專利名稱：快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的pcr方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分子信標(biāo)熒光定量PCR 方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
阪崎腸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的一種革蘭氏陰性無芽胞桿菌，屬腸桿菌科腸 桿菌屬。因阪崎腸桿菌是腸道正常菌群中的一種，屬條件致病菌，一直未被臨床引起重視， 直到1961年英國(guó)的toemenyi和Frank兩位醫(yī)生首次報(bào)告了由該菌引起的兩例腦膜炎病 例，隨后丹麥、美國(guó)、荷蘭、希臘、冰島、比利時(shí)等國(guó)家相繼報(bào)道了多起新生兒阪崎腸桿菌感 染事件。在食品行業(yè)，阪崎腸桿鼠(Enterobacter Sakazakii)也是近年來受到廣泛關(guān)注的 食源性病原菌。2002年國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICMSF)把阪崎腸桿菌列為“嚴(yán)重危 害特定人群、危害生命或慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥或長(zhǎng)期影響”的致病菌，國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng) 自2007年起把阪崎腸桿菌列為嬰兒配方食品重點(diǎn)監(jiān)測(cè)病原菌。據(jù)已經(jīng)報(bào)道的多起病例來 看，阪崎腸桿菌對(duì)嬰幼兒、老人、艾滋病人和器官移植病人等免疫力低下人群感染，總體死 亡率高達(dá)80%，且愈后后遺癥多為神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，危害極其嚴(yán)重。阪崎腸桿菌的檢測(cè)技術(shù)(1)阪崎腸桿菌的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)目前國(guó)內(nèi)較為常用的培養(yǎng)檢測(cè)方法主要有兩種一種是來自FDA的檢測(cè)程序“嬰 兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分離與計(jì)數(shù)”，第二種方法是DFI (Druggan-Forsythe-Iversen) 法。這兩種方法自2002年被推薦公布以來，一直是各國(guó)沿用的阪崎腸桿菌鑒定檢測(cè)的方 法，缺點(diǎn)是時(shí)間太長(zhǎng)，需時(shí)5天左右，所需試劑繁多。(2)阪崎腸桿菌的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要是利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)阪崎腸桿菌，進(jìn)一步提高了阪崎腸桿菌的檢測(cè) 水平。但是當(dāng)前阪崎腸桿菌的熒光定量PCR檢測(cè)主要是通過STOR Green I熒光染料和 Taqman探針法來完成。其中STOR Green I熒光染料法是通過一種可以非特異地結(jié)合雙鏈 DNA小溝的熒光染料，它嵌合進(jìn)DNA雙鏈(dsDNA)，但不結(jié)合單鏈。因此在每個(gè)PCR循環(huán)結(jié) 束時(shí)，檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化就可以知道DNA增加的量。其優(yōu)點(diǎn)在于不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢 測(cè)方法變得簡(jiǎn)單，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。然而由于熒光染料能夠和任何dsDNA結(jié)合，它 也能與非特異的雙鏈如引物二聚體、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物等結(jié)合。因此常常會(huì)使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生假陽 性的信號(hào)。Taqman探針是一種線形的寡核苷酸，當(dāng)探針完整時(shí)，熒光物質(zhì)受到淬滅物質(zhì)的 制約，不能發(fā)出熒光，而當(dāng)在PCR反應(yīng)過程中，TaqDNA聚合酶將Taqman探針分解后，5、端 的熒光物質(zhì)便會(huì)游離出來發(fā)出熒光，通過檢測(cè)反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度，則可以達(dá)到檢測(cè)PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。Taqman探針法產(chǎn)生較低的熒光背景，具有較高的靈敏性和穩(wěn)定性，其熒 光光譜具有較高的分辨率，而且探針的保存時(shí)間較長(zhǎng)，具有很高的可重復(fù)性以及特異性。但是由于其探針的結(jié)構(gòu)為線性的，因此其特異性還有待于進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是建立分子信標(biāo)法熒光定量技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸 桿菌的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供阪崎腸桿菌的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供的建立分子信標(biāo)法熒光定量技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的 方法，包括以下幾個(gè)步驟1、阪崎腸桿菌的培養(yǎng)；2、制備阪崎腸桿菌基因組DNA ；3、構(gòu)建目的重組質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；4、構(gòu)建內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒，與目的基因在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系，排 除假陰性；5、建立分子信標(biāo)熒光定量技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的方法，優(yōu)化反應(yīng) 條件；6、對(duì)3種從嬰兒配方奶粉中高效提取阪崎腸桿菌的方法進(jìn)行比較；7、確定分子信標(biāo)熒光定量方法的靈敏度；8、人工污染樣品，確定檢測(cè)限；9、實(shí)際檢測(cè)，確定該方法的特異性、靈敏度、符合率。