專利名稱：三元復(fù)合物和含有三元復(fù)合物的液體及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種三元復(fù)合物，一種含有三元復(fù)合物的液體，一種含有三元復(fù)合物的液體的制備方法以及三元復(fù)合物與含有三元復(fù)合物的液體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療在癌癥治療、病毒感染和心血管疾病的治療上具有很好的應(yīng)用前景，但基因治療需要安全、有效的載體。合成的陽離子聚合物作為基因的非病毒載體得到了廣泛的關(guān)注，如聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖(CS)、聚賴氨酸(PLL)、聚β-氨基酯(Poly(i3-amino esters)，PBAEs)，聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物(PAMAM)、聚二甲胺基丙烯酸乙酯(PDMAEMA) 等陽離子聚合物或含有這些陽離子聚合物鏈的共聚物，通過靜電相互作用與帶負(fù)電荷的 DNA或RNA復(fù)合形成納米粒子。此外，還有表面帶有正電荷的納米金顆粒、納米硅膠顆粒等也可作為DNA或RNA的載體。上述陽離子聚合物或納米粒與DNA或RNA復(fù)合形成的納米粒子可以促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)染效果，但同時(shí)存在復(fù)合物表面正電性太強(qiáng)導(dǎo)致的毒性較大、體內(nèi)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間短等問題。研究表明，在上述陽離子聚合物或納米粒上引入聚乙二醇段可以大大提高生物相容性、降低納米復(fù)合體系的毒性，延長(zhǎng)納米粒子在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間等，但同時(shí)也導(dǎo)致納米復(fù)合體系的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率大大下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺陷，提供一種兼具低毒和高轉(zhuǎn)染效率的三元復(fù)合物及其液體和制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種三元復(fù)合物，其特征在于，該三元復(fù)合物含有A組分，B組分和 C組分，A組分為帶有正電荷的載體，B組分為帶有負(fù)電荷的核酸，C組分為帶有負(fù)電荷的共聚物。本發(fā)明還提供了一種含有三元復(fù)合物的液體，其特征在于，該含有三元復(fù)合物的液體含有水和上述三元復(fù)合物。此外，本發(fā)明還提供了一種含有三元復(fù)合物的液體的制備方法，其特征在于，該方法包括使Y物質(zhì)的水溶液與D物質(zhì)的水溶液混合，并將所得的混合物與M物質(zhì)的水溶液混合；其中，Y物質(zhì)為載體，所述載體能夠在水溶液中形成帶有正電荷的基團(tuán)；D物質(zhì)為核酸；M 物質(zhì)為能夠在水溶液中形成帶有負(fù)電荷基團(tuán)的共聚物。以及提供了由上述方法制備得到的含有三元復(fù)合物的液體。本發(fā)明還提供了上述三元復(fù)合物或含有三元復(fù)合物的液體在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、疾病的預(yù)防、診斷和基因治療中的應(yīng)用。以及上述三元復(fù)合物或含有三元復(fù)合物的液體在制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，制備疾病的預(yù)防、診斷或基因治療的藥物中的應(yīng)用。對(duì)本發(fā)明提供的三元復(fù)合物和含有三元復(fù)合物的液體進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)三元復(fù)合物的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于二元復(fù)合物；對(duì)本發(fā)明提供的三元復(fù)合物和含有三元復(fù)合物的液體進(jìn)行HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，證實(shí)三元復(fù)合物相比二元復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率也有較大的提高。并且，對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式制得的含有三元復(fù)合物的液體進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)，證實(shí)由本發(fā)明的三元復(fù)合物和/或含有三元復(fù)合物的液體作為核酸的傳遞系統(tǒng)，能夠高效地、 高特異性的使核酸進(jìn)入靶細(xì)胞，并能夠保證傳遞的核酸的干擾活性。由此可見，本發(fā)明提供的三元復(fù)合物和含有三元復(fù)合物的液體能夠廣泛的用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染、疾病的預(yù)防、診斷和基因治療中，同時(shí)能夠廣泛的用于制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，制備疾病的預(yù)防、診斷或基因治療的藥物中。


