專利名稱：特異性免疫核糖核酸的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療、預(yù)防禽類疾病的特異性免疫核糖核酸的制備及應(yīng)用，屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
畜牧業(yè)是我國國民經(jīng)濟的重要組成部分。目前畜牧業(yè)產(chǎn)值占全國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的三分之一，已成為我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中的支柱產(chǎn)業(yè)，在國民經(jīng)濟中發(fā)揮著越來越重要的作用。而禽類傳染病作為影響畜牧業(yè)健康發(fā)展的重要因素，歷來受到世界各國的重視。禽類疫病一旦爆發(fā)流行，如得不到有效控制和撲滅，就會造成重大的經(jīng)濟損失和公共衛(wèi)生安全事故，影響社會穩(wěn)定。
我國家禽養(yǎng)殖業(yè)受疾病因素的影響每年造成的經(jīng)濟損失占總收入的30%以上，嚴重制約了養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。我國家禽養(yǎng)殖業(yè)主要受到三種疾病形式的威脅①過去已被控制的重大動物傳染病，至今又卷土重來并大面積流行；②由于病原體逃避機體的免疫監(jiān)視而發(fā)生變異，使過去已被基本控制的重大動物傳染病至今又以新的流行特點、新的發(fā)病癥狀在我國流行(如禽流感、雞傳染性支氣管炎等)；③新出現(xiàn)一些過去在我國從未流行的傳染病(如雞傳染性貧血病等)。這種不同疾病的流行形式，使我們顧此失彼和防不勝防。毫無疑問，隨著今后大規(guī)模集約化飼養(yǎng)家禽的發(fā)展，家禽傳染病的發(fā)生和流行的周期會越來越短，對養(yǎng)殖業(yè)所造成的經(jīng)濟損失也會越來越大。因此如何及時控制家禽傳染病的流行，保證我國養(yǎng)殖業(yè)重上新臺階，給動物預(yù)防部門和獸醫(yī)科研人員提出了新的挑戰(zhàn)，但同時又為我們進行生物技術(shù)產(chǎn)品的開發(fā)提供了難得的機遇。
另一方面，由于抗生素、激素飼料的大量使用，我國禽肉、蛋產(chǎn)品藥物殘留嚴重，食品安全亮起紅燈。目前，我國養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶急需有一類能夠替代抗生素施治且能夠滿足食品安全要求、藥效強力而無害無殘留的藥物。采用生物技術(shù)途徑生產(chǎn)生物制劑不失為上策。因為生物產(chǎn)品療效高，且采用純物理方法制備，使這種制劑不含任何潛在的污染成分和藥物殘留問題。
特異性免疫核糖核酸(immune RNA, iRNA)是動物經(jīng)某種病原體的抗原免疫后，從免疫動物的免疫活性細胞(存在于動物脾臟、肝臟、淋巴等臟器)中提取出來的核糖核酸 (RNA)，具有對病原高度的特異性和針對性；它具有傳遞相應(yīng)抗原特異性免疫信息的能力， 因而注入體內(nèi)后，可發(fā)揮對該抗原的殺滅、抑制、中和等免疫清除作用。
iRNA可使末致敏感的淋巴細胞轉(zhuǎn)異性，且不受動物種屬的影響。iRNA的作用發(fā)生迅速，維持時間也較長，可達數(shù)月至一年以上。iRNA具有免疫特異性，能特異地轉(zhuǎn)移供體的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，這種免疫轉(zhuǎn)移無種屬特異性，能在種間交叉轉(zhuǎn)移。由于iRNA是小分子成份(分子量在13500道爾頓左右)，無抗原性，長期應(yīng)用，機體也不產(chǎn)生抗體。
免疫核糖核酸制劑已經(jīng)在治療人類疾病方面得到過應(yīng)用，如乙肝、腫瘤、狂犬病等 (楊琳等，抗狂犬病免疫核糖核酸的分離純化，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)，2010年第30卷第2 期)。經(jīng)檢索，未見現(xiàn)有技術(shù)中有關(guān)治療禽類疾病的特異性免疫核糖核酸相關(guān)的文獻報道。發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)狀況，本發(fā)明目的在于提供一種無毒副作用、原料易得、成本低廉且適合于工業(yè)化生產(chǎn)的能夠用于治療、預(yù)防禽類疾病的特異性免疫核糖核酸的制備；另一目的在于提供一種原料易得、成本低廉、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的特異性免疫核糖核酸的應(yīng)用技術(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)實施方案如下
1、免疫原(疫苗)的制備用國家標(biāo)準病原體毒株接種易感雞胚胎，收獲感染胚液，經(jīng)提純、濃縮、滅活，加MAC進口佐劑乳化而成制得免疫原(疫苗)，然后按程序單一或聯(lián)合免疫健康禽類。
2、禽類免疫根據(jù)不同抗原、不同禽類采用不同的免疫途徑，加強免疫后抽血檢測抗體效價。此處的禽類除來源廣泛的雞、鴨外，還包括鵝、鴿、鵪鶉、火雞、雉雞、鴕鳥、孔雀等野生或飼養(yǎng)的禽鳥類。
現(xiàn)以養(yǎng)殖量和屠宰量最大的雞為例。
用制備的上述雞傳染性新城疫(副粘病毒)疫苗免疫健康雞群，皮下多點注射，每雞1 5ml ；在首次免疫后的第7 20天進行強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 3ml ；在強化免疫后的第7 20天進行再強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 :3ml。