其中阪崎腸桿菌基因所包含的ompA基因的核苷酸序列為ccgggctaaa aattcactca agaatggtgc attaattgtt tttaggataaagatttgttc tcgcgctctg cgttagagtg attgtggcga atgaacggcctttcgtccgg tttcacactt tacgagtgtt taaaattgcc gcaaaaatgttttcgcaagt tgtttttttt catatgcctg acggacttca cacttgtaagcgttgtagac tttacctcgc cagggtgctc atcaataaac cgacaatatcccattgagct ataaccccgg tgaaggattt aaccgtgaac ttttcctcccatggcctttt tggatgataa cgaggcgcaa aaaatgaaaa agacagctatgtggcactgg ctggcttcgc taccgtagcg caggccgcac cgaaagataagcaggcggca aactgggctg gtcccagttc cacgataccg gttttattccccgactcacg aaagccagct gggcgcaggc gcgttcggtg gttaccaggtgttggcttcg aaatgggcta cgactggctg ggccgcatgc cgtataaaggaacggcgctt tcaaagctca gggcgtacag ctgaccgcta aactgggttagacgatctgg acgtttacac ccgtctgggc ggcatggtat ggcgtgctgaaacatcgctg gcgacgacca cgacaccggc gtttctcctg tattcgcaggtgggcaatga ctcgcgacat cgctacccgt ctggaatacc agtgggttaagacgcacaga ctgttggcgc gcgtccggac aacggcatgc tgagcgtaggcgtttcggtc agcaggaaga tgcagctccg gttgtagctc cggctccggcgaagtacaga ccaagcactt caccctgaag tctgacgttc tgttcaacttaccctgaaac cggaaggcca gcaggcgctg gatcagctgt actctcagct
atcctggtac60agacgggcga120taaattttgc180tttccaacta240ggtagagtaa300ggaaaagcgc360cgcgattgca420cacctggtat480taacgacggt540taacccgtac600cgacactgta660cccggtaacc720ttcctcttct780cggcgttgag840caacatcggc900tgtttcctac960tccggctccgl020caacaaagctl080gagcaacctgll40
gatccgaaagacggttctgtagtggttctgggcttcaccgaccgtatcggttctgacgctl200
tacaaccagggtctgtctgagaaacgtgctcagtctgttgttgactacctgatctccaaal260
ggtatcccgtccaacaagatctccgcacgtggtatgggcgaatccaacccggtcactggcl320
aacacctgtgacaacgtgaaagctcgtgcagctctgatcgactgcctgggtccggatcgtl380
cgcgtagagatcgaagttaaaggcgttaaagacgttgtaactcagccgcaggcttaagttl440
atacgttaagaaaaaccccgcccaggcggggttttttgtttctggcgttcatgtttctgcl500
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ggtttatcatcaccgcaggcatcacattttgccctgcaatcgctgcgctatgctccgggcl620
aagcgtgtcagcctgacgttttgcggcgcctcgcccgcgttactctttcttacccagcagl680
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ctcggcattaaaatgccgcttacgacgggcgcgaatcgtctgtttaaggcggttttgcagl920
CgCCgggttCatatgcttctcgatccagcccagcactcttaccggttcgttttccataccl980
cagcaagagatccaccgcctctttcgctgcgctggcttcgacatagcgggttatcagctc2040
gccttcg2047 其中內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)序列為ACCGGCGTTTCTCCTGTAggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactg cctgcaggaactacggcgatatctCGGCGTTTCTCCTGTATTCGaaaatccggGGACAACGGCATGCTGA其中PCR反應(yīng)體系(25 μ L)為10XPCR緩沖液2 μ L、引物對(duì)和分子信標(biāo) (10 μ mol/L)各 1 μ L、dNTPs (10mmol/L) 2 μ L、Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 2 μ L、模板 DNA 2μ L、7jC 16. 8μ L。其中PCR 反應(yīng)條件為94°C 3min -MV 60s ；60°C 60s, ；40 個(gè)循環(huán)。其中ompA基因特異性引物序列為5-ACCGGCGTTTCTCCTGTA-35-TCAGCATGCCGTTGTCC-3其中分子信標(biāo)為熒光信號(hào)FAM-ctgcat-CGGCGTTTCTCCTGTATTCG-atgcag-DABCYL 淬滅信號(hào)。一種快速檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR試劑盒，其特征在于包括A、阪崎腸桿菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；B、內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒；C、含有分子信標(biāo)的PCR緩沖液(包括dNTP各種PCR相關(guān)成分)；D、含有Taq酶的儲(chǔ)存液；E、去離子水。本發(fā)明建立分子信標(biāo)法熒光定量技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的方法，通 過比較確定從人工污染的嬰兒配方奶粉中高效提取阪崎腸桿菌的方法并進(jìn)行評(píng)價(jià)。以阪崎 腸桿菌基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建目的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，并構(gòu)建內(nèi)標(biāo)重組 質(zhì)粒加到反應(yīng)體系內(nèi)與靶基因共同擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系，排除假陰性。對(duì)熒光定量反應(yīng)體系 進(jìn)行優(yōu)化，并確定熒光定量方法和人工污染的檢測(cè)限，并進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)。