圖1為本發(fā)明四種實(shí)施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元復(fù)合物的液體和六組對(duì)照組的凝膠電泳圖。圖2為本發(fā)明一種實(shí)施方式中PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元復(fù)合物的透射電鏡照片。圖3為本發(fā)明兩種實(shí)施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元復(fù)合物的液體和四組對(duì)照組的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的柱狀圖。圖4為本發(fā)明四種實(shí)施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/D/M-Ι三元復(fù)合物的液體和六組對(duì)照組的HeLa細(xì)胞毒性的柱狀圖。圖5為本發(fā)明兩種實(shí)施方式中的含有PCL-g-PDMAEMAl/siRNAl/M-2三元復(fù)合物的液體和對(duì)照組抑制HeLa-Luc細(xì)胞熒光素酶蛋白表達(dá)效率的柱狀圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種三元復(fù)合物，其特征在于，該三元復(fù)合物含有A組分，B組分和 C組分，A組分為帶有正電荷的載體，B組分為帶有負(fù)電荷的核酸，C組分為帶有負(fù)電荷的共聚物。根據(jù)本發(fā)明，所述共聚物可以為本領(lǐng)域各種帶有負(fù)電荷的共聚物，只要能夠與A 組分通過靜電相互作用結(jié)合，形成所述的三元復(fù)合物即可，為了使形成的三元復(fù)合物具備更好的生物活性，優(yōu)選地，C組分為聚谷氨酸與聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸與一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇形成的共聚物根據(jù)本發(fā)明，所述帶有正電荷的載體，即A組分優(yōu)選為帶有正電荷的納米顆粒和/ 或帶有正電荷的陽離子聚合物，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述帶有正電荷的納米顆粒和帶有正電荷的陽離子聚合物均含有基團(tuán)Z，基團(tuán)Z能夠結(jié)合氫離子并形成帶有正電荷的基團(tuán)，并且基團(tuán) Z中的至少一部分與氫離子結(jié)合，形成了所述帶有正電荷的基團(tuán)，A組分帶有的正電荷由所述帶有正電荷的基團(tuán)提供；B組分帶有的負(fù)電荷由核酸中的磷酸二酯鍵失去至少部分氫離子后得到的基團(tuán)提供，其中，磷酸二酯鍵為本領(lǐng)域公知的概念，即一種化學(xué)基團(tuán)，指一分子磷酸與兩分子醇(羥基)酯化形成的兩個(gè)酯鍵，在水溶液中，至少部分磷酸上羥基的氫原子會(huì)解離，從而使核酸帶有負(fù)電荷；優(yōu)選情況下，C組分帶有的負(fù)電荷由所述共聚物中的羧基失去至少部分氫離子后得到的基團(tuán)提供，所述羧基為聚谷氨酸上沒有用于聚合的羧基，在水溶液中，至少部分所述羧基能夠電離，從而使C組分帶有負(fù)電荷。需要明確的是，本發(fā)明中所述共聚物中羧基的摩爾數(shù)指呈電離狀態(tài)的羧基的摩爾數(shù)與沒有呈電離狀態(tài)的羧基的摩爾數(shù)之和，即對(duì)應(yīng)于共聚物中谷氨酸結(jié)構(gòu)單元的摩爾數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，所述基團(tuán)Z的摩爾數(shù)(記為N)、核酸中的核苷酸的摩爾數(shù)(記為P) 與所述共聚物中羧基的摩爾數(shù)(記為C)的比例，簡(jiǎn)稱為N/P/C值，可以在較大的范圍內(nèi)變化，為了獲得更好的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率并兼顧細(xì)胞相容性(即降低細(xì)胞毒性)，所述N/P/C值優(yōu)選為1-50 1 1-50，進(jìn)一步優(yōu)選情況下，所述N/P/C值為1-30 1 1-30，并且，在優(yōu)選條件下，所述A組分帶有的正電荷、B組分帶有的負(fù)電荷與C組分帶有的負(fù)電荷使得三元復(fù)合物的kta電位為-20mV到30mV，進(jìn)一步優(yōu)選為-15mV到20mV。根據(jù)本發(fā)明，所述基團(tuán)Z為任何可以實(shí)現(xiàn)能夠結(jié)合氫離子并帶有正電荷的基團(tuán)， 如含有電負(fù)性較強(qiáng)的氮原子的氨基，具體地，本發(fā)明中所述基團(tuán)Z優(yōu)選為伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選為叔氨基。