專利名稱：一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法，具體涉及一種吸水鏈霉菌發(fā)酵 生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素是抗生素中的一個化學(xué)類群，其結(jié)構(gòu)由25 37個碳原子組 成大內(nèi)酯環(huán)，在環(huán)的一部分有共軛多烯結(jié)構(gòu)，對應(yīng)部位有羥基，并由糖苷鍵連接一個或多個 氨基糖。由于結(jié)構(gòu)中共軛雙鍵數(shù)目不同而被分為三、四、五、六、七烯，每類都有特異紫外吸 收峰值。共軛四烯的大環(huán)內(nèi)酯的紫外吸收光譜在四1 士 2nm、302 士 2nm、320 士 3nm有特征吸 收峰，都具有抗真菌作用，約50余種。四烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素在醫(yī)療、食品和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已被 廣泛應(yīng)用，如納他霉素能夠?qū)Ｐ缘匾种平湍妇兔咕?，并具有良好的理化穩(wěn)定性，已成為30 多個國家廣泛使用的一種天然生物食品防腐劑和抗菌添加劑；梧寧霉素對林木腐爛病、潰 瘍病、黑斑病等有較好的防治效果，并有明顯促進傷組織愈合、弱苗根系發(fā)達、老化根系再 生、提高作物抗病能力等特點，且毒性低，對人畜安全，無公害，不污染環(huán)境，是一種新型的 農(nóng)用抗生素。在已報道的具有抗真菌活性的抗生素中，大多數(shù)具有多烯大環(huán)內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，而 且多烯類抗生素是一類目前臨床常用藥中最不容易產(chǎn)生抗藥性的抗真菌抗生素。因此，開 發(fā)高效低毒的多烯類抗真菌抗生素，仍是抗真菌藥物研發(fā)的有效途徑之一。本研究室從泰山林地土壤中分離獲得一株高效拮抗菌BS-112，經(jīng)鑒定為吸水鏈霉 菌(Sti^ptomyces hygroscopicus)，其代謝產(chǎn)物具有廣譜抗真菌活性，對黃曲霉、赭曲霉、 黑曲霉等糧食和飼料中常見的霉菌具有明顯的抑制作用。本實驗室對該菌株產(chǎn)生的抗真菌 物質(zhì)進行了分離純化及結(jié)構(gòu)鑒別，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)是由4個活性組分組成的 四烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為iTetrins A和B、Tetramycins A和B。該菌 株發(fā)酵性狀優(yōu)異，抗真菌物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，具有作為糧食和飼料防霉劑的潛力。此外，該抗真 菌物質(zhì)還對多種家蠶及農(nóng)作物的病原真菌具有較好的抑制作用，在養(yǎng)蠶業(yè)及農(nóng)業(yè)上也具有 潛在應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種吸水鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基及其制備 方法，對吸水鏈霉菌BS-112發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提高抗真菌物質(zhì)的 產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本，對該菌株抗真菌物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。本發(fā)明提供了一種吸水鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基，各組分及其質(zhì)量濃 度為玉米粉0.3%% 1.0%，葡萄糖1.5% 2.0%，黃豆餅粉2. 5% 3.5%，磷酸二氫 鉀0.3% 0.6%，硫酸鎂0.5% 1.0%，其余為水。本發(fā)明各組分優(yōu)選的質(zhì)量濃度為玉米粉0.5%，葡萄糖1.8%，黃豆餅粉3. 1%, 磷酸二氫鉀0. 38 %，硫酸鎂0.85%。本發(fā)明還提供了一種吸水鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于主要包括如下步驟(1)按照葡萄糖1.5% 2.0%、磷酸二氫鉀0.3% 0.6%和硫酸鎂0.5% 1. 0%的質(zhì)量濃度稱取各組分，加入適量的水使其完全溶解；(2)按照玉米粉0. 3% 1. 0%和黃豆餅粉2. 5% 3. 5%的質(zhì)量濃度稱取各組分， 加入少量的水?dāng)嚢璩珊隣睿?3)將步驟(1)的溶解液倒入步驟(2)的糊狀溶液中，再加水定容，獲得抗真菌物
質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種吸水鏈霉菌，該菌株表述為吸水鏈霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)BS_112。其已于2009年12月13日保藏在中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科 學(xué)院微生物研究所。郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 3504，分類類別為吸水鏈霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)。本發(fā)明的BS-112菌株是從泰山林地土壤中篩選得到的，該菌株對糧食及飼料中 常見霉變真菌(黃曲霉、赭曲霉、黑曲霉、煙曲霉、米曲霉)、家蠶病原真菌(白僵菌、綠僵菌、 黃曲霉)及植物病真菌(番茄灰霉病菌、煙草炭疽病菌、立枯絲核菌、蘋果輪紋病菌、楊樹腐 爛病菌)等均有較好的抑制效果，且該菌株具有良好的傳代抑菌穩(wěn)定性。BS-112菌株產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)是由4個活性組分組成的四烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素，它 們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別為iTetrins A和B、Tetramycins A和B。