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本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處(1)本研究率先在國(guó)內(nèi)將分子信標(biāo)技術(shù)用于嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌的檢測(cè)；(2)利用內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒有效排除假陰性，提高檢測(cè)效率；(3)方便、快捷、高通量，對(duì)食品標(biāo)本僅需Id時(shí)間，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)雙重或多重實(shí)時(shí) PCR，完成多種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)。(4)裝配成試劑盒使用安全，特異性好，使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性好，同時(shí)將檢測(cè)時(shí) 間由原來的5d縮短至ld，節(jié)省了人力物力，為企業(yè)及時(shí)的反饋產(chǎn)品信息，也為監(jiān)管部門快 速應(yīng)對(duì)食品安全問題提供了有力的技術(shù)支持，產(chǎn)生良好的社會(huì)效益。


圖1是本發(fā)明的流程圖。圖2是PCR擴(kuò)增曲線圖。圖3是特異性曲線圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii) ATCC29544 株；ATCC 51007 株；ATCC 510 株；甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella schottmuelleri)；乙型副傷寒沙門氏菌 (Salmonella pafatyphi B)；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；腸炎沙門 氏菌(Salmonella enreritidis)；宋內(nèi)氏志賀氏菌(shigella sonnei)；痢疾志賀氏菌 (Shigella dysenteriae)；鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)；福氏志賀氏菌(Shigella flexnei)；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Enterobacteo yersinia)；普通變形桿菌(Proteus vuLgaris)；單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；大腸桿菌(Eseheriehiaeoli)均 購自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。實(shí)施例1 試劑盒的組成和配制1、DNA 提取液包括以下成分 IOXTE (0. IM Tris-HCL, 0. IM EDTA ρΗ8· 8) ；50ug/ ul溶菌酶；1% SDS ；0. 2ug/ul的蛋白酶K。2、10 XPCR 反應(yīng)液包括 IOOmM KCL ； 1200mM Tris-HCL ；1% Triton χ-100 ； 15mM MgSO4 ； IOOmM (NH4)2SO4 ； lmg/mL BSA ；3、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板標(biāo)準(zhǔn)陽性模板為含有阪崎腸桿菌保守基因ompA 265個(gè)堿基的 核苷酸片段的pGEMT-easy載體構(gòu)成。4、特異性引物及分子信標(biāo)5-ACCGGCGTTTCTCCTGTA-35-TCAGCATGCCGTTGTCC-3熒光信號(hào)FAM-ctgcat-CGGGGTTTCTCCTGTATTCG-atgcag-DABCYL 淬滅信號(hào)。5、內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)對(duì)照是含有人MICA基因和阪崎腸桿菌分子信標(biāo)的序列的人工合成序列 構(gòu)建的PUC18T重組質(zhì)粒，其標(biāo)準(zhǔn)序列為
ACCGGCGTTTCTCCTGTAggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactg cctgcaggaactacggcgatatctCGGCGTTTCTCCTGTATTCGaaaatccggGGACAACGGCATGCTGA6、陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為無菌雙蒸水。實(shí)施例2 試劑盒的敏感度試驗(yàn)1、阪崎腸桿菌的培養(yǎng)購買阪崎腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，經(jīng)細(xì)菌肉湯培養(yǎng)過夜備用。2、制備阪崎腸桿菌基因組DNA。菌株經(jīng)細(xì)菌肉湯培養(yǎng)過夜后，菌體用500ul TE buffer懸浮，加入終濃度為50ug/ ul溶菌酶，37°C作用lh，然后再加入終濃度為SDS和0. 2ug/ul的蛋白酶K，55°C作用Ih 后，用酚-氯仿抽提DNA。3、PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)體系(25 μ L) :10XPCR緩沖液2 μ L、引物對(duì)和分子信 標(biāo)(10 μ mol/L)各 1 μ L、dNTPs (10mmol/L) 2 μ L、TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 2 μ L、模板 DNA 2μ L、7jC 16. 8μ L。PCR 反應(yīng)條件94°C 3min ;94°C 60s, 60°C 60s，40 個(gè)循環(huán)；實(shí)時(shí)觀察擴(kuò)