此外，本發(fā)明中所述陽離子聚合物還包括目前商品化的各種陽離子聚合物型轉(zhuǎn)染試劑，如陽離子脂質(zhì)體和Transfectam試劑等，這里需要特別說明的是，本發(fā)明中，利用商購的陽離子脂質(zhì)體和Transfectam試劑制備三元復(fù)合物的過程，所述陽離子脂質(zhì)體和 Transfectam試劑均按照商購的試劑盒中的操作規(guī)程，根據(jù)所帶有的N原子或正電荷的數(shù)目，得到滿足一定N/P/C值的三元復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明，所述帶有正電荷的納米顆粒作為核酸的載體，優(yōu)選顆粒直徑為 10-400納米；所述帶有正電荷的納米顆?？梢詾楸绢I(lǐng)域各種能夠在溶液中形成帶有正電荷基團(tuán)的納米顆粒，如通過各種方式形成的帶有正電荷的金納米顆粒和/或帶有正電荷的硅膠納米顆粒，當(dāng)所述帶有正電荷的納米顆粒為金納米顆粒和/或帶有正電荷的硅膠納米顆粒時(shí)，優(yōu)選顆粒直徑為10-200納米，最優(yōu)選為10-100納米；本發(fā)明中所述帶有正電荷的納米顆粒通過在羧基化金納米顆粒的表面復(fù)合陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺而形成。根據(jù)本發(fā)明，所述陽離子聚合物的數(shù)均分子量可以在較大范圍內(nèi)變化，優(yōu)選地，所述陽離子聚合物的數(shù)均分子量為lKDa-150KDa，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述陽離子聚合物的數(shù)均分子量為5KDa-120KDa，最優(yōu)選地，所述陽離子聚合物的數(shù)均分子量為lOKDa-lOOKDa。本發(fā)明中，陽離子聚合物沿用本領(lǐng)域的常規(guī)定義，指鏈上有陽離子基團(tuán)的聚合物， 一般都指水溶性聚合物。常用的陽離子聚合物包括聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚脒、聚乙烯胺、陽離子聚丙烯酰胺等。根據(jù)本發(fā)明，所述陽離子聚合物作為核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體，所述陽離子聚合物可以為本領(lǐng)域各種能夠作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染用載體的陽離子聚合物，優(yōu)選地，所述陽離子聚合物選自聚乙烯亞胺、陽離子脂質(zhì)體、聚氨基酯、殼聚糖、殼聚糖季銨鹽、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、兩親性梳形接枝共聚物和陽離子共聚物中的一種或多種，所述陽離子共聚物為聚乙烯亞胺、聚β-氨基酯、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、兩親性梳形接枝共聚物中的至少兩種形成的共聚物；
C—O—R2-NH2^R4式(1)， ——C -C——
I
R1其中，隊(duì)為H或C1-C4的烷基，優(yōu)選地，隊(duì)為H或甲基；R2為C1-C4的亞烷基，優(yōu)選地，&為C1-C2的亞烷基；民和R4各自獨(dú)立地為C1-C4的烷基，優(yōu)選地，R3和R4各自獨(dú)立地為甲基或乙基，進(jìn)一步優(yōu)選地， 和禮同時(shí)為甲基或乙基。根據(jù)本發(fā)明，在滿足能夠在水溶液中形成帶有正電荷的基團(tuán)的前提下，所述兩親性梳形接枝共聚物可以為多種含有疏水性主鏈和親水性側(cè)鏈的兩親性梳形共聚物，本發(fā)明對(duì)所述兩親性梳形共聚物的制備方法沒有特別的限定，優(yōu)選地，所述兩親性梳形共聚物是在原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)條件下，將含溴官能團(tuán)的聚酯與至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)接觸得到的，所述含溴官能團(tuán)的聚酯與至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)的摩爾比可以為本領(lǐng)域常規(guī)的比例，優(yōu)選地，所述含溴官能團(tuán)的聚酯與至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)的摩爾比為 1 1-100，進(jìn)一步優(yōu)選為 1 30-70。