專利名稱：一種植物甾醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為add的方法及所用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及到一種植物留醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD 的方法及所用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
雄甾二烯二酮(簡(jiǎn)稱ADD)是一種合成甾體激素類藥物的重要中間體，通過(guò)它可合成包括地塞米松、潑尼松龍、倍他米松等10余種臨床上廣泛使用的激素藥物。ADD的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下面式I所示。
式I
合成雄留二烯二酮目前有兩種方法一是用薯蕷皂甙為起始原料，經(jīng)過(guò)11步化學(xué)合成反應(yīng)得到。二是由植物留醇經(jīng)過(guò)微生物轉(zhuǎn)化直接得到ADD。其中微生物轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)條件溫和，節(jié)能環(huán)保等方面優(yōu)勢(shì)，決定其是否具有經(jīng)濟(jì)性包括反應(yīng)底物濃度、轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化特異性，轉(zhuǎn)化特異性是指在轉(zhuǎn)化過(guò)程中ADD和副產(chǎn)物AD(雄留-4-烯-3，17-二酮)的比值，其比值越高，說(shuō)明其轉(zhuǎn)化特異性愈好。美國(guó)專利USP4345(^9描述了采用分枝桿菌變種 (Mycobacterium phlei)轉(zhuǎn)化得到AD和ADD ；美國(guó)專利USP7259005描述了采用另一種分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)轉(zhuǎn)化植物留醇得到AD和ADD，但其轉(zhuǎn)化效率和特異性均不高，轉(zhuǎn)化率最高僅有64%，轉(zhuǎn)化后發(fā)酵液中AD和ADD的最高濃度僅有2177mg/L。從經(jīng)濟(jì)角度計(jì)算，上述技術(shù)指標(biāo)顯示其無(wú)工業(yè)價(jià)值。
如何提高由植物留醇經(jīng)過(guò)微生物轉(zhuǎn)化直接得到ADD的經(jīng)濟(jì)性成為其能否完全替代化學(xué)合成法的關(guān)鍵。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種在植物留醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供一種植物留醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法。
具體而言，本發(fā)明提供
(1) 一種在植物甾醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質(zhì)
葡萄糖0.l-100g/L,
黃豆粉10-100g/L，
磷酸二氫鉀0.5-10g/L,
碳酸鈣0.l-10g/L，
硫酸亞鐵0·001-0. 01g/L,
氯化錳0.0001-0. 001g/L，以及
植物甾醇10-100g/L；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.0-8.0 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。
(2)根據(jù)(1)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質(zhì)
葡萄糖25g/L，
黃豆粉40g/L，
磷酸二氫鉀2g/L，
碳酸鈣lg/L，
硫酸亞鐵0.0051g/L,
氯化錳0.0005g/L,以及
植物甾醇50g/L；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7. 2 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。
(3)根據(jù)⑴或⑵所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述植物甾醇助溶劑或分散劑為聚乙二醇、葵花油、或乙二醇。
(4) 一種植物留醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法，該方法包括，在發(fā)酵培養(yǎng)分枝桿菌 (Mycobacterium)時(shí)使用根據(jù)(1)至(3)中任一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
(5)根據(jù)中所述的方法，在該方法中，在種子罐種齡達(dá)到30-50小時(shí)的時(shí)候進(jìn)行接種，接種量為5-10% (ν/ν)；然后，在的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，并將溶氧控制為 35-80%。
(6)根據(jù)(5)中所述的方法，在該方法中，在所述種子罐種齡達(dá)到42小時(shí)的時(shí)候進(jìn)行接種，接種量為5% (ν/ν)；然后，在30°C的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-45%。
