專利名稱：蓖麻毒素a鏈突變體的構(gòu)建及作為候選疫苗抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蓖麻毒素A鏈突變體的構(gòu)建及作為候選疫苗抗原，尤其涉及一種 與蓖麻毒素疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和生物毒素的開發(fā)利用，毒素在大規(guī)模殺傷性武器中的 重要性已凸現(xiàn)出來，生物毒素及其生物恐怖的威脅與日俱增。蓖麻毒素是由A、B鏈組成，A 鏈為效應(yīng)鏈，具有RNA N-糖苷酶活性，B鏈為結(jié)合鏈，介導(dǎo)A鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用。 蓖麻毒素小鼠腹腔LD5tl為3. 0 μ g/kg，其毒性至少是有機(jī)磷神經(jīng)毒劑的380倍。我國(guó)為世 界上蓖麻主要生產(chǎn)區(qū)之一，生產(chǎn)原料蓖麻籽來源廣泛，容易獲得，而在許多公開的專業(yè)刊物 和互聯(lián)網(wǎng)上又可輕易得到如何提取制備蓖麻毒素的詳細(xì)資料，所以，蓖麻毒素的恐怖威脅 不容忽視。針對(duì)蓖麻毒素中毒，目前尚無預(yù)防疫苗、特異性抗毒素和解毒藥。通過分析現(xiàn)有 的研究進(jìn)展和成果，美軍的生防專家認(rèn)為，疫苗研究是對(duì)抗其中毒的有效預(yù)防手段。因此， 開展蓖麻毒素疫苗的研究，具有十分重要的軍事和社會(huì)意義。我國(guó)學(xué)者對(duì)蓖麻毒素生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學(xué)防護(hù)等研究領(lǐng)域剛剛起步，針對(duì)蓖麻 毒素的恐怖襲擊尚無配套診斷試劑和有效免疫治療及防護(hù)手段，因此迫切需要建立和發(fā)展 具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)和防護(hù)用品。為了防止敵對(duì)勢(shì)力和恐怖組織使用蓖麻毒素等生物 戰(zhàn)劑的襲擊，應(yīng)盡快建立和完善蓖麻毒素等生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學(xué)防護(hù)系統(tǒng)，保證及時(shí)采 取應(yīng)急措施和對(duì)策，將生物恐怖襲擊造成的破壞降低到最低限度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與蓖麻毒素疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為mRTA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列表中的序列2由267個(gè)氨基酸殘基組成。所述一個(gè)或數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基 的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。mRTA的編碼基因mRTA也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，為如下1) _3)中任一所述的DNA分 子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。上述序列表中的序列1由801個(gè)核苷酸組成，編碼區(qū)為序列1自5’末端第1-801位核苷酸。含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也是本 發(fā)明保護(hù)的范圍。所述重組載體為將所述編碼基因插入載體pET-His的EcoR I和Nhe I識(shí)別位點(diǎn) 間得到的重組載體。所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。擴(kuò)增所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述引物對(duì) 的一條引物為序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列4所示的DNA分子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種疫苗，它的活性成分為如下1)-3)中任一一種 1)所述的蛋白質(zhì)；幻所述的重組載體；幻所述的重組菌。所述蛋白質(zhì)在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述編碼基因在制備疫 苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述重組載體在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的 范圍；所述重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述疫苗為蓖麻毒素疫苗，具體為蓖麻毒素A鏈突變體疫苗。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)過點(diǎn)突變獲得的突變體mRTA，是通過重組表達(dá)得到的蓖麻 毒素A鏈突變體蛋白，通過A鏈突變體免疫原的免疫途徑、劑量、次數(shù)、佐劑等多種不同免 疫方案，分析蓖麻毒素A鏈突變體的免疫保護(hù)效果，結(jié)果為該突變體具有低毒性、無血管滲 漏、有良好免疫原性等特點(diǎn)，可以作為候選疫苗抗原。