其中，所述至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)為具有式(2)所示結(jié)構(gòu)的單體、含有式(1) 所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物和聚乙烯亞胺中的一種或多種，即所述含溴官能團(tuán)的聚酯可以與單體進(jìn)行反應(yīng)也可以與聚合物進(jìn)行反應(yīng)，H2C=C-C-O-R2-N^ 式(2)，其中，隊(duì)為H或C1-C4的烷基，優(yōu)選地，隊(duì)為H或甲基，&為C1-C4的亞烷基，優(yōu)選地，&為C1-C2的亞烷基；民和R4各自獨(dú)立地為C1-C4的烷基，優(yōu)選地，R3和R4各自獨(dú)立地為甲基或乙基，進(jìn)一步優(yōu)選地， 和禮同時(shí)為甲基或乙基。根據(jù)本發(fā)明，所述含溴官能團(tuán)的聚酯可以為本領(lǐng)域各種能夠作為原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)的引發(fā)劑的大分子聚酯，優(yōu)選地，所述含溴官能團(tuán)的聚酯的數(shù)均分子量為500-30000，進(jìn)一步優(yōu)選為1000-15000，本發(fā)明中，所述含溴官能團(tuán)的聚酯優(yōu)選為 Y-(2-溴-甲基丙酸酯)_己內(nèi)酯的均聚物、Y-(2-溴-甲基丙酸酯)-己內(nèi)酯與內(nèi)酯的共聚物和Y-(2-溴-甲基丙酸酯)-己內(nèi)酯與交酯的共聚物中的一種或多種，其中，所述內(nèi)酯為β-羥基丁酯和/或β-羥基戊酯，所述交酯為乙交酯和/或丙交酯，進(jìn)一步優(yōu)選地，所述含有溴官能團(tuán)的聚酯為Y-(2-溴-甲基丙酸酯)_己內(nèi)酯的均聚物。根據(jù)本發(fā)明，所述兩親性梳形接枝共聚物在制備三元復(fù)合物的過程中，要先經(jīng)過一個(gè)將其制備成為納米顆粒的過程，由于兩親性梳形接枝共聚物帶有親水性側(cè)鏈和疏水性主鏈，因此，將其溶于有機(jī)溶劑后，再緩慢滴加到水相體系中，待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)聚合物溶液的PH值至中性，即可得到疏水性內(nèi)核，親水性外殼的納米顆粒。為了使配制好的兩親性梳形接枝共聚物能夠更穩(wěn)定的保存，優(yōu)選將配制好的聚合物溶液用0. 22 微米的Millipore無菌膜過濾除菌后放于4°C保存?zhèn)溆?。需要特別明確的是，由于兩親性梳形接枝共聚物與其他陽離子聚合物都屬于聚合物類，而且需要一定的處理步驟才會(huì)成為顆粒狀，因此，在本申請(qǐng)中仍將其劃分為陽離子聚合物的類別中。但是，由于其預(yù)先形成了納米尺度內(nèi)的顆粒，能夠?qū)ζ漕w粒的直徑進(jìn)行測(cè)定，因此，本申請(qǐng)中所述帶有正電荷的納米顆粒的顆粒直徑范圍包括兩親性梳形接枝共聚物所形成的納米顆粒的顆粒直徑，本發(fā)明中所述兩親性梳形接枝共聚物形成的納米顆粒的直徑優(yōu)選為30-360納米。根據(jù)本發(fā)明，所述原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)的條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，如氮?dú)獗Ｗo(hù)下，聚合溫度為30-70°C，聚合時(shí)間為10-18小時(shí)。本發(fā)明中所述核酸可以為寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，所述核酸為本領(lǐng)域公知的概念，由核苷酸單體聚合而成，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，所述核酸可以為任何長(zhǎng)度的核酸，優(yōu)選的所述核酸的分子量為1XIO3-IX IO8,進(jìn)一步優(yōu)選為5 X IO3-I X IO70本發(fā)明中，所述核酸可以為核糖核酸，也可以為脫氧核糖核酸，可以為單鏈核酸也可以為雙鏈核酸、三鏈核酸，或者由核糖核酸與脫氧核糖核酸組成的雜合鏈核酸，只要具備基本的核苷酸單位，都可以適用于本發(fā)明。在核酸藥物應(yīng)用領(lǐng)域，所述B組分優(yōu)選為核糖核酸，進(jìn)一步優(yōu)選為雙鏈核糖核酸，特別是帶有1-10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈區(qū)的雙鏈核糖核酸，即雙鏈核糖核酸中除了雙鏈區(qū)域外，在其中一條鏈的5’端上游或3’端下游還有1-10 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈區(qū)域，所述單鏈區(qū)域可以為核糖核酸，也可以為脫氧核糖核酸，滿足上述特征的最典型的結(jié)構(gòu)即為小干擾核酸序列。此外，所述B組分可以為部分經(jīng)過化學(xué)修飾的核糖核酸，所述部分經(jīng)過化學(xué)修飾的核糖核酸被修飾的方式可以為本領(lǐng)域各種對(duì)核酸進(jìn)行修飾的方式，如核糖的修飾、堿基的修飾和磷酸二酯鍵的修飾中的至少一種。所述核糖修飾是指對(duì)核苷酸戊糖中2’-0H的修飾，即，在核糖的羥基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修飾，如式C3)所示；2’-氧甲基修飾，如式⑷所示；2’ -氧亞乙基甲氧基修飾，如式(5)所示；2，4’ - 二硝基苯酚修飾，如式(6)所示；鎖核酸_，如式(7)所示；2’-氨基修飾，如式(8)所示；2’-脫氧修飾，如式(9)所示。
