專利名稱：一種實時熒光定量PCR檢測花生LOX基因mRNA表達水平的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因表達水平的檢測方法，尤其涉及一種實時熒光定量PCR檢測 花生LOX基因mRNA表達水平的方法。
背景技術：
脂肪氧化酶(LOX)是植物體內重要的限制性酶，是茉莉酸合成代謝第一個 關鍵酶，與植物體的新陳代謝與組織防御有著十分密切的關系(Gloria B. Burow. Harold W. Gardner2A peanut seed lipoxygenase responsive to Aspergillus colonization [J], Plant Molecular Biology 42 :689_701，2000.)。花生中脂氧合酶含量 的變化則能夠提高花生對于外源真菌入侵的抗性，并且與植物體被動防御功能的產生有著 十分重要的相關性。植物LOX基因的表達行為具有多樣性和復雜性，其表達因不同物種、不同組織器 官、不同外界條件而表達特性各異，與植物的生長發(fā)育階段也密切相關。實時定量PCR技術 是指在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光 信號強度也等比例增加，每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號來實時監(jiān)測產物量的變 化。SYBR Green I實時定量PCR是PCR定量技術的一種，可以對基因擴增的起始模板的拷 貝數進行精確的定量，還可以通過熔解曲線判斷擴增產物的特異性，是一種靈敏度高、特異 性好的檢測技術?；ㄉ鶯OX基因已有研究表明在花生抗黃曲霉中發(fā)揮作用，但其生物體內 循環(huán)代謝機理仍不清楚。我們應用SYBR Green I實時定量PCR技術，建立檢測花生LOX基 因mRNA表達水平的方法，對于闡明LOX基因表達的作用機理具有一定指導作用。mRNA表達水平檢測是從基因水平研究生理、病理反應的一項基本技術。目前最常 規(guī)的方法包括Northern雜交、核糖核酸酶保護分析法等，但常規(guī)的方法均需要消耗很長時 間，而且這些方法均存在一些不足。Northern印跡法，將RNA固定在硝酸纖維素膜上后，用互補的，具有放射性標記的 RNA或DNA探針與其雜交。此方法需要的試劑多，RNA質量要求高，不能檢測低豐度mRNA， 敏感性低，而且在測量同一樣品不同mRNA豐度時顯得笨拙。核糖核酸酶保護分析法檢測敏感性較Northern雜交高，可同時檢測同一樣品中 不同豐度mRNA，但需要利用與靶mRNA恰好互補的反義核酸探針，這樣如果實驗產生易于被 核糖核酸酶切割的RNA-RNA雜交時，將出現問題。
實時定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，隨著PCR反應的進行， PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加，每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度 信號來實時監(jiān)測產物量的變化。主要類型有SYBR染料法、探針法和分子信號技術。綜上所述，現有技術的缺點是成本高，效率底，耗時間等類似問題。目前最常 規(guī)的方法包括Northern雜交、核糖核酸酶保護分析法等，但這些方法分別存在一些不足 Northern印跡需要的試劑多，RNA質量高，不能檢測低豐度mRNA，敏感性低而且在測量同一樣品不同mRNA豐度時顯得笨拙；核糖核酸酶保護分析法檢測敏感性較Northern雜交高，可 同時檢測同一樣品中不同豐度mRNA，但需要利用與靶mRNA恰好互補的反義核酸探針，這樣 如果實驗產生易于被核糖核酸酶切割的RNA-RNA雜交時，將出現問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種實時熒光定量PCR檢測花生LOX基因mRNA表達水平的方法。