3、特異性免疫核糖核酸的制備免疫動物屠宰后，取脾臟、肝臟等，然后由臟器中制備特異性免疫核糖核酸。
1)粗提脾臟、肝臟、胰臟或淋巴結(jié)等臟器去掉結(jié)締組織及被膜，用生理鹽水洗凈、切碎，洗去血液并擠干。每200g組織加100 300ml鹽水，置高速組織搗碎機中制成勻漿；向上述勻漿中加入苯酚溶液及0. SDS，混勻，置30 70°C水浴振蕩30min并置冰浴冷卻，離心，取上清液置冰浴中。
2)精制在上清中加入一半量的苯酚溶液，室溫下劇烈振蕩，離心，取水相；加2 3倍體積90% 95 %酒精，置冰箱8h，離心，棄上清，沉淀物即為要制備的特異性免疫核糖核酸。
4、檢測取上述沉淀，進行理化、活性檢測。
1)ρΗ值取沉淀溶于IOml蒸餾水中，其pH值應(yīng)為6. 8 8. 0。
2)吸收度用紫外分光光度計檢測，其0擬60/0D280應(yīng)不小于2. 0。
3)DNA含量測定用標(biāo)準DNA作對照，以紫外法測定，DNA含量不大于5%。
4)RNA含量測定按《中國藥典》二部附錄法測定，含量應(yīng)在0.95mg以上。
5)分子量測定以核糖核酸酶A(相對分子質(zhì)量13700)、胰島素(5808)、胸腺肽 al (3108)、生長激素釋放因子(1521)作相對分子質(zhì)量標(biāo)準，制作標(biāo)準曲線，采用高效液相色譜法測定。
6)異常毒性以注射用生理鹽水制成0. 5mg/ml溶液，家兔可靜脈注射，應(yīng)無異常反應(yīng)。
7)無菌檢查溶于6ml無菌水中，分別接種于普通培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)基及霉菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周，應(yīng)無菌生長。
8)活性測定采用白細胞粘附抑制試驗。其原理為正常白細胞在體外培養(yǎng)時，可粘附于玻璃表面，而用iRNA處理過的白細胞，其粘附于玻璃表面的能力則被抑制，測知該粘附抑制率，即知iRNA活性。方法為取綿羊抗凝血，分離白細胞，將白細胞調(diào)節(jié)為在血細胞計數(shù)板上每大格內(nèi)含40 80個細胞的濃度。取細胞懸液，加等體積iRNA溶液，37°C水浴后，移入血細胞計數(shù)板，置37°C溫育后，用生理鹽水沖洗、計數(shù)。同時作正常白細胞(不加 iRNA)對照。計算白細胞粘附抑制率，如大于20%為合格。
將采用本發(fā)明制得的特異性免疫核糖核酸進行臨床試驗，方法及結(jié)果如下
以雞傳染性新城疫病為例。
已被確診患新城疫病的817肉食雞，以死亡、體重減輕、檢出病毒或檢出抗體為判定標(biāo)準，將其分為治愈、有效、無效三個等級進行統(tǒng)計，用制備的抗新城疫的特異性免疫核糖核酸進行緊急預(yù)防與治療實驗，預(yù)防用量為每雞肌注0. 5ml，治療肌注1ml。結(jié)果如下表
表1緊急預(yù)防與治療效果統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.特異性免疫核糖核酸的制備及應(yīng)用，其特征在于(1)、免疫原(疫苗)的制備用國家標(biāo)準病原體毒株接種易感雞胚胎，收獲感染胚液，經(jīng)提純、濃縮、滅活，加MAC進口佐劑乳化而成制得免疫原(疫苗)，然后按程序單一或聯(lián)合免疫健康禽類；用雞傳染性新城疫(副粘病毒)疫苗免疫健康雞群，皮下多點注射，每雞1 5ml ；在首次免疫后的第7 20天進行強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 3ml ；在強化免疫后的第7 20天進行再強化免疫，肌肉注射每雞1. 5 3ml ； (2)、特異性免疫核糖核酸的制備將上述經(jīng)免疫的雞養(yǎng)7 10天后屠宰，取脾臟、肝臟、胰臟或淋巴結(jié)等臟器去掉結(jié)締組織及被膜，用生理鹽水洗凈、切碎，洗去血液并擠干；每200g組織加100 300ml鹽水，置高速組織搗碎機中制成勻漿；向上述勻漿中加入苯酚溶液及0. SDS，混勻，置30 70°C水浴振蕩30min并置冰浴冷卻，離心，取上清液置冰浴中；在上清中加入一半量的苯酚溶液，室溫下劇烈振蕩，離心，取水相； 加2 3倍體積90% 95%酒精，置冰箱8小時，離心，棄上清，沉淀物即為要制備的特異性免疫核糖核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性免疫核糖核酸，其特征在于采用權(quán)利要求1所述的方法制備而得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性免疫核糖核酸的應(yīng)用，其特征在于由于特異性免疫核糖核酸無種屬特異性，因而制備時可以使用成本低廉、飼養(yǎng)量和屠宰量較大的肉食雞作為特異性免疫核糖核酸的來源，而用于治療雞本身及鴨、鵝、鴿、鵪鶉、火雞、雉雞、鴕鳥、孔雀等野生或飼養(yǎng)的禽鳥類的各種疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性免疫核糖核酸(iRNA)的制備及應(yīng)用，屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。該方法用國家標(biāo)準病原體毒株接種易感雞胚胎而制得免疫原(疫苗)，然后按程序單一或聯(lián)合免疫健康禽類，收集其健康的脾臟、肝臟等臟器，經(jīng)過粗提、精制，即由臟器中獲取針對禽類各種疾病的特異性免疫核糖核酸。本發(fā)明制備的特異性免疫核糖核酸使用后具有療效顯著、作用迅速、無毒副作用的特點，容易保存，便于運輸，生產(chǎn)工藝簡單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/11GK102477425SQ20101055712
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者曹吉祥 申請人:曹吉祥