權(quán)利要求
1.一種三元復(fù)合物，其特征在于，該三元復(fù)合物含有A組分，B組分和C組分，A組分為帶有正電荷的載體，B組分為帶有負(fù)電荷的核酸，C組分為帶有負(fù)電荷的共聚物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三元復(fù)合物，其中，所述共聚物為聚谷氨酸與聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸與一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇形成的共聚物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三元復(fù)合物，其中，A組分為帶有正電荷的納米顆粒和/或帶有正電荷的陽離子聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三元復(fù)合物，其中，所述帶有正電荷的納米顆粒和帶有正電荷的陽離子聚合物均含有基團(tuán)Z，基團(tuán)Z能夠結(jié)合氫離子并形成帶有正電荷的基團(tuán)，并且基團(tuán)Z中的至少一部分與氫離子結(jié)合，形成了所述帶有正電荷的基團(tuán)，A組分帶有的正電荷由所述帶有正電荷的基團(tuán)提供。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三元復(fù)合物，其中，B組分帶有的負(fù)電荷由核酸中的磷酸二酯鍵失去至少部分氫離子后得到的基團(tuán)提供。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三元復(fù)合物，其中，C組分帶有的負(fù)電荷由所述共聚物中的羧基失去至少部分氫離子后得到的基團(tuán)提供。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的三元復(fù)合物，其中，基團(tuán)Z的摩爾數(shù)、核酸中的核苷酸的摩爾數(shù)與所述共聚物中羧基的摩爾數(shù)的比例為1-50 1 1-50，所述A組分帶有的正電荷、B 組分帶有的負(fù)電荷與C組分帶有的負(fù)電荷使得三元復(fù)合物的kta電位為-20mV到30mV。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的三元復(fù)合物，其中，基團(tuán)Z的摩爾數(shù)、核酸中的核苷酸的摩爾數(shù)與所述共聚物中羧基的摩爾數(shù)的比例為1-30 1 1-30，所述A組分帶有的正電荷、B 組分帶有的負(fù)電荷與C組分帶有的負(fù)電荷使得三元復(fù)合物的kta電位為-15mV到20mV。
9.根據(jù)權(quán)利要求4、7-8中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物，其中，基團(tuán)Z為伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-4、7-8中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物，其中，所述帶有正電荷的納米顆粒的顆粒直徑為10-400納米，所述帶有正電荷的納米顆粒為帶有正電荷的金納米顆粒和/或帶有正電荷的硅膠納米顆粒。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三元復(fù)合物，其中，所述陽離子聚合物的數(shù)均分子量為 lKDa-150KDa。
12.根據(jù)權(quán)利要求3-4、7-8和11中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物，其中，所述陽離子聚合物選自聚乙烯亞胺、陽離子脂質(zhì)體、聚β-氨基酯、殼聚糖、殼聚糖季銨鹽、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、兩親性梳形接枝共聚物和陽離子共聚物中的一種或多種，所述陽離子共聚物為聚乙烯亞胺、聚氨基酯、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、兩親性梳形接枝共聚物中的至少兩種形成的共聚物；
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的三元復(fù)合物，其中，所述兩親性梳形接枝共聚物是在原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)條件下，由含溴官能團(tuán)的聚酯與至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)接觸得到的，所述至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)為具有式(2)所示結(jié)構(gòu)的單體、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物和聚乙烯亞胺中的一種或多種，