增曲線。見圖2。實(shí)施例3 試劑盒的特異性試驗(yàn)用取自中國(guó)普通微生物菌種保藏中心的甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella schottmuelleri)；乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella pafatyphi B)；鼠傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)；腸炎沙門氏菌(Salmonella enreritidis)；宋內(nèi)氏志賀氏菌 (shigella sonnei)；痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)；鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)；福氏志賀氏菌(Shigella flexnei)；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Enterobacteo yersinia)；普通變形桿菌(Proteus vuLgaris)；單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；大腸桿菌(Eseheriehiaeoli)為對(duì)照，與阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)ATCC29544 株；ATCC 51007 株；ATCC 51024 株的 DNA,以及陽性對(duì)照質(zhì)粒、內(nèi)標(biāo) 重組質(zhì)粒，各取5uL為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為PCR反應(yīng)體系05 μ L) :10XPCR緩沖液2 μ L、引物對(duì)和分子信 標(biāo)(10 μ mol/L)各 1 μ L、dNTPs (10mmol/L) 2 μ L、TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 2 μ L、模板 DNA 2μ L、7jC 16. 8μ L。PCR 反應(yīng)條件94°C 3min ；94°C 60s, 60°C 60s，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果只有阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)ATCC29544 株、ATCC 51007 株以 及陽性對(duì)照和內(nèi)標(biāo)檢測(cè)到熒光值。而甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella schottmuelleri)； 乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella pafatyphi B)；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)；腸炎沙門氏菌(Salmonella enreritidis)；宋內(nèi)氏志賀氏菌(shigella sonnei)；痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)；鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)；福 氏志賀氏菌(Shigella flexnei)；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Enterobacteo yersinia)；普 通變形桿菌(Proteus vuLgaris)；單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)；大腸桿菌 (Eseheriehiaeoli)均為陰性。見圖3 ；說明試劑盒具有良好的特異性。以上實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步描述，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本 發(fā)明技術(shù)方案的前提下，對(duì)本發(fā)明說做的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
0108]序列表0109]ccgggctaaaaattcactcaagaatggtgc0110]agatttgttctcgcgctctgcgttagagtg0111]tttcgtccggtttcacactttacgagtgtt0112]tttcgcaagttgttttttttcatatgcctg0113]cgttgtagactttacctcgccagggtgctc0114]ccattgagctataaccccggtgaaggattt0115]atggcctttttggatgataacgaggcgcaa0116]gtggcactggctggcttcgctaccgtagcg0117]gcaggcggcaaactgggctggtcccagttc0118]ccgactcacgaaagccagctgggcgcaggc0119]gttggcttcgaaatgggctacgactggctg0120]aacggcgctttcaaagctcagggcgtacag0121]gacgatctggacgtttacacccgtctgggc0122]aacatcgctggcgacgaccacgacaccggc0123]tgggcaatgactcgcgacatcgctacccgt0124]gacgcacagaCtgttggCgCgcgtccggac0125]cgtttcggtcagcaggaagatgcagctccg0126]gaagtacagaccaagcacttcaccctgaag0127]accctgaaaccggaaggccagcaggcgctg0128]gatccgaaagacggttctgtagtggttctg0129]tacaaccagggtctgtctgagaaacgtgct0130]ggtatcccgtccaacaagatctccgcacgt0131]aacacctgtgacaacgtgaaagctcgtgca0132]cgcgtagagatcgaagttaaaggcgttaaa0133]atacgttaagaaaaaccccgcccaggcggg0134]cggaataagttcagagactggctttgcgcc0135]ggtttatcatcaccgcaggcatcacatttt0136]aagcgtgtcagcctgacgttttgcggcgcc0137]tgcctgcaaatcctgtttcagcgtcgacat0138]atcttcaatcagctgcacgatggtttctga0139]ggccagtcgctgccagaccataaactccag0140]ctcggcattaaaatgccgcttacgacgggc0141]CgCCgggttCatatgcttctcgatccagcc0142]cagcaagagatccaccgcctctttcgctgc0143]gccttcg2047