圖1為蓖麻毒素A鏈突變體純化2為蓖麻毒素A鏈突變體的SDS-PAGE電泳3為BCA法測(cè)定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖4為蓖麻毒素A鏈突變體對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的殺傷作用曲線圖5為mRTA體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)體重變化圖6為mRTA體外中和實(shí)驗(yàn)體重變化
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、突變體mRTA的獲得1、突變體mRTA的獲得根據(jù)已有的蓖麻毒素的A鏈(rRTA)基因序列，其核苷酸序列為序列表中的 序列5，氨基酸序列為序列表中的序列6，采用Quickchange Lighting Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene 公司，Catalog#210518)進(jìn)行定點(diǎn)突變獲得突變體 mRTA-D75AV76MY80A (質(zhì)粒)，經(jīng)測(cè)序，mRTA_D75AV76MY80A含有的基因命名為mRTA，其核苷 酸序列為序列表中的序列1，編碼區(qū)為序列表中序列1的自5’末端第1-801位核苷酸序列， mRTA編碼的蛋白mRTA的氨基酸序列為序列表中的序列2所示的序列。應(yīng)用Lasergene軟 件預(yù)測(cè)所構(gòu)建的突變體的抗原性未發(fā)生明顯變化。
測(cè)序驗(yàn)證突變結(jié)果，具體如下將序列5的第2M位的堿基A突變?yōu)樾蛄?第2M位的堿基C，序列5的第2 位 的堿基G突變?yōu)樾蛄?第2 位的堿基A，序列5的第2 位的堿基C突變?yōu)樾蛄?第2 位的堿基G，序列5的第238位的堿基T突變?yōu)樾蛄?第238位的堿基G，序列5的第239 位的堿基A突變?yōu)樾蛄?第239位的堿基C。將序列6的第75位的氨基酸天冬氨酸⑶突變?yōu)樾蛄?的第75位氨基酸丙氨酸 (A)，序列6第76位的氨基酸纈氨酸(V)突變?yōu)樾蛄?的第76位的氨基酸蛋氨酸(M)，序列 6第80位的氨基酸絡(luò)氨酸(Y)突變?yōu)樾蛄?的第80位的氨基酸丙氨酸(A)。設(shè)計(jì)引物1 :RTA Upper :5，~CGCGAATTCGATAACAACATATTCC~3’ (EcoR I)(序列 3)2 :RTA Lower :5，~CTATTGCTAGCGAACTGTGACGATG~3’ (Nhe I)(序列 4)以上述獲得的突變體質(zhì)粒mRTA-D75AV76MY80A作為模板，用引物RTA Upper和 RTALower進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物連接至克隆載體pMDIS-T (寶生物工程(大連)有限 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)D101B)得到pMD18T-mRTA(也可人工合成序列1，連接到pMD18_T得到 pMD18T-mRTA。)，再用 EcoR I (NEB 公司，R0101V)和 Nhe I (NEB 公司，R0131V)雙酶切 pMD18T-mRTA后回收小片段，與經(jīng)過同樣酶切的表達(dá)載體pET-His (孫嗣梅，王景林等.重 組蓖麻毒素A鏈蛋白的可溶性表達(dá)、純化與抗原性分析.中國(guó)生物工程雜志.2005，25 ) 47-51.公眾可從中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得。)的載體片 段連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)(北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品 目錄號(hào)Dlll(^S)，經(jīng)篩選后的陽性菌，提取質(zhì)粒后測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列 1插入表達(dá)載體pET-His的EcoR I和Nhe I的識(shí)別位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，將該質(zhì)粒命名為 pET-His-mRTA，將其對(duì)應(yīng)的陽性菌命名為 BL21 (DE3)/pET-His-mCTA。2.純化 mRTA將上述獲得的BL21 (DE3) /pET-His-mRTA按1 100的比例接種于5ml含 AmpdOOy g/ml)的 NZCYM 培養(yǎng)基(配方每 IL 培養(yǎng)基含Yeast Extract 5g, Casamino Acid lg, NZ 胺 IOg, NaCl 5g, MgSO4 · 7H20 2g, pH 值 7. 0)，37°C，200rpm 培養(yǎng)至 A600 = 0. 6 時(shí)，再按1 100的比例轉(zhuǎn)接至500ml同樣的NZCYM培養(yǎng)基(并設(shè)陰性對(duì)照)，同上條件振 蕩培養(yǎng)至A6tltl = 0. 6時(shí)，誘導(dǎo)組加IPTG至終濃度0. 5mM并補(bǔ)加Amp，然后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，誘 導(dǎo)條件改為18°C，150rpm誘導(dǎo)1 后，lOOOOrpm，4°C離心15min收集表達(dá)菌株的菌體，將全 菌沉淀用PBS洗滌三次，再以裂解緩沖液(0. 02M PB,500mM NaCl，50mM咪唑，pH7. 