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的三元復(fù)合物，其中，所述含溴官能團(tuán)的聚酯為 Y-(2-溴-甲基丙酸酯)_己內(nèi)酯的均聚物、Y-(2-溴-甲基丙酸酯)-己內(nèi)酯與內(nèi)酯的共聚物和Y-(2-溴-甲基丙酸酯)-己內(nèi)酯與交酯的共聚物中的一種或多種，其中，所述內(nèi)酯為β-羥基丁酯、β-羥基戊酯和己內(nèi)酯中的一種或多種，所述交酯為乙交酯和/或丙交酯。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三元復(fù)合物，其中，所述B組分為核糖核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的三元復(fù)合物，其中，所述B組分為雙鏈核糖核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的三元復(fù)合物，其中，所述B組分為帶有1-10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈區(qū)的雙鏈核糖核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物，其中，所述B組分為部分經(jīng)過化學(xué)修飾的核糖核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的三元復(fù)合物，其中，所述部分經(jīng)過化學(xué)修飾的核糖核酸修飾的類型為核糖的修飾、堿基的修飾和磷酸二酯鍵的修飾中的至少一種。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的三元復(fù)合物，其中，所述部分經(jīng)過化學(xué)修飾的核糖核酸所含有的修飾基團(tuán)為氟代基團(tuán)、硫代基團(tuán)、烷氧基團(tuán)、烷基基團(tuán)、酰基基團(tuán)和氨基基團(tuán)中的至少一種。
21.根據(jù)權(quán)利要求1、5、15-17、19-20中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物，其中，所述核酸為寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，所述核酸的分子量為1 X IO3-I X IO80
22.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三元復(fù)合物，其中，所述共聚物為AB型、ABA型和BAB型嵌段共聚物中的至少一種，且共聚物的數(shù)均分子量為1000-400000，其中，A為聚谷氨酸嵌段， 且A的數(shù)均分子量為500-300000，B為聚乙二醇嵌段和/或一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇嵌段，且B的數(shù)均分子量為200-30000。
23.根據(jù)權(quán)利要求2所述的三元復(fù)合物，其中，所述共聚物為含有聚谷氨酸主鏈和側(cè)鏈的接枝共聚物，所述側(cè)鏈為聚乙二醇和/或一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇，所述接枝共聚物的數(shù)均分子量為1000-400000，接枝率為10-80%，聚谷氨酸主鏈的數(shù)均分子量為 500-300000,每個(gè)側(cè)鏈的數(shù)均分子量為200-30000。
24.根據(jù)權(quán)利要求2、22或23所述的三元復(fù)合物，其中，所述一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇為一個(gè)末端被靶向性物質(zhì)修飾了的聚乙二醇。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的三元復(fù)合物，其中，所述靶向性物質(zhì)為葉酸、甘露糖、半乳糖、具有導(dǎo)向作用的短肽和適配子中的一種或多種。
26.一種含有三元復(fù)合物的液體，其特征在于，該含有三元復(fù)合物的液體含有權(quán)利要求1-25中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物中的一種或多種和水。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的含有三元復(fù)合物的液體，其中，所述含有三元復(fù)合物的液體中三元復(fù)合物的濃度為0. 001-4. 0克/升，所述含有三元復(fù)合物的液體中的三元復(fù)合物為顆粒狀且平均顆粒直徑為20-500納米。