attaattgtttttaggataaatcctggtac60attgtggcgaatgaacggccagacgggcga120taaaattgccgcaaaaatgttaaattttgc180acggacttcacacttgtaagtttccaacta2403. C 3.3. 3.3.3. Ccgacaatatcggtagagtaa300aaccgtgaacttttcctcccggaaaagcgc360aaaatgaaaaagacagctatcgcgattgca420caggccgcaccgaaagataacacctggtat480cacgataccggttttattcctaacgacggt540gcgttcggtggttaccaggttaacccgtac600ggccgcatgccgtataaaggcgacactgta660ctgaccgctaaactgggttacccggtaacc720ggcatggtatggcgtgctgattcctcttct780gtttctcctgtattcgcaggcggcgttgag840ctggaataccagtgggttaacaacatcggc900aacggcatgctgagcgtaggtgtttcctac960gttgtagctccggctccggctccggctccgl020tctgacgttctgttcaacttcaacaaagctl080gatcagctgtactctcagctgagcaacctgll40ggcttcaccgaccgtatcggttctgacgctl200cagtctgttgttgactacctgatctccaaal260ggtatgggcgaatccaacccggtcactggcl320gctctgatcgactgcctgggtccggatcgtl380gacgttgtaactcagccgcaggcttaagttl440gttttttgtttctggcgttcatgtttctgcl500tgtcatcaacgtctgttgtgttttcggaagl560gccctgcaatcgctgcgctatgctccgggcl620tcgcccgcgttactctttcttacccagcagl680atgattttcatacttctctttacgctcggcl740aagcgtaatcccgcgacgctgcgcaagcccl800atcgatagactttttacgggtatgctgatgl860gcgaatcgtctgtttaaggcggttttgcagl920cagcactcttaccggttcgttttccataccl980gctggcttcgacatagcgggttatcagctc2040
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是包括以下幾個(gè)步驟(1)阪崎腸桿菌的培養(yǎng)；(2)制備阪崎腸桿菌基因組DNA;(3)構(gòu)建阪崎腸桿菌重組質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；(4)構(gòu)建ompA內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒，與目的基因在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系， 排除假陰性；(5)建立分子信標(biāo)熒光定量技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的方法，優(yōu)化反應(yīng)條件；(6)對(duì)3種從嬰兒配方奶粉中高效提取阪崎腸桿菌的方法進(jìn)行比較；(7)確定分子信標(biāo)熒光定量方法的靈敏度；(8)人工污染樣品，確定檢測(cè)限；(9)實(shí)際檢測(cè)，確定該方法的特異性、靈敏度、符合率。
2.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是 阪崎腸桿菌基因所包含的ompA基因的核苷酸序列為ccgggctaaaaattcactcaagaatggtgcattaattgtttttaggataaatcctggtac60agatttgttctcgcgctctgcgttagagtgattgtggcgaatgaacggccagacgggcga120tttcgtccggtttcacactttacgagtgtttaaaattgccgcaaaaatgttaaattttgc180tttcgcaagttgttttttttcatatgcctgacggacttcacacttgtaagtttccaacta240cgttgtagactttacctcgccagggtgctc3. C 3.3. 3.3.3. Ccgacaatatcggtagagtaa300ccattgagctataaccccggtgaaggatttaaccgtgaacttttcctcccggaaaagcgc360atggcctttttggatgataacgaggcgcaaaaaatgaaaaagacagctatcgcgattgca420gtggcactggctggcttcgctaccgtagcgcaggccgcaccgaaagataacacctggtat480gcaggcggcaaactgggctggtcccagttccacgataccggttttattcctaacgacggt540ccgactcacgaaagccagctgggcgcaggcgcgttcggtggttaccaggttaacccgtac600gttggcttcgaaatgggctacgactggctgggccgcatgccgtataaaggcgacactgta660aacggcgctttcaaagctcagggcgtacagctgaccgctaaactgggttacccggtaacc720gacgatctggacgtttacacCCgtCtgggCggcatggtatggcgtgctgattcctcttct780aacatcgctggcgacgaccacgacaccggcgtttctcctgtattcgcaggcggcgttgag840tgggcaatgactcgcgacatcgctacccgtctggaataccagtgggttaacaacatcggc900gacgcacagaCtgttggCgCgcgtccggacaacggcatgctgagcgtaggtgtttcctac960cgtttcggtcagcaggaagatgcagctccggttgtagctccggctccggctccggctccgl020gaagtacagaccaagcacttcaccctgaagtctgacgttctgttcaacttcaacaaagctl080accctgaaaccggaaggccagcaggcgctggatcagctgtactctcagctgagcaacctgll40gatccgaaagacggttctgtagtggttctgggcttcaccgaccgtatcggttctgacgctl200tacaaccagggtctgtctgagaaacgtgctcagtctgttgttgactacctgatctccaaal260ggtatcccgtccaacaagatctccgcacgtggtatgggcgaatccaacccggtcactggcl320aacacctgtgacaacgtgaaagctcgtgcagctctgatcgactgcctgggtccggatcgtl380cgcgtagagatcgaagttaaaggcgttaaagacgttgtaactcagccgcaggcttaagttl440atacgttaag