4)重懸 超聲破碎后，10000rpm，4°C離心lOmin，收集上清液和沉淀，上清液直接加2XSDS-PAGE凝 膠上樣緩沖液(H20、甘油、1.5mM pH6.8TriS、10%溴酚藍(lán)、β -巰基乙醇)，而沉淀用8M的 尿素溶解后加2X SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液，最后均在100°C煮沸5min，并短暫離心。吸取 20 μ 1樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。經(jīng)15% SDS-PAGE電泳分析，蓖麻毒素A鏈突變體(mRTA)在上清液有特異性的蛋 白表達(dá)，蛋白相對(duì)分子量約為32kDa，與預(yù)期的蛋白大小相符。將上述獲得的上清液進(jìn)行親和層析，層析柱為Ni Sepharose High performance 親和層析柱(GE Healthcare, 17_5M8_01)，洗脫液為含500mM咪唑洗脫液(由PB、NaCl、咪 唑和水組成，其中PB在洗脫液的終濃度為0. 02M、NaCl在洗脫液的終濃度為500mM、咪唑在洗脫液的終濃度為500mM，PH為7. 4)，洗脫流速為2ml/min，當(dāng)咪唑濃度為300mM時(shí)，收集洗 脫峰即為純化的mRTA，結(jié)果如圖1所示。將收集的純化的mRTA經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2，其中M為低分子量蛋白 marker, 1-4均為經(jīng)鎳柱純化后mRTA，可以看出，蛋白相對(duì)分子量約為32kDa，蛋白的純度高 于 98%。采用同樣的方法將空載體pET-His轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)得到重組菌 BL21 (DE3)/pET-His,誘導(dǎo)表達(dá)得到的蛋白作為對(duì)照蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證沒有目的 蛋白表達(dá)。采用同樣的方法將序列5所示的DNA分子導(dǎo)入載體pET-His中，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 (DE3)得到重組菌BL21 (DE!3)/pET-His-rRTA，誘導(dǎo)表達(dá)得到的蛋白為rRTA (重組蓖麻 毒素A鏈蛋白(未突變))。實(shí)施例2、突變體mRTA的生物活性檢測(cè)1.突變體蛋白的定量采用BCA法蛋白定量試劑盒(購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司，Lot#20120613) 對(duì)實(shí)施例1得到的純化的mRTA進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。具體步驟試劑盒組成蛋白標(biāo)準(zhǔn)(5mg/mlBSA)、SolutionA、Solution B。(1)使用時(shí)將Solution A搖晃混勻，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積Solution A加1體 積Solution B (50 1)配制適量BCA工作液，充分混勻。(2)完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/mlBSA)，用PBS將其稀釋至1. 5mg/ml, 1. 0mg/ml, 0. 8mg/ml，0. 4mg/ml，0. 2mg/ml 作為標(biāo)準(zhǔn)品。(3)將上述各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品分別加到96孔板中。(4)各孔加入200ulBCA工作液，輕輕用加樣槍吹打混勻，37°C放置30-60分鐘。(5)冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A562。(6)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的蛋白濃度。結(jié)果如圖3所示，純化的mRTA的濃度為1. 83mg/ml (經(jīng)Ni親和層析柱純化以后得 到的目的蛋白)，500ml菌液所得蛋白量為27. 4mgo2、蓖麻毒素A鏈突變體(mRTA)抗原性分析將由實(shí)施例1獲得的純化的mRTA進(jìn)行^festern印跡分析將mRTA經(jīng)SDS-PAGE電 泳后轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素薄膜上，以抗天然Ricin兔多克隆抗體(制備方法見后述)為一抗， 以辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國(guó)Santa Cruz公司，觀-2301)為二抗，以實(shí)施例1獲得的 對(duì)照蛋白為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示在32KDa附近有特異顯色帶出現(xiàn)，說明所得到的重組突變體蛋白能被抗 天然Ricin兔多克隆抗體所識(shí)別，具有良好的抗原性。將由實(shí)施例1獲得的純化的mRTA用包被液進(jìn)行系列稀釋，然后進(jìn)行包被，IOOul/ 孔，以抗天然Ricin兔多克隆抗體為一抗，以辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行ELISA 檢測(cè)。以天然ricin為陽性對(duì)照，實(shí)施例1獲得的對(duì)照蛋白為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié) 果取平均值。