該抗真菌物質(zhì)理化性質(zhì)穩(wěn)定， 毒性低。在糧食和飼料防霉劑、家蠶真菌病害和植物真菌病害的生物防治上均具有較高的 實際應(yīng)用價值和廣闊的市場前景。本發(fā)明將單次單因子、Plackett-Burman Design 禾口 Response Surface Methodology應(yīng)用到BS-112菌株抗真菌物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化過程中，包括如下步驟首先根據(jù)單次單因子試驗篩選出最佳碳源(葡萄糖)和氮源(黃豆餅粉)，其次 用Plackett-Burman Design試驗篩選出影響抗真菌物質(zhì)產(chǎn)量的3個關(guān)鍵因素葡萄糖、黃 豆餅粉和磷酸二氫鉀。最后采用Response Surface Methodology的方法，得到了葡萄糖、 黃豆餅粉和磷酸二氫鉀的最佳質(zhì)量濃度。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，應(yīng)用到BS-112菌株抗真菌物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，抗真菌 物質(zhì)產(chǎn)量不同程度的提高了 3 4倍。而且降低了成本較高碳源——葡萄糖的含量，補充 了緩效碳源——玉米粉，去除了成本較高氮源一一蛋白胨，補充了廉價氮源——黃豆餅粉， 使生產(chǎn)成本大幅度降低，為該抗真菌物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。吸水鏈霉菌BS-112發(fā)酵液抗真菌物質(zhì)濃度的計算依據(jù)抗真菌物質(zhì)在305nm處有較強的特征峰吸收，采用紫外分光光度法測定其濃 度將待測樣品或發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其在305nm處的吸光值處于0. 2 1. 0之間，測 量并記錄吸光值，每個處理重復(fù)2次，將數(shù)值代入方程y = [(x-0. 037)/0. 0011] Xn[式 中，y 抗真菌物質(zhì)的濃度(μ g/mL)，χ 吸光值(0. 2 < χ < 1. 0)，η 稀釋倍數(shù)]，計算抗真 菌物質(zhì)的濃度。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.抗菌廣譜性好，對引起糧食和飼料霉變的主要真菌(如黃曲霉、赭曲霉、黑曲 霉、煙曲霉、米曲霉)具有較強的抑制作用?？拐婢镔|(zhì)還對家蠶病原真菌(白僵菌、綠僵菌、黃曲霉)及植物病原真菌(番茄灰霉病菌、煙草炭疽病菌、立枯絲核菌、蘋果輪紋病菌、 楊樹腐爛病菌)等均有較好的抑制作用。 2.發(fā)酵性狀優(yōu)良，且傳代抑菌性狀穩(wěn)定，抗真菌物質(zhì)對熱和堿穩(wěn)定，耐儲藏。3.優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化前的發(fā)酵培養(yǎng)基相比，采用玉米粉作為緩效碳源， 以黃豆餅粉作為氮源，大大降低了成分，縮短了發(fā)酵周期，且抗真菌物質(zhì)的產(chǎn)量提高了 3 4倍，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式實施例1 (1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基按照葡萄糖1.8%，磷酸二氫鉀0.38%，硫酸鎂0.5%的質(zhì) 量濃度稱取各組分，加入適量的水使其完全溶解，得到溶解液；按照質(zhì)量濃度稱取玉米粉 0. 5%和黃豆餅粉3. 置于燒杯中，加入少量的水?dāng)嚢璩珊隣?；將上述的溶解液倒入燒?中，與糊狀玉米粉和黃豆餅粉混合，再加水定容；(2)裝瓶滅菌將60個容量為250mL三角瓶洗凈，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基的量為50mL， 在裝液的過程中，要不時的用玻璃棒攪拌，防止玉米粉和黃豆餅粉沉淀。將裝好發(fā)酵培養(yǎng)基 的三角瓶用棉塞封口后，高壓滅菌；(3)接種待發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻后，在無菌條件下按2%的接種量接入BS-112菌株種 子液；(4)發(fā)酵將接好BS-112菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基放入搖床中進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為84 小時，溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分；(5)測定抗真菌物質(zhì)的濃度根據(jù)紫外分光光度法測得抗真菌物質(zhì)的濃度為 5. 94g/L0實施例2 (1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基按照葡萄糖1.5%，磷酸二氫鉀0.3%，硫酸鎂0.85%的質(zhì) 量濃度稱取各組分，加入適量的水使其完全溶解，得到溶解液；按照質(zhì)量濃度稱取玉米粉 0. 3%和黃豆餅粉2. 5%置于燒杯中，加入少量的水?dāng)嚢璩珊隣?；將上述的溶解液倒入燒?中，與糊狀玉米粉和黃豆餅粉混合，再加水定容；(2)裝瓶滅菌將60個容量為250mL三角瓶洗凈，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基的量為50mL， 在裝液的過程中，要不時的用玻璃棒攪拌，防止玉米粉和黃豆餅粉沉淀。將裝好發(fā)酵培養(yǎng)基 的三角瓶用棉塞封口后，高壓滅菌；(3)接種待發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻后，在無菌條件下每瓶按2%的接種量接入BS-112菌 株種子液；(4)發(fā)酵將接好BS-112菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基放入搖床中進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為84 小時，溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分；(5)測定抗真菌物質(zhì)的濃度根據(jù)紫外分光光度法測得抗真菌物質(zhì)的濃度為 5. 