專利名稱：豬sftpc基因中一個可用于溯源的snp標記及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬食品安全領域，具體涉及一種豬SFTPC基因中一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法。
背景技術：
隨著生活水平和保健意識的提高，人們越來越注重食品安全問題。豬肉制品作為人膳食中重要的蛋白質來源，如何確保其安全衛(wèi)生，保障消費者的身體健康和生命安全已成為全球性的熱點問題。世界各國政府紛紛采取一系列的技術措施來強化對肉產品的安全管理，以期最大程度上減少食品安全事件的發(fā)生。我國各大城市也紛紛建立了肉產品的追溯系統(tǒng)，通過肉制品的溯源管理，能夠為消費者提供準確而詳細的有關產品的信息，有利于生產經營者及時發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)中存在的不安全隱患，為消費者提供一個獲取有效可靠信息的途徑。更為重要的是，大大加強了政府部門對肉質品質量安全的監(jiān)管，為國家迅速建立食品安全風險的應對機制提供有效信息，將有助于社會的安定。但是我國肉產品追溯系統(tǒng)所采用的標簽技術存在標簽丟失、記錄出差、標記圖案模糊不清以及標簽容易人為改換等缺點；而國外發(fā)達國家所采用的DNA溯源技術是基于個體DNA指紋圖譜的生物學技術，有著絕對的不可更改性和唯一性，不受人為因素影響。而且因為DNA溯源技術容易分型、重復性好、檢測手段簡單快捷、成本低廉等成為目前國際上被公認為最具發(fā)展?jié)摿蛻脙r值的快速溯源技術。DNA溯源技術的產生源于DNA的遺傳與變異，用于構建個體DNA指紋圖譜的分子標記有AFLP標記(擴增片段長度多態(tài)性)、SSR標記(微衛(wèi)星標記)和SNP標記(單核苷酸多態(tài)性)。AFLP標記具有高度可靠性和操作簡便性，但同時又存在著對模板反應表現(xiàn)遲鈍、 譜帶可能發(fā)生錯配與缺失、成本相對比較高等缺點。相比SNP標記，SSR標記的等位基因眾多，多態(tài)豐富，但也正因如此，使得SSR標記的帶型復雜，給DNA指紋識別自動化和規(guī)模化帶來困難。SNP標記是第三代分子遺傳標記，是指基因組同一位點上單個核苷酸的變異，一般表現(xiàn)為二等位基因，非常適宜高通量自動化分析，所以日益成為動物身份識別最受關注的分子標記。但是用于肉產品溯源的SNP標記不同于一般的SNP標記，對于單個的SNP標記，它必須至少具有以下特征(1)變異度高，在品種或品系中等位基因頻率接近；(2)品種間等位基因分布頻率差異??；(3)雜合度大于等于0. 3。在長期的育種工作中，研究者積累了大量的SNP標記，但是這些SNP標記往往集中分布在某些染色體上，如1號染色體、12號染色體等，而另外部分染色體，如5號、8號、14號染色體等則缺乏SNP標記，因此為了滿足對豬肉產品進行DNA溯源的要求，本申請進行了新 SNP標記的研究工作。SFTPC基因是肺表面活性物質相關蛋白4種中的一種，是一種疏水性蛋白質。研究表明疏水性蛋白對肺表面活性物質的活性起重要作用，能加速肺表面活性物質中的主要成分磷脂向氣液界面的吸附，從而發(fā)揮其降低肺表面張力的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種豬SFTPC基因中一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法。本發(fā)明的SNP分子標記在商品豬培育中，可以廣泛用于豬肉產品DNA 溯源及其檢測，特別是用于豬肉產品的安全性溯源。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案所述的豬SFTPC基因中一個可用于溯源的SNP分子標記，是通過DNA池(pool)測序獲得，并在包括11個豬品種或品系的試驗群體(共計2 個個體)中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，初步判定該SNP標記可用作豬肉產品DNA溯源。所述的SNP分子標記，位于豬SFTPC基因的一段基因組DNA片段中，其序列如 SEQID NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。在該SNP分子標記的第639 位堿基處有一個堿基突變639A — 639T。所述的豬SFTPC基因的一段基因組DNA片段，其序列如SEQ ID NO 1所示，共 1039bp，其包含完整的第二外顯子和第三外顯子，包含部分第一內含子，完整的第二內含子和部分第三內含子序列。