本發(fā)明致力于提高植物留醇通過(guò)生物轉(zhuǎn)化合成雄留二烯二酮轉(zhuǎn)化效率的方法。經(jīng)過(guò)本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)涉及到發(fā)酵工藝的設(shè)計(jì)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵過(guò)程包括PH、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣、補(bǔ)料、溫度等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，可顯著提高轉(zhuǎn)化效率。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，發(fā)酵底物濃度可達(dá)到50g/L，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到70%，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中ADD與AD的重量比為98 2，顯著高于公開報(bào)道的技術(shù)指標(biāo)。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施方式
的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基包含有溶解或分散在水中的下列物質(zhì)葡萄糖0. I-IOOg/L，優(yōu)選為25g/L ；黃豆粉10-100g/L，優(yōu)選為40g/L ；磷酸二氫鉀0. 5-lOg/L，優(yōu)選為2g/L ； 碳酸鈣:0. l-10g/L，優(yōu)選為lg/L ；硫酸亞鐵0. 001-0. 01g/L，優(yōu)選為0. 0051g/L ；氯化錳 0. 0001-0. 001g/L，優(yōu)選為0. 0005g/L ；以及植物甾醇:10_100g/L，優(yōu)選為50g/L ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為5. 0-8. 0，優(yōu)選為7. 2 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物留醇助溶劑或分散劑，特別是聚乙二醇、葵花油、乙二醇，更特別的是葵花油。
在本文中，黃豆粉也稱為大豆粉，是把黃豆經(jīng)粉碎制備而得的。在本發(fā)明中，黃豆粉優(yōu)選為通過(guò)80目篩的細(xì)粉。
在本文中，植物甾醇為主要包括β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的混合物。其中， β -谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的母核相同，其結(jié)構(gòu)式分別為
在本文中，植物留醇助溶劑或分散劑是指為了增加植物留醇在發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶解度或分散程度而添加的助劑，包括聚乙二醇、葵花油、乙二醇等。
本發(fā)明的植物甾醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法包括，在發(fā)酵培養(yǎng)分枝桿菌 (Mycobacterium)時(shí)使用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基。
優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，在種子罐種齡達(dá)到30-50小時(shí)的時(shí)候進(jìn)行接種，接種量為5-10% (ν/ν)；然后，在的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-80%。更優(yōu)選的是，在所述種子罐種齡達(dá)到42小時(shí)的時(shí)候進(jìn)行接種，接種量為5% (ν/ν)；然后，在 30°C的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-45%。
在本文中，溶氧是指發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵液中的氧濃度與發(fā)酵初始時(shí)發(fā)酵液中的氧濃度的百分比值(即DO值)。
本發(fā)明涉及的發(fā)酵工藝技術(shù)特征描述如下
(1)本發(fā)明改進(jìn)了生物轉(zhuǎn)化體系。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，植物留醇微溶于水，必須要增加其在水中的溶解度，才能提高轉(zhuǎn)化效率。傳統(tǒng)的反應(yīng)體系是用雙水相系統(tǒng)和環(huán)糊5精包埋等技術(shù)，盡管轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 80%以上，底物植物留醇加入量?jī)H0. 1-0.8%，發(fā)酵液中 ADD產(chǎn)量很少，發(fā)酵單位很低，仍無(wú)法工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中，有的采用植物油如葵花油進(jìn)行分散，增加底物植物留醇加入量。事實(shí)上，后期純化很困難，因?yàn)楫a(chǎn)物ADD很容易溶解于植物油中，需要用柱層析解決。本發(fā)明開發(fā)一種生物轉(zhuǎn)化體系，不在培養(yǎng)基中添加任何植物甾醇助溶劑或分散劑，讓植物留醇懸浮于培養(yǎng)基中直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在保證轉(zhuǎn)化效率前提下， 又為發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)品分離純化帶來(lái)便利。
( 本發(fā)明優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基。對(duì)包括碳源、氮源、金屬離子等營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行優(yōu)篩， 確定了以葡萄糖為碳源、以硝酸銨為氮源、添加鈣鹽、氯化鎂等作為金屬離子試劑，可促進(jìn)植物甾醇轉(zhuǎn)化為ADD。