36g/L。實施例3 (1)配制發(fā)酵培養(yǎng)基按照葡萄糖2.0%，磷酸二氫鉀0.6%，硫酸鎂1.0%的質(zhì) 量濃度稱取各組分，加入適量的水使其完全溶解，得到溶解液；按照質(zhì)量濃度稱取玉米粉1. 0%和黃豆餅粉3. 5%置于燒杯中，加入少量的水?dāng)嚢璩珊隣睿粚⑸鲜龅娜芙庖旱谷霟?中，與糊狀玉米粉和黃豆餅粉混合，再加水定容；(2)裝瓶滅菌將30個容量為500mL三角瓶洗凈，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基的量為 IOOmL,在裝液的過程中，要不時的用玻璃棒攪拌，防止玉米粉和黃豆餅粉沉淀。將裝好發(fā)酵 培養(yǎng)基的三角瓶用棉塞封口后，高壓滅菌；(3)接種待發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻后，在無菌條件下每瓶按2%的接種量接入BS-112菌 株種子液；(4)發(fā)酵將接好BS-112菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基放入搖床中進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為84 小時，溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分；(5)測定抗真菌物質(zhì)的濃度根據(jù)紫外分光光度法測得抗真菌物質(zhì)的濃度為 5. 46g/L。實施例4:(對比試驗)(1)配制原始發(fā)酵培養(yǎng)基按照葡萄糖2. 5 %，蛋白胨3. 0 %，磷酸二氫鉀1. 5 %，硫 酸鎂1. 5%的質(zhì)量濃度稱取各組分，加入適量的水使其完全溶解，得到溶解液；按照2%的 質(zhì)量濃度稱取土豆煮沸15分鐘，經(jīng)4層紗布過濾，收集上清液；將上述的溶解液倒入收集的 上清液中，再加水定容；(2)裝瓶滅菌將60個容量為250mL三角瓶洗凈，每瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基的量為50mL， 將裝好發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶用棉塞封口后，高壓滅菌；(3)接種待發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻后，在無菌條件下每瓶按2%的接種量接入BS-112菌 株種子液；(4)發(fā)酵將接好BS-112菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基放入搖床中進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為84 小時，溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分；(5)測定抗真菌物質(zhì)的濃度根據(jù)紫外分光光度法測得抗真菌物質(zhì)的濃度為 1. 63g/L ；(6)對比優(yōu)化前后發(fā)酵培養(yǎng)基中抗真菌物質(zhì)的濃度實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)基中抗 真菌物質(zhì)的濃度是本實施例中原始發(fā)酵培養(yǎng)基的3. 64倍。
權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基，其特征在于其各組分及其質(zhì)量濃度 為玉米粉0. 3 % 1. 0 %，葡萄糖1. 5 % 2. 0 %，黃豆餅粉2. 5 % 3. 5 %，磷酸二氫鉀 0. 3% 0. 6%，硫酸鎂0. 5% 1. 0%，其余為水。
2.一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)按照葡萄糖1.5% 2.0%、磷酸二氫鉀0.3% 0.6%和硫酸鎂0.5% 1.0%的 質(zhì)量濃度稱取各組分，加入適量的水使其完全溶解；(2)按照玉米粉0.3% 1. 0%和黃豆餅粉2. 5% 3. 5%的質(zhì)量濃度稱取各組分，加入 少量的水?dāng)嚢璩珊隣睿?3)將步驟(1)的溶解液倒入步驟O)的糊狀溶液中，再加水定容。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基，其特征在于各組 分優(yōu)選的質(zhì)量濃度為玉米粉0.5%，葡萄糖1.8%，黃豆餅粉3.1%，磷酸二氫鉀0. 38 %，硫 酸鎂0. 85%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌物質(zhì)的培養(yǎng)基及其制備方法，培養(yǎng)基成分及其質(zhì)量濃度為玉米粉0.3％～1.0％，葡萄糖1.5％～2.0％，黃豆餅粉2.5％～3.5％，磷酸二氫鉀0.3％～0.6％，硫酸鎂0.5～1.0％，其余為水。采用本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基，大大提高了吸水鏈霉菌BS-112抗真菌物質(zhì)的產(chǎn)量，且本發(fā)明采用工業(yè)上常用的玉米粉、黃豆餅粉等原料進行生產(chǎn)，生產(chǎn)成本降低，適于大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明生產(chǎn)的抗真菌物質(zhì)對糧食和飼料中的黃曲霉等主要霉變真菌以及多種家蠶和植物病原真菌具有廣譜的抗菌活性且毒性低，在糧食和飼料防霉劑、家蠶真菌病害和植物真菌病害的生物防治上均具有較高的實際應(yīng)用價值和廣闊的市場前景。
文檔編號C12R1/465GK102080047SQ20101056001
公開日2011年6月1日 申請日期2010年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月15日
發(fā)明者于建, 仇念全, 劉訓(xùn)理, 呂常旭, 國輝, 宋振, 張本峰, 張楠 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)