結(jié)果與陽性對(duì)照(純化的天然ricin)相比，2ug/ml以上濃度mRTA包被孔均為強(qiáng)陽性，說明突變體蛋白mRTA能與抗天然Ricin兔多克隆抗體發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)， 進(jìn)一步驗(yàn)證了所獲得突變體的正確性。陰性對(duì)照沒有發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)。天然Ricin，其核苷酸及氨基酸的genbank號(hào)為X03179，也可以通過如下方法獲 得蓖麻籽(蓖麻子，Ricinuscommunis，購自北京秀禾種子公司)勻漿、抽濾、浸提、飽和硫 酸銨沉淀、粗提、親和層析、離子交換層析，得到純化的天然ricin。(參考文獻(xiàn)余濤，唐吉 軍等.一種純化蓖麻毒素的新方法.生物技術(shù).2005. 15(5) 53-55)抗天然Ricin兔多克隆抗體制備方法用含1 %甲醛的磷酸鹽緩沖液對(duì)天然Ricin 減毒處理制備類毒素，以類毒素為免疫抗原分4次免疫新西蘭純種大耳白兔，耳緣靜脈采 血，以天然Ricin為抗原，用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，效價(jià)達(dá)到1 IO6后心臟采血。兔血清經(jīng) 濾膜濾過，加醋酸緩沖液稀釋，在酸性條件下，正辛酸沉淀非IgG蛋白，離心取上清液，在中 性條件下置冰浴中飽和硫酸銨，以體積分?jǐn)?shù)為45%飽和度沉淀IgG蛋白，收集沉淀蛋白，透 析、離心、取上清液，經(jīng)濾膜濾過，按說明書經(jīng)HiTrapTM rProtein A FF親和柱純化抗體。3、突變體蛋白的活性分析通過MTS法測(cè)定純化的mRTA對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721 (北京興奧康生物科技有限 公司，AK169711)的殺傷作用，具體如下(1)將人肝癌細(xì)胞SMMC-7721計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至105/ml，制備IOml細(xì)胞懸液，加 入96孔板，100 μ 1/孔，即細(xì)胞數(shù)為IO4/ ？Lo空白孔不加細(xì)胞懸液。(2) 5% C02 , 37°C條件下培養(yǎng) 24h。(3)每孔加入100 μ 1用含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué) 制品(北京)有限公司，SH30809.01B)10倍系列稀釋的由實(shí)施例1獲得的純化的mRTA。陰 性對(duì)照孔不加毒素。(4)5% CO2, 37 °C 條件下培養(yǎng) 72h。(5)吸除培養(yǎng)液，PBS洗板三遍，加入100 μ 1無血清培養(yǎng)基，20 μ 1 MTS (CellTiter 961 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Sigma 公司，G3580)，37°C條件下 培養(yǎng)3h。(6)微孔板式酶標(biāo)儀上測(cè)定A490值。(7)計(jì)算細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率(％ )=(試驗(yàn)組A490/陰性對(duì)照組A490) X 100%。以實(shí)施例1獲得的rRTA和天然Ricin作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果見圖4 所示，mRTA IC50 約為 IX 10_、，天然 Ricin IC50 約為 IX KT11M, rRTA IC5tl約為4X 10_"M，發(fā)現(xiàn)突變體蛋白(mRTA)較之未突變前其IC5tl明顯升高，說明其毒性明 顯減弱，達(dá)到預(yù)期的突變目的。4、突變體蛋白免疫原性分析(1)免疫接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用BALB/c小鼠，雌性，5-6周齡，體重約18-20克(軍 事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK-(軍)2007-004)，每組用20只小鼠。對(duì)免疫組小鼠進(jìn) 行初次免疫，即將PBS稀釋由實(shí)施例1得到的純化的mRTA(250 μ g/ml，每只小鼠100 μ 1) 與等量鋁佐劑Lnject Alum (Thermo Scientific公司，77161)充分混合后，每只小鼠注射 200 μ 1 (分別采用皮下和肌肉兩種免疫方式)，一周后尾靜脈取血，37°C孵育池后，6000r/ min離心15min留取血清備用。初免兩周后，再進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫，間隔兩周，每次免疫后一周均按前述方法取血留血清進(jìn)行間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)。免疫鼠血清效價(jià)采用間接ELISA法測(cè)定，具體方法如下將定量后的純化的mRTA 用包被液稀釋至5ug/ml，4°C過夜包被酶聯(lián)板；次日倒掉包被液，以洗滌液洗板3次，2min/ 次；然后加封閉液封閉Ih ;lh后再洗板3次，加入免疫鼠血清(一抗，用稀釋液按照1 10， 1 IO2,1 IO3,1 IO4,1 IO5,1 IO6,1 IO7,1 IO8 稀釋)，作用 Ih ； Ih 后先洗板， 再加入辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(二抗，用稀釋液按1 5000稀釋)，作用Ih后；依次加 入顯色液A、B,顯色5min后加終止液QM H2SO4)，在酶聯(lián)儀檢測(cè)0D450。