利 用SYBR Green I實時定量PCR檢測LOX基因mRNA表達水平，構建所要檢測基因標準品后， 可以對該基因擴增的起始模板的拷貝數進行精確的定量，還可以通過熔解曲線判斷擴增產 物的特異性，是一種靈敏度高、特異性好的檢測技術。實時熒光定量PCR檢測花生LOX基因mRNA表達水平的方法，包括如下步驟(1)從花生組織中提取總RNA，反轉錄成cDNA，以所述cDNA為模板擴增獲得LOX基 因片段，將LOX基因片段與載體連接，構建重組質粒；(2)將上述重組質粒轉化感受態(tài)細胞，并從中提取含有目的基因(L0X基因)的重 組質粒，計算重組質粒的拷貝數，將重組質粒稀釋成不同倍數，即為實時熒光定量PCR反應 的標準品模板；以所述的標準品模板進行實時熒光定量PCR，繪制標準曲線；(3)提取被檢測花生組織的總RNA，反轉錄成cDNA作為實時熒光定量PCR模板，以 步驟(1)中相同的擴增引物進行實時熒光定量PCR，與標準曲線比較得出起始模板的拷貝 數，確定被檢測花生組織的mRNA表達水平。步驟(1)中的擴增引物為上游引物Pl :5’ CCTCATCCTCCTCCTTCTTC-3’，下游引物 P2 :5’ -AAGGTGTCAACGTCCAGG-3’。步驟(1)中所述載體為PMD18-T載體。LOX基因片段與載體以摩爾比1 3 1 10進行連接，連接反應時間為4小時。步驟(2)中通過紫外分光光度計測量質粒的A260的值，通過Mr和阿伏伽德羅常 數計算出重組質粒的拷貝數。步驟⑵和(3)中的實時熒光定量PCR反應條件是95°C預變性2min，95°C 15 秒-57°C 15秒-72°C 20秒40個循環(huán)，每個循環(huán)結束時收集熒光信號。有益效果與現有技術相比，本發(fā)明利用實時熒光定量PCR技術基因表達水平檢查分析僅需 1小時，且能夠同時檢測大量樣品，方法簡單容易操作，結果分析更快捷方便。不僅可以節(jié)省 試劑耗材費用，提高檢測效率，更可以快速分析不同花生品種資源材料LOX基因表達差異， 分析篩選所需要的特殊表達材料用于花生生物育種等研究。附圖簡要說明

圖1 花生LOX基因的擴增產物，其中DNA標記物(DL2000)。圖2 :pMD18-T/L0X重組載體的鑒定其中DNA標記物(DL2000)A 重組載體的菌落PCR鑒定；B :PMD18-T/L0X重組載體的雙酶切鑒定。圖3a :pMD18-T/L0X的擴增動力曲線。
圖3b :pMD18-T/L0X的擴增產物回歸曲線(標準曲線)。圖4 :pMD18-T/L0X的擴增產物的熔解曲線。
具體實施例方式檢測不同品種花生幼苗不同營養(yǎng)器官LOX基因mRNA表達水平上的差異。實時熒光定量PCR采用德國羅氏公司LightCyCler2. 0實時熒光定量PCR儀，配有 該公司提供的LightCyclersoftware4. 05熒光定量分析軟件。SYBR Green I熒光定量試 劑盒、MMLV反轉錄試劑盒、PCR試劑盒和pMDIS-T載體連接試劑盒購于寶生物工程有限公 司。植物RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購于美國OMEGA生物技術公司。 T0P10感受態(tài)細胞購于北京天根生物公司。PCR引物合成和質粒測序由南京金思特生物公 司完成。1、檢測標準品的構建應用RT-PCR技術從花生幼苗組織中獲得LOX基因片段，與pMD18_T載體連接，構 建重組質粒PMD18-T/L0X，作為實時熒光定量PCR實驗的標準品模板。(I)LOX基因片段的制備花生種子先經75%乙醇處理1分鐘，再用0. 1 %的氯化汞進行消毒處理15分鐘， 最后用去離子水反復沖洗3-4遍備用。恒溫25°C浸種12h，將吸脹后的種子，擺放于組培瓶 中，每瓶3粒，用MStl固體培養(yǎng)基在人工氣候箱下培養(yǎng)，白天28°C 14小時，黑夜26°C 10小 時。營養(yǎng)液培養(yǎng)15天后，幼苗用于實驗。也可以用其它方法培養(yǎng)花生幼苗。利用RNA提取試劑盒，從IOOmg花生幼葉中提取總RNA，通過紫外分光光度計測量 A260/A280的比值，確定RNA的純度和濃度。