28.一種含有三元復(fù)合物的液體的制備方法，其特征在于，該方法包括使Y物質(zhì)的水溶液與D物質(zhì)的水溶液混合，并將所得的混合物與M物質(zhì)的水溶液混合；其中，Y物質(zhì)為載體， 所述載體能夠在水溶液中形成帶有正電荷的基團(tuán)；D物質(zhì)為核酸；M物質(zhì)為能夠在水溶液中形成帶有負(fù)電荷基團(tuán)的共聚物。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述能夠在水溶液中形成帶有負(fù)電荷基團(tuán)的共聚物為聚谷氨酸與聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸與一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇形成的共聚物。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中，Y物質(zhì)為納米顆粒和/或陽離子聚合物，所述納米顆粒和陽離子聚合物均含有基團(tuán)Z，基團(tuán)Z能夠結(jié)合氫離子并形成所述帶有正電荷的基團(tuán)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，基團(tuán)Z的摩爾數(shù)、核酸中核苷酸的摩爾數(shù)與所述共聚物中的羧基的摩爾數(shù)的比例為1-50 1 1-50，所述基團(tuán)Z的摩爾數(shù)、核酸中的核苷酸的摩爾數(shù)與所述共聚物中的羧基的摩爾數(shù)使得含有三元復(fù)合物的液體中的三元復(fù)合物的Zeta電位為_20mV到30mV。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中，基團(tuán)Z的摩爾數(shù)、核酸中核苷酸的摩爾數(shù)與所述共聚物中的羧基的摩爾數(shù)的比例為1-30 1 1-30，所述基團(tuán)Z的摩爾數(shù)、核酸中的核苷酸的摩爾數(shù)與所述共聚物中的羧基的摩爾數(shù)使得含有三元復(fù)合物的液體中的三元復(fù)合物的Zeta電位為-15mV到20mV。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，基團(tuán)Z為伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一種或多種。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述納米顆粒的顆粒直徑為 10-400納米，所述納米顆粒為金納米顆粒和/或硅膠納米顆粒。
35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述陽離子聚合物的數(shù)均分子量為 lKDa-150KDa。
36.根據(jù)權(quán)利要求30-32、35中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述陽離子聚合物選自聚乙烯亞胺、陽離子脂質(zhì)體、聚氨基酯、殼聚糖、殼聚糖季銨鹽、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、兩親性梳形接枝共聚物和陽離子共聚物中的一種或多種，所述陽離子共聚物為聚乙烯亞胺、聚氨基酯、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物、聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物、兩親性梳形接枝共聚物中的至少兩種形成的共聚物；
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述兩親性梳形接枝共聚物是在原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)條件下，將含溴官能團(tuán)的聚酯與至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)接觸得到的，所述至少一個(gè)末端為烯鍵的物質(zhì)為具有式(2)所示結(jié)構(gòu)的單體、含有式(1)所示結(jié)構(gòu)單元的聚合物和聚乙烯亞胺中的一種或多種，
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述含溴官能團(tuán)的聚酯為γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)_己內(nèi)酯的均聚物、Y-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)_己內(nèi)酯與內(nèi)酯的共聚物和 γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)_己內(nèi)酯與交酯的共聚物中的一種或多種，其中，所述內(nèi)酯為 β-羥基丁酯、羥基戊酯和己內(nèi)酯中的一種或多種，所述交酯為乙交酯和/或丙交酯。
