。表1褐環(huán)粘蓋牛肝菌子實(shí)體四種提取物的得率(％ )
提取物石油醚乙酸乙酯乙醇 石油醚單一組分ns7得率(g/g)3.903.274.23 2.94注石油醚單一組分ns7的得率為100克石油醚提取物中的含量。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明獲得的活性物質(zhì)應(yīng)用的目的，申請人進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究(1)四種提取物的抗氧化活性測定方法采用清除DPPH(1，1- 二苯基-2-三硝基苯胼)自由基能力方法。具體操作如下將褐環(huán)粘蓋牛肝菌四種提取物分別用無水甲醇配置成20mg/mL的母液。隨后，用 無水甲醇稀釋母液，得 0. 5mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL 的樣品溶液，用于清除DPPH自由基的檢測。取2mL不同濃度的樣品溶液于試管中，向其中加入2mL無水乙醇配制的濃度為2X 10_4mOl/L的DPPH自由基溶液，混合均勻后避光反應(yīng)30min，于517nm處測定其吸光值 (A)。同時測定2mL不同濃度樣品溶液與2mL無水乙醇的吸光值；2mL DPPH自由基溶液和 2mL無水甲醇的吸光值。以Vc作陽性對照。每個實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次，按下面公式計算樣品的 DPPH自由基清除率樣品的DPPH 清除率(% ) = [A0-(Ai-Aj)]/A0X 100%其中Atl是2mL DPPH+2mL無水甲醇的吸光值；Ai是2mL DPPH+2mL樣品液的吸光 值；Aj是2mL DPPH+2mL無水乙醇的吸光值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Statistics 6. 0進(jìn)行統(tǒng)計分析，IC50軟件計算提取物的IC5tl值，結(jié) 果見表2。表2褐環(huán)粘蓋牛肝菌四種提取物清除DPPH自由基的IC5tl比較
權(quán)利要求
1.一種從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法，其特征在于取烘干后的褐環(huán) 粘蓋牛肝菌子實(shí)體干粉，與石油醚按質(zhì)量體積比(0. 1 1) 20 (g mL)比例混合后，進(jìn) 行步驟(A)操作攪拌2h，靜置過夜，濾紙過濾收集上清液，重復(fù)操作3 5次，合并上清液； 將合并后的上清液于40 45°C減壓濃縮，得到褐色粘稠石油醚提取物，然后用真空干燥箱 干燥得石油醚提取物，將子實(shí)體粉末濾盡，烘干。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法，其特征在 于將石油醚提取物采用300-400目硅膠柱，以石油醚與乙酸乙酯按體積比為8 1的混合 液做洗脫液，三次洗脫、層析后獲得單一組分提取物，命名為ns7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法，其特征在 于將石油醚萃取后的子實(shí)體干粉與乙酸乙酯按質(zhì)量體積比(0.1 1) 20 (g mL)比例 混合，攪拌2h，靜置過夜，濾紙過濾收集上清液；重復(fù)操作3 5次，合并上清液，將合并后 的上清液于40 45°C減壓濃縮，獲得乙酸乙酯提取物，將子實(shí)體粉末濾盡，烘干。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法，其特征在 于將乙酸乙酯萃取后的子實(shí)體干粉與無水乙醇按質(zhì)量體積比(0.1 1) 20 (g mL)比 例混合，攪拌2h，靜置過夜，濾紙過濾收集上清液，重復(fù)操作3 5次，合并上清液，將合并后 的上清液于40 45°C減壓濃縮，獲得乙醇提取物。
5.如權(quán)利要求1或3或4所述提取方法分別獲得的石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙 醇提取物的應(yīng)用，其特征在于做為抗氧化、抗腫瘤保健產(chǎn)品及抗氧化、抗腫瘤藥物的原料。
6.如權(quán)利要求2所述提取方法獲得的分子量為440的單一組分提取物的應(yīng)用，其特征 在于做為抗氧化、抗腫瘤藥物的前體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從褐環(huán)粘蓋牛肝菌中提取藥用活性物質(zhì)的方法，以及提取物在抗氧化、抗腫瘤中的應(yīng)用。所說的提取方法一將褐環(huán)粘蓋牛肝菌子實(shí)體干粉與石油醚混合、攪拌，收集上清液后減壓濃縮，濃縮物真空干燥得石油醚提取物，將子實(shí)體粉末烘干。將石油醚提取物采用硅膠柱層析，獲得單一組分ns7，分子式C28H40O4，分子量440。還可以將石油醚萃取后的干粉與乙酸乙酯混合，重復(fù)方法一操作，獲得乙酸乙酯提取物浸膏。還可以將乙酸乙酯萃取后的干粉與無水乙醇混合，重復(fù)方法一操作，獲得乙醇提取物。獲得的提取物均具較強(qiáng)的抗氧化、抗腫瘤功效，可做為抗氧化、抗腫瘤保健品及藥物開發(fā)的原料或前體。
文檔編號A23L1/30GK102000120SQ20101054645
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者張晴爽, 李潔, 楊曉燕, 王立安, 秦書亮, 胡兵 申請人:河北師范大學(xué)