專利名稱：基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的瘧原蟲(chóng)屬和種的核酸篩查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技 術(shù)的瘧原蟲(chóng)屬和種的核酸篩查方法；含惡性瘧原蟲(chóng)UHasmodiumfalciparimi)、三 日瘧原蟲(chóng)〔Plasmodium malariae)、卵形瘧原蟲(chóng)(Tlasmodium ovale)及間日瘧原蟲(chóng) (.Plasmodium vivax))核酸篩查方法。
背景技術(shù)：
目前瘧原蟲(chóng)屬和種的檢測(cè)方法主要是微生物培養(yǎng)鑒定及多重PCR檢測(cè)技術(shù)。 (1)顯微鏡鏡檢，厚血膜、薄血膜顯微鏡鏡檢仍是瘧原蟲(chóng)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是顯微鏡
鏡檢做為一種檢測(cè)方法又存在一些問(wèn)題。由于瘧原蟲(chóng)形體小，形態(tài)相似，難以染色和檢 出，要有經(jīng)驗(yàn)的人員才能做到正確的診斷；同時(shí)，鏡檢費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大規(guī)模樣品的 檢測(cè)不利于上述瘧原蟲(chóng)的普遍篩查。(2)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，特異性較差，優(yōu)點(diǎn)是 敏感度可達(dá)98% 100%.，但是其需要PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳等相關(guān)貴重設(shè)備，不利于 基層醫(yī)療防疫機(jī)構(gòu)及現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定。21世紀(jì)初，Notomi T等開(kāi)發(fā)了一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增理論,即所謂的環(huán)介 導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法(Loop - Mediated Isothermal Amplification ,LAMP),其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的
8/6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6 /4種特異引物,利用一種鏈置換BstDNA聚合酶在恒溫條件(60°C左右) 保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，短時(shí)間擴(kuò)增效率可達(dá)到IO9 - IO10個(gè)拷貝。直接 靠擴(kuò)增產(chǎn)物電泳或顯色反應(yīng)進(jìn)行判斷是否發(fā)生反應(yīng)。該方法不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí) 間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過(guò)程，LAMP法具有高特異性、高效性、快速、 廉價(jià)(不需要特定的貴重檢測(cè)設(shè)備，只需要簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、易檢測(cè)(直接進(jìn)行目 測(cè)判斷)等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用于瘧原蟲(chóng)屬和種、含惡性瘧原蟲(chóng)U3Iasmodium falciparum)、三日皰原蟲(chóng){Plasmodiummalariae)、卵形皰原蟲(chóng){Plasmodium ovale")及 間日瘧原蟲(chóng)^Plasmodium vivax、)的核酸檢測(cè)方法，使檢測(cè)能力進(jìn)一步提高，LAMP 檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)限高于常規(guī)檢測(cè)法的100-200倍，這樣就有力地克服了傳統(tǒng)的顯微鏡鏡 檢方法檢出率較底的問(wèn)題；三是由于經(jīng)典聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備要求 較高(如PCR擴(kuò)增儀，瓊脂凝膠電泳系統(tǒng)等)、技術(shù)較為復(fù)雜，不利于其在基層醫(yī)療防 疫、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)的普遍應(yīng)用，而LAMP檢測(cè)技術(shù)具有儀器設(shè)備要求檢測(cè)(只需要簡(jiǎn)單 結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、檢測(cè)時(shí)間短(0.5-1.0小時(shí))、特異性高(針對(duì)靶基因的8/6個(gè)區(qū)域設(shè) 計(jì)6/4種特異引物，)等特點(diǎn)，可以使用基因擴(kuò)增技術(shù)在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)廣泛使用。本發(fā)明是以如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種應(yīng)用于篩查瘧原蟲(chóng)屬和種、含惡性 _原蟲(chóng)(.Plasmodium falciparum)、三日_原蟲(chóng)(.Plasmodium malariae)、卵形？^原蟲(chóng)
{Plasmodium ovale)及間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodium vivax))核酸的檢測(cè)方法，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP) 技術(shù)來(lái)進(jìn)行，利用LAMP技術(shù)平臺(tái)通過(guò)使用特異性引物擴(kuò)增瘧原 蟲(chóng)屬和種靶基因的特定區(qū)域，在陽(yáng)性和陰性質(zhì)控和內(nèi)對(duì)照檢測(cè)體系的輔助下，從分子水 平對(duì)瘧原蟲(chóng)屬和種(含惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum、、三日瘧原蟲(chóng)(Plasmodium malariae)、卵形皰原蟲(chóng)(Plasmodium ovale)及間日皰原蟲(chóng)(Plasmodium vivax))核酸
篩查或檢測(cè)。進(jìn)一步地，在本發(fā)明所述的瘧原蟲(chóng)屬和種核酸的篩查檢測(cè)方法中，在LAMP篩 查過(guò)程中引入了陰陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)系統(tǒng)。陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控品為相同于擴(kuò)增瘧原蟲(chóng)屬或種特定 靶基因片段，陰性對(duì)照質(zhì)控品為不相同于擴(kuò)增瘧原蟲(chóng)屬或種特定靶基因片段，并使用電 泳分析或SYBR Green I熒光染料顯色法同時(shí)檢測(cè)內(nèi)對(duì)照和瘧原蟲(chóng)屬和種靶基因擴(kuò)增產(chǎn) 物。進(jìn)一步地，在本發(fā)明所述的金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌及單核細(xì)胞 增生李斯特菌核酸檢測(cè)方法中，其特征在于，所用的LAMP反應(yīng)體系是一系列通過(guò)優(yōu)化 的反應(yīng)成分組成，并具有特定反應(yīng)程序。