aaaaaccccg cccaggcggg gttttttgtt tctggcgttc atgtttctgcl500 cggaataagt tcagagactg gctttgcgcc tgtcatcaac gtctgttgtg ttttcggaagl560 ggtttatcat caccgcaggc atcacatttt gccctgcaat cgctgcgcta tgctccgggcl620 aagcgtgtca gcctgacgtt ttgcggcgcc tcgcccgcgt tactctttct tacccagcagl680 tgcctgcaaa tcctgtttca gcgtcgacat atgattttca tacttctctt tacgctcggcl740 atcttcaatc agctgcacga tggtttctga aagcgtaatc ccgcgacgct gcgcaagcccl800 ggccagtcgc tgccagacca taaactccag atcgatagac tttttacggg tatgctgatgl860 ctcggcatta aaatgccgct tacgacgggc gcgaatcgtc tgtttaaggc ggttttgcagl920 cgccgggttc atatgcttct cgatccagcc cagcactctt accggttcgt tttccataccl980 cagcaagaga tccaccgcct ctttcgctgc gctggcttcg acatagcggg ttatcagctc2040 gccttcg2047
3.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是 內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)序列為ACCGGCGTTTCTCCTGTAggaagatgccatgaagaccaagacacactatcacgctatgcatgcagactgcctg caggaactacggcgatatctCGGCGTTTCTCCTGTATTCGaaaatccggGGACAACGGCATGCTGA
4.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是 PCR反應(yīng)體系05 μ L)為10 XPCR緩沖液2 μ L、引物對(duì)和分子信標(biāo)(ΙΟμπιοΙ/L)各1 μ L、 dNTPs (10mmol/L) 2 μ L、Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) O. 2 μ L、模板 DNA 2μ L./jC 16. 8 μ L。
5.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是 PCR 反應(yīng)條件94°C 3min ；94°C 60s ；60°C 60s, ；40 個(gè)循環(huán)。
6.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是 ompA基因特異性引物序列為5-ACCGGCGTTTCTCCTGTA-3 5-TCAGCATGCCGTTGTCC-3
7.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是 分子信標(biāo)為熒光信號(hào) FAM-ctgcat-CGGCGTTTCTCCTGTATTCG-atgcag-DABCYL 淬滅信號(hào)。
8.一種快速檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR試劑盒，其特征在于包括A、阪崎腸桿菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；B、內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒；C、含有分子信標(biāo)的PCR緩沖液；D、含有Taq酶的儲(chǔ)存液；E、去離子水。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法及試劑盒，通過比較確定從人工污染的嬰兒配方奶粉中高效提取阪崎腸桿菌的方法并進(jìn)行評(píng)價(jià)。以阪崎腸桿菌基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建目的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，并構(gòu)建內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒加到反應(yīng)體系內(nèi)與靶基因共同擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系，排除假陰性。對(duì)熒光定量反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并確定熒光定量方法和人工污染的檢測(cè)限，并進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)速度快，特異性好，使用步驟簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)雙重或多重實(shí)時(shí)PCR，完成多種食源性致病菌的同時(shí)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102127592SQ201010556679
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者唐欣, 張莉, 李雪玲, 樊成, 王慧芳, 舒靜, 蔣宏偉, 趙建設(shè), 陳勇 申請(qǐng)人:陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所