采用MMLV反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為 模板進行PCR反應。LOX基因引物上游引物P1 5，CCTCATCCTCCTCCTTCTTC-3，，下游引物P2 5，AAGGTGTCAACGTCCAGG-3，；反應體系為SYBR GREEN IOul，上下游引物為 0. 5ul (10umol/L)，滅菌水 7ul，cDNA 模板2ul。擴增程序如下95°C變性2分鐘；95°C 15秒-57°C 15秒-72°C 20秒，每循環(huán)結 束時進行熒光信號收集40個循環(huán)；擴增片段為145bp。通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進 行鑒定，然后在紫外燈下切下目的基因條帶，用膠回收試劑盒對PCR產物進行純化回收，即 獲得純化的LOX基因片段。PCR擴增出的產物與目的片段大小一致(如圖1所示)。(2)重組質粒的連接、轉化、陽性克隆篩選及鑒定將pMDIS-T載體與LOX基因 片段以適當比例(摩爾比1 3 1 10)進行連接，連接反應時間為4h，構建重組質粒 PMD18-T/L0X。連接產物轉化T0P10感受態(tài)細胞，采用氨芐青霉素抗性LB瓊脂糖平板初次 篩選和菌落PCR再次篩選的方法確定陽性菌落，在氨芐青霉素抗性LB培養(yǎng)液中擴增陽性菌 落。從菌液中提取質粒進行雙酶切鑒定， 經瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示， 符合LOX基因片段的預期大小。同時測序鑒定也說明序列完全正確，結果表明重組質粒 PMD18-T/L0X構建成功。2、SYBR Green I實時定量PCR檢測標準曲線繪制提取重組質粒PMD18-T/L0X，通過紫外分光光度計測量質粒的A260值，根據Mr和 阿佛加德羅常數計算出質?？截悢?張罕等，實時定量PCR分析小鼠樹突狀細胞TLR4mRNA 表達及地塞米松的調節(jié)，《細胞與分子免疫學雜志》，2008年第3期)，將重組質粒(即實時 定量PCR反應的標準品)稀釋成IOi2UOiiUOic^ ΙΟ9、108、107copy/mL作為實時熒光定量PCR反應的標準品模板。實時熒光定量PCR反應的總體系為25 μ 1，其中包括上游引物P1、下游引物P2(引 物序列同前)各0. 5 μ 1，重組質粒模板2 μ 1，2 X SYBR Premix Ex Taq 12. 5μ1 (含有Taq DNA聚合酶、dNTP、SYBR Green I染料等成分)，余量為水。反應條件是95°C預變性2min，95°C 15秒-57°C 15秒-72°C 20秒40個循環(huán)，每個 循環(huán)結束時收集熒光信號。熒光域值設置為3 15個循環(huán)左右的熒光信號強度標準偏差 的10倍(參見試劑盒說明書)。循環(huán)結束后，Light Cyclersoftware 4. 05熒光定量分析 軟件自動繪制擴增動力曲線(如圖3a)和回歸曲線(如圖3b)。從擴增動力曲線和回歸曲 線(標準曲線)，可以看出熒光信號的強度和質粒的初始拷貝數有良好的線性關系，相關系 數r2 > 0. 99，線性范圍從IO7 1012。實時定量PCR反應的特異性分析通過熔解曲線分析實時定量PCR反應產物的純 度以判斷實驗的特異性。熔解曲線測定的方法是將上述實時定量PCR產物從65°C 30秒逐 步升至95°C，溫度每升高0. 2°C讀1次熒光值，由LightCyclersoftwarel 05熒光定量分析 軟件自動繪制熔解曲線(如圖4)。熔解曲線峰比較單一，沒有雜峰，無非特異性信號干擾， 表明實時定量PCR產物純度較高，反應具有良好的特異性。3、花生幼苗不同營養(yǎng)器官LOX基因mRNA表達水平的檢測Jll (高抗黃曲霉)品種、J1012(高感黃曲霉)品種，均由山東省花生研究所提供 (此只是示例性的列舉被檢測花生品種)，用前述方法培養(yǎng)花生幼苗。按前述方法提取花生幼苗不同營養(yǎng)器官的總RNA，反轉錄得到cDNA。