本發(fā)明具有嚴(yán)格的鑒別篩查診斷體系，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該鑒別篩 查診斷系統(tǒng)由陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品，內(nèi)對(duì)照質(zhì)控品以及相關(guān)擴(kuò)增和檢測(cè)體系組成。本發(fā)明中鑒別篩查診斷系統(tǒng)的陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品是每批實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果是否有效 的重要標(biāo)志。對(duì)于每批實(shí)驗(yàn)，必須引入一個(gè)陰性質(zhì)控品的檢測(cè)，以保證反應(yīng)體系不會(huì)出 現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；對(duì)于每批實(shí)驗(yàn)，必須引入一個(gè)瘧原蟲(chóng)屬和種陽(yáng)性質(zhì)控品的檢測(cè)，以保證 反應(yīng)體系不會(huì)出現(xiàn)假陰性反應(yīng)。針對(duì)瘧原蟲(chóng)屬和種的陽(yáng)性質(zhì)控品是人工構(gòu)建的上述瘧原 蟲(chóng)待檢靶序列的質(zhì)粒。本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物均由發(fā)明人設(shè)計(jì)，通過(guò)核酸合成設(shè) 備制備。核酸合成設(shè)備可選用不同廠家，不同型號(hào)的產(chǎn)品，也可委托相關(guān)的基因公司 合成。所有引物按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則，利用ICBgyrB數(shù)據(jù)庫(kù)及RIDOM數(shù)據(jù)庫(kù)尋 找瘧原蟲(chóng)屬和種(含惡性瘧原蟲(chóng)^Plasmodium falciparum、、三日瘧原蟲(chóng)、Plasmodium malariae)、卵形皰原蟲(chóng){Plasmodium ovale)及間日皰原蟲(chóng)〈Plasmodiuin vivax))的 LAMP基因序列，利用軟件選取其特異性序列，利用PrimerExplorer IV軟件進(jìn)行進(jìn)一步分 析，設(shè)計(jì)5套引物，分別針對(duì)上述瘧原蟲(chóng)屬和種。本發(fā)明鑒別診斷系統(tǒng)中的LAMP體系 及反應(yīng)程序均由發(fā)明人設(shè)計(jì)。原蟲(chóng)屬和種的核酸特異性引物序列、LAMP反應(yīng)體系及反 應(yīng)程序如下
一、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物
表一瘧原蟲(chóng)屬的LAMP反應(yīng)引物序列組成
權(quán)利要求
1. 一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的瘧原蟲(chóng)屬和種的核酸篩查方法，利用環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行，其特征在于，通過(guò)使用瘧原蟲(chóng)屬特異性引物和種特異性引 物，利用LAMP技術(shù)平臺(tái)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，在陽(yáng)性和陰性質(zhì)控和內(nèi)對(duì)照檢測(cè)體系 的輔助下，從分子水平對(duì)瘧原蟲(chóng)屬進(jìn)行篩查或檢測(cè)，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)該屬生物中會(huì)使 人類感染瘧疾的四種瘧原蟲(chóng)，包括惡性瘧原蟲(chóng)UiIasmodium falciparum、、三日瘧原蟲(chóng) (.Plasmodium malariae)、卵形皰原蟲(chóng)(.Plasmodium ovale)及間日皰原蟲(chóng)(.Plasmodium vivax)進(jìn)行瘧原蟲(chóng)種篩查或檢測(cè)；所述的瘧原蟲(chóng)屬的LAMP檢測(cè)特異性引物是瘧原蟲(chóng)屬的LAMP反應(yīng)引物序列組成
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的瘧原蟲(chóng)屬和種的核酸篩查方法， 其特征在于利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增上述瘧原蟲(chóng)屬和種的特定靶核酸序列區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的瘧原蟲(chóng)屬和種的核酸篩查方法， 其特征在于所述的陰陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系中，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控品為相同于擴(kuò)增瘧原蟲(chóng)屬或種 特定靶基因片段；陰性對(duì)照質(zhì)控品為不相同于擴(kuò)增瘧原蟲(chóng)屬或種特定靶基因片段，并使 用電泳分析、SYBRGreen I熒光染料顯色法同時(shí)檢測(cè)陰陽(yáng)對(duì)照和瘧原蟲(chóng)屬和種，含惡性 瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)及間日瘧原蟲(chóng)特定靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的瘧原蟲(chóng)屬和種的核酸篩查方法， 其特征在于，所用的LAMP反應(yīng)體系是一系列通過(guò)優(yōu)化的反應(yīng)成分組成，并具有特定擴(kuò) 增程序；其LAMP反應(yīng)體系組成如下反應(yīng)體系
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一套基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的瘧原蟲(chóng)屬和種的核酸篩查方法，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)來(lái)進(jìn)行，通過(guò)使用瘧原蟲(chóng)屬特異性引物和種特異性引物，利用LAMP技術(shù)平臺(tái)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，在陽(yáng)性和陰性質(zhì)控和內(nèi)對(duì)照檢測(cè)體系的輔助下，從分子水平對(duì)瘧原蟲(chóng)屬進(jìn)行篩查或檢測(cè)，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)該屬生物中會(huì)使人類感染瘧疾的四種瘧原蟲(chóng)，包括惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、三日瘧原蟲(chóng)(Plasmodiummalariae)、卵形瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumovale)及間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumvivax)進(jìn)行瘧原蟲(chóng)種篩查或檢測(cè)。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、靈敏和特異的特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102010910SQ20101055507
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者吳萍蘭, 孫慧宇, 孫立新, 宋陽(yáng)威, 徐波, 房超, 易海華, 楊志俊, 王偉, 邵景東, 錢(qián)進(jìn) 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)徐州出入境檢驗(yàn)檢疫局