且在該DNA片段的第639位堿基處有一個堿基突變639A — 639T。 所述DNA片段編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明所述的SNP分子標記的檢測方法，是通過DNA池測序，采用PCR-AgeI-RFLP 方法獲得的，具體包括以下步驟(1)構建豬的DNA池；(2)設計正、反引物分離豬SFTPC基因的DNA片段，測序并分析；(3)建立突變位點的RFLP檢測方法；(4)采集豬的11個品種或品系的耳組織樣，共計2 個個體；(5)檢測SNP標記在試驗群體的分布，統(tǒng)計分析判斷是否適用于豬肉產品溯源的 SNP標記。其中，上述檢測方法中，分離豬SFTPC基因的DNA片段的正、反引物的堿基序列如 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示。 所述的SNP分子標記可應用于豬肉產品的DNA溯源中。本發(fā)明采用DNA池檢測到豬SFTPC基因中存在的SNP分子標記，在包括11個豬品種或品系的試驗群體中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0. 3，初步判定該SNP標記可用作豬肉產品DNA溯源以及豬肉產品的安全性溯源中。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案。實施例1
分子標記的查找(I)DNA 池(pool)的構建分別隨機采集杜洛克豬、梅山豬個體各2頭(不分性別)的耳組織，提取DNA后， 等量吸取4個個體的DNA放入同一離心管中，混勻待用。(2)引物設計以豬SFTPC基因的cDNA序列(Genbank :AJ891031)為模板，設計引物分離豬SFTPC 基因(以一頭杜洛克豬的DNA為PCR擴增的模板)，引物如下正向引物5'-TACTTAGGAGGTCGCAGAA-3‘(參見序列 SEQ ID No 3)
反向引物5 ‘ -CCCGCTGGTAGTCATAGA-3 ‘(參見序列 SEQ ID No 4)PCR反應總體積為20 μ 1，其中豬SFTPC基因組DNA約lOOng，含 1 Xbuffer (Promega公司)，1. 5mmol/L MgCl2, dNTP (上海生工生物公司)終濃度為 150μmol/L，引物終濃度為0.2μmol/L，2U Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)。PCR 擴增程序為94°C 4min,然后循環(huán) 30 次 94°C 30s, 58°C退火 30s，72°C 40s,最后 72°C延伸 IOmin0PCR反應產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。(3)克隆測序分析將得到的豬SFTPC基因PCR產物按照如下常規(guī)方法進行克隆。PCR產物的純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入 1. 5mlEpendorff管中，用PCR產物純化試劑盒(天根生化科技有限公司)純化。連接反應將純化的PCR產物與pMDIS-T載體(大連寶生物公司)連接，連接反應總體積是10 μ 1，其中包括5 μ 1 solution I (大連寶生物公司)，0. 5 μ 1的T載體(大連寶生物公司)，2. 5 μ 1的純化PCR產物，最后加入2 μ 1滅菌水置4°C水浴過夜。轉化無菌狀態(tài)下取100 120 μ 1感受態(tài)細胞(天根生化科技有限公司)于 1. 5mlEpendorff管中，將5 μ 1的連接產物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3 ％iin，加入400 μ 1無抗生素的LB液體培養(yǎng)基， 37°C平放Ih后倒置培養(yǎng)。菌落PCR鑒定經菌落PCR鑒定后的大腸桿菌(Escherichia coli)在LB培養(yǎng)基 37°C培養(yǎng)過夜，隨即挑取多個克隆子送到上海生工生物有限公司測序。經測試，該經拼接后的豬SFTPC基因的DNA序列為1039bp，其序列如SEQ ID No 1 所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。經分析發(fā)現(xiàn)該DNA序列的第639堿基處存在一個堿基突變(639A-639T)，通過分子生物學軟件分析，發(fā)現(xiàn)該第639堿基處的堿基突變導致 AgeI-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)多態(tài)性。(4) RFLP檢測方法的建立酶切反應總體積10 μ 1，其中IXbuffer 10 μ 1，PCR產物3 5 μ 1，限制性內切 BlAgeI為0.5μ 1(5扔，用H2O補足10 μ 1，37 °C水浴4h，稱取0. 6g瓊脂糖溶于15. 75ml DEPC(上海生工生物公司)處理水中，稍冷卻(60°C )，加入5ml的5X甲醛凝膠電泳緩沖液和4. 25ml的37%甲醛溶液，混勻制膠，電泳后檢測酶切結果。結果發(fā)現(xiàn)A等位基因只有 1039bp 一個片段，T等位基因有638bp和401bp兩個片段，這兩個等位基因可組成三種基因 M AA, AT, TT0