為了避免由 于起始細胞數目不同而引起的差異，用紫外分光光度計分別測定各個營養(yǎng)器官提取的總 RNA濃度及反轉錄的cDNA濃度，最后將同濃度cDNA樣品作為模板進行實時定量PCR，反應 條件同步驟2，最后與標準曲線比較計算樣品中LOX基因cDNA的精確拷貝數。實時熒光定量PCR得出的Ct值(Ct，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時 所經歷的循環(huán))，利用標準曲線計算各樣數中LOX基因cDNA的精確拷貝數，結果如表1所 示，經統(tǒng)計學分析后，得出兩品種不同營養(yǎng)器官的LOX基因mRNA表達具有顯著性差異，其 中子葉大于根大于葉，同一部位下抗黃曲霉品種LOX基因表達含量顯著大于易感黃曲霉品 種。熔解曲線分析得出峰比較單一，沒有雜峰，無非特異性信號干擾，故該反應具有良好的 特異性，表明結果是準確可靠的。表1.花生幼苗不同部位LOX基因mRNA表達水平的差異
__Ct值拷貝數copy
基因型 根__w__Bt__m__W__葉
J1012 26.12±0.13 25.67士0.04 16.74士0.05 3.22±0.05xl05 1.63±0.09xl07 2.29±0.09><106 Jll 25.03士0..46 24.62土 0.36 16.19±0.32 1.18±0.06><106 1.20±0.03><108 2.26士 O.OlxlO權利要求
一種實時熒光定量PCR檢測花生LOX基因mRNA表達水平的方法，其特征在于包括如下步驟(1)從花生組織中提取總RNA，反轉錄成cDNA，以所述cDNA為模板擴增獲得LOX基因片段，將LOX基因片段與載體連接，構建重組質粒；(2)將上述重組質粒轉化感受態(tài)細胞，并從中提取含有LOX基因的重組質粒，計算重組質粒的拷貝數，將重組質粒稀釋成不同倍數，即為實時熒光定量PCR反應的標準品模板；以所述的標準品模板進行實時熒光定量PCR，繪制標準曲線；(3)提取被檢測花生組織的總RNA，反轉錄成cDNA作為實時熒光定量PCR模板，以步驟(1)中相同的擴增引物進行實時熒光定量PCR，與標準曲線比較得出起始模板的拷貝數，確定被檢測花生組織的mRNA表達水平。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中的擴增引物為上游引物 P1 5’CCTCATCCTCCTCCTTCTTC-3，，下游引物 P2 5，AAGGTGTCAACGTCCAGG-3 ’。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中LOX基因片段與載體以摩爾比 1 3 1 10進行連接，連接反應時間為4小時。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述載體為PMD18-T載體。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中通過紫外分光光度計測量質粒的 A260的值，通過Mr和阿伏伽德羅常數計算出重組質粒的拷貝數。
6.如權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于步驟(2)和(3)中的實時熒光定量PCR 反應條件是95°C預變性2min，95°C 15秒-57 °C 15秒-72 °C 20秒40個循環(huán)，每個循環(huán)結 束時收集熒光信號。
全文摘要
該發(fā)明涉及一種實時熒光定量PCR檢測花生LOX基因mRNA表達水平的方法。利用SYBR Green I實時定量PCR檢測LOX基因mRNA表達水平，構建所要檢測基因標準品后，可以對該基因擴增的起始模板的拷貝數進行精確的定量，還可以通過熔解曲線判斷擴增產物的特異性，是一種靈敏度高、特異性好的檢測技術。
文檔編號C12Q1/68GK101988127SQ20101055731
公開日2011年3月23日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權日2010年11月22日
發(fā)明者單世華 申請人:山東省花生研究所