以 PBS 溶液(0. 01mol/L，pH7. 2，每 IL 溶液含 Na2HPO4 ‘ 12H20 2. 86g, NaH2PO4 ·2Η20 0.312g,NaCl 8. 5g)進(jìn)行注射作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。mRTA三免以后血清效價(jià)達(dá)到1 IO6;PBS溶液對(duì)照組三免以后ELISA檢測(cè)為陰性，無特異性抗體產(chǎn)生。(2)免疫小鼠血清的體內(nèi)中和作用改良寇氏法測(cè)定天然Ricin小鼠LD50 :BALB/c小鼠，雌性，20g/只，分為7組，每 組8只，其中一組注射PBS作為陰性對(duì)照，其余各組分別經(jīng)腹腔注射12. 5ng/ml,25ng/ml, 50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml的天然Ricin，觀察7天，記錄各組死亡率分別為0， 0，0，0，25%，62. 5%，100%，應(yīng)用公式 log LD50 = Xm-i ( Σ Ρ_0. 5)，計(jì)算出 LD5。為 3. 9 μ g/ kg。其中Xm 最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)P:各組死亡率i:組間劑量比的對(duì)數(shù)η:每組動(dòng) 物數(shù)。20只ELISA抗體效價(jià)達(dá)1 IO6的免疫后小鼠，分成四組，每組5只，PBS免疫小 鼠為對(duì)照組。1-4組分別注入ILD5tl，4LD50,8LD50, IOLD50的純化的天然Ricin (純化的天然 Rbrin對(duì)小鼠的腹腔注射LD5tl為3. 9 μ g/kg，小鼠的體重按23g/只計(jì)算)，注射體積用 PBS (0. 01mol/L, pH7. 2)稀釋為0. 5ml/只，注射后觀察10天，每天記錄小鼠體重變化和死
亡情況。攻毒后一周尾靜脈取血，采用上述的間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)變化，結(jié)果如下 攻毒后一周，測(cè)定抗體效價(jià)，1-4組血清效價(jià)比攻毒前升高，均由1 IO6達(dá)到1 107。攻毒后10天，記錄小鼠體重，具體結(jié)果如表1和圖5所示表1 mRTA體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)體重變化
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或幻中任一所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一 所述的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表 達(dá)盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所 述編碼基因插入載體pET-His的多克隆位點(diǎn)間得到的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求4或5所述 重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。
7.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)，所述引物對(duì)的一條引 物為序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列4所示的DNA分子。
8.一種疫苗，它的活性成分為如下1)-3)中任一一種1)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)；2) 權(quán)利要求4或5所述的重組載體；幻權(quán)利要求4或6所述的重組菌。
9.權(quán)利要求1中所述蛋白質(zhì)在制備疫苗中的應(yīng)用；權(quán)利要求2或3所述編碼基因在制 備疫苗中的應(yīng)用；權(quán)利要求4或5所述重組載體在制備疫苗中的應(yīng)用；權(quán)利要求4或6所述 重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述疫苗為蓖麻毒素A鏈突變體疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與蓖麻毒素疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為mRTA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白質(zhì)1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)過點(diǎn)突變獲得的突變體mRTA，是通過重組表達(dá)得到的蓖麻毒素A鏈突變體蛋白，經(jīng)過檢測(cè)，其具有低毒性、無血管滲漏、有良好免疫原性等特點(diǎn)，可以作為候選疫苗抗原。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102079780SQ201010552949
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者康琳, 王景林, 韓艷輝, 高姍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所