39.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述B組分為核糖核酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述B組分為雙鏈核糖核酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述B組分為帶有1-10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈區(qū)的雙鏈核糖核酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求39-41中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述B組分為部分經(jīng)過化學(xué)修飾的核糖核酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述至少部分化學(xué)修飾的核糖核酸修飾的類型為核糖的修飾、堿基的修飾和磷酸二酯鍵的修飾中的至少一種。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述部分經(jīng)過化學(xué)修飾的核糖核酸所含有的修飾基團(tuán)為氟代基團(tuán)、硫代基團(tuán)、烷氧基團(tuán)、烷基基團(tuán)、?；鶊F(tuán)和氨基基團(tuán)中的至少一種。
45.根據(jù)權(quán)利要求觀、39-41、43-44中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述核酸為寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，所述核酸的分子量為1 X IO3-I X IO80
46.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中，所述共聚物為AB型、ABA型和BAB型嵌段共聚物中的至少一種，且共聚物的數(shù)均分子量為1000-400000，其中，A為聚谷氨酸嵌段，且A的數(shù)均分子量為500-300000，B為聚乙二醇嵌段和/或一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇嵌段，且B的數(shù)均分子量為200-30000。
47.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中，所述共聚物為含有聚谷氨酸主鏈和側(cè)鏈的接枝共聚物，所述側(cè)鏈為聚乙二醇和/或一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇，所述接枝共聚物的數(shù)均分子量為1000-400000，接枝率為10-80%，聚谷氨酸主鏈的數(shù)均分子量為 500-300000,每個(gè)側(cè)鏈的數(shù)均分子量為200-30000。
48.根據(jù)權(quán)利要求四、46或47所述的方法，其中，所述一個(gè)末端帶有靶向性基團(tuán)的聚乙二醇為一個(gè)末端被靶向性物質(zhì)修飾了的聚乙二醇。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中，所述靶向性物質(zhì)為葉酸、甘露糖、半乳糖、具有導(dǎo)向作用的短肽和適配子中的一種或多種。
50.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述Y物質(zhì)的水溶液中Y物質(zhì)的濃度為 0. 001-1克/升，D物質(zhì)的水溶液中D物質(zhì)的濃度為0. 001-1克/升，M物質(zhì)的水溶液中M 物質(zhì)的濃度為0. 001-1克/升。
51.一種含有三元復(fù)合物的液體，所述含有三元復(fù)合物的液體通過權(quán)利要求觀-50中任意一項(xiàng)所述的方法制得。
52.權(quán)利要求1-25中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物或權(quán)利要求沈-27和51中任意一項(xiàng)所述的含有三元復(fù)合物的液體在細(xì)胞轉(zhuǎn)染、疾病的預(yù)防、診斷和基因治療中的應(yīng)用。
53.權(quán)利要求1-25中任意一項(xiàng)所述的三元復(fù)合物或權(quán)利要求沈-27和51中任意一項(xiàng)所述的含有三元復(fù)合物的液體在制備細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、制備疾病的預(yù)防、診斷或基因治療的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種三元復(fù)合物，其特征在于，該三元復(fù)合物含有A組分，B組分和C組分，A組分為帶有正電荷的載體，B組分為帶有負(fù)電荷的核酸，C組分為帶有負(fù)電荷的共聚物。本發(fā)明還提供了含有該三元復(fù)合物的液體及其制備方法。此外，還提供了上述三元復(fù)合物和含有三元復(fù)合物的液體的應(yīng)用。本發(fā)明提供的三元復(fù)合物和含有三元復(fù)合物的液體能夠兼具低毒和高轉(zhuǎn)染效率。因此，能夠廣泛的用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染、疾病的預(yù)防、診斷和基因治療中。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102477439SQ201010557300
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者董岸杰, 郭術(shù)濤 申請(qǐng)人:蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司