C3)本發(fā)明優(yōu)化了發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵工藝控制參數(shù)。對(duì)包括種齡、種量、發(fā)酵溫度、 PH、溶氧、泡沫控制方法等發(fā)酵關(guān)鍵控制參數(shù)優(yōu)化，提高了 ADD的轉(zhuǎn)化效率。
由本發(fā)明得到的發(fā)酵液中ADD的測(cè)定方法如下所示
測(cè)定條件
色譜柱Kromasil C18 5ym 200X4. 6mm (可購(gòu)自日本島津公司)；
流動(dòng)相甲醇水=80 20 (V/V)；
流速1. Oml/min ；
檢測(cè)波長(zhǎng)242nm。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定配制一系列不同濃度的ADD標(biāo)準(zhǔn)溶液(50-500 μ g/ml)，分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的過(guò)濾液20 μ 1注入高效液相色譜儀中，測(cè)定其吸收峰面積，然后對(duì)濃度 (Y)和吸收峰面積(X)進(jìn)行一元線性回歸，得到一元線性回歸方程。
ADD含量計(jì)算方法將待測(cè)樣品制成合適濃度(50-500 μ g/ml)的甲醇溶液，用 0. 45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾，準(zhǔn)確吸取濾液20 μ 1注入HPLC中，記錄色譜圖，將ADD峰面積代入上述的回歸方程中，計(jì)算得到樣品中ADD量。
下述實(shí)施例1中使用的分枝桿菌菌種來(lái)源于美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)，該菌種于 1959年提交永久保藏，保藏號(hào)為NCTC1542，目前無(wú)任何限制發(fā)放給公眾。
實(shí)施例1 植物甾醇生物轉(zhuǎn)化為ADD的發(fā)酵、提取工藝
ADD來(lái)自于分枝桿菌培養(yǎng)液，其培養(yǎng)、提取和純化步驟如下
(1)種子培養(yǎng)
一級(jí)種子瓶、二級(jí)種子罐的培養(yǎng)基的配比和配制方法相同，液體培養(yǎng)基組成如表1 所示。
表1種子培養(yǎng)基組成(克/每升)
權(quán)利要求
1.一種在植物留醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質(zhì)葡萄糖0. l-100g/L, 黃豆粉10-100g/L， 磷酸二氫鉀0. 5-10g/L, 碳酸鈣0. l-10g/L, 硫酸亞鐵0. 001-0. 01g/L, 氯化錳0. 0001-0. 001g/L,以及植物甾醇:10-100g/L；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為5. 0-8. 0 ；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含有溶解或分散在水中的下列物質(zhì) 葡萄糖25g/L，黃豆粉40g/L， 磷酸二氫鉀2g/L， 碳酸鈣lg/L， 硫酸業(yè)鐵0. 0051g/L, 氯化錳0. 0005g/L,以及植物甾醇50g/L ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中所述植物留醇助溶劑或分散劑為聚乙二醇、葵花油、或乙二醇。
4.一種植物留醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法，該方法包括，在發(fā)酵培養(yǎng)分枝桿菌 (Mycobacterium)時(shí)使用根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，在該方法中，在種子罐種齡達(dá)到30-50小時(shí)的時(shí)候進(jìn)行接種，接種量為5-10% (ν/ν)；然后，在的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，并將溶氧控制為 35-80%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的方法，在該方法中，在所述種子罐種齡達(dá)到42小時(shí)的時(shí)候進(jìn)行接種，接種量為5% (ν/ν)；然后，在30°C的溫度下進(jìn)行發(fā)酵，并將溶氧控制為35-45%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物甾醇經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化為ADD的方法及所用培養(yǎng)基。其中，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基包含有溶解或分散在水中的下列物質(zhì)葡萄糖0.1-100g/L，黃豆粉10-100g/L，磷酸二氫鉀0.5-10g/L，碳酸鈣0.1-10g/L，硫酸亞鐵0.001-0.01g/L，氯化錳0.0001-0.001g/L，以及植物甾醇10-100g/L；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.0-8.0；并且，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中不含有植物甾醇助溶劑或分散劑。采用本發(fā)明的方法及培養(yǎng)基，植物甾醇轉(zhuǎn)化為ADD的轉(zhuǎn)化率更高；反應(yīng)底物的濃度更高，使得轉(zhuǎn)化效率也得到提高；轉(zhuǎn)化特異性更高，簡(jiǎn)化了分離提純工藝。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102477404SQ20101055712
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者何勇崴, 何晶, 劉省偉, 岳光, 趙德 申請(qǐng)人:北大國(guó)際醫(yī)院集團(tuán)有限公司, 北大國(guó)際醫(yī)院集團(tuán)重慶大新藥業(yè)股份有限公司, 北大方正集團(tuán)有限公司