實施例2等位基因的分布情況(1)試驗群體的設計試驗組采集皮特蘭(19頭)、申農( 頭)、大申(31頭)、皮申(10頭)、長申06 頭)、杜申(23頭)、皮大申(18頭)、長大申(25頭)、杜大申(7頭)、杜皮申(8頭)和杜皮大申(31頭)個體的耳組織，提取DNA，共計2 個DNA樣本。試驗群體的目的在于檢測SNP標記在不同品種中的分布情況。(2)基因型檢測利用正向引物5'-TACTTAGGAGGTCGCAGAA-3‘(參看 SEQ ID N03)
反向引物5 ‘ -CCCGCTGGTAGTCATAGA-3 ‘(參看 SEQ ID No4)進行擴增，用相同的RFLP方法檢測試驗群體所有的個體基因型。(3)統(tǒng)計分析記錄所有個體的基因型，并計算等位基因頻率和雜合度，結果如下表1所示。表 權利要求
1.獲得豬SFTPC基因的一段基因組DNA片段，其序列如SEQID NO 1所示，共1039bp， 包含完整的第二外顯子和第三外顯子，包含部分第一內含子，完整的第二內含子和部分第三內含子序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的獲得豬SFTPC基因的一段基因組DNA片段，其特征在于，所述 DNA片段的第639位堿基處有一個堿基突變639A — 639T。
3.根據(jù)權利要求1所述的獲得豬SFTPC基因的一段基因組DNA片段，其特征在于，所述 DNA片段編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.一種SNP分子標記，位于權利要求1至3任一項所述的豬SFTPC基因的DNA片段中，其序列如SEQ ID NO 1所示，且在該SNP分子標記的第639位堿基處有一個堿基突變 639A — 639T。
5.根據(jù)權利要求4所述的SNP分子標記，其編碼的氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
6.權利要求4所述的SNP分子標記的檢測方法，其特征在于，所述的SNP分子標記是通過DNA池測序，采用PCR-AgeI-RFLP方法獲得的，具體包括以下步驟(1)構建豬的DNA池；(2)設計正、反引物分離豬SFTPC基因的DNA片段，測序并分析；(3)建立突變位點的RFLP檢測方法；(4)采集豬的11個品種或品系的耳組織樣，共計2 個個體；(5)檢測SNP標記在試驗群體的分布，分析判斷該SNP標記是否適用于豬肉產品的DNA 溯源。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，分離豬SFTPC基因的DNA片段的正、 反引物的堿基序列如SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示。
8.權利要求4所述的SNP分子標記在豬肉產品的DNA溯源中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬SFTPC基因中一個可用于溯源的SNP分子標記及其檢測方法。所述的SNP分子標記是通過DNA池(pool)測序獲得，其序列如SEQ ID NO 1所示，在該SNP分子標記的第639位堿基處有一個堿基突變639A→639T，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。在包括11個豬品種或品系的試驗群體中，分析該SNP分子標記在試驗群體中等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0.3，初步判定該SNP標記可用作豬肉產品DNA溯源。
文檔編號C12N15/11GK102477424SQ20101055554
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權日2010年11月23日
發(fā)明者吳瀟, 唐雪明, 張小波, 朱宏, 王金斌, 蔣玲曦, 譚芙蓉, 趙凱, 陶世如 申請人:上海市農業(yè)科學院