專利名稱：土壤微生物數(shù)量精確測定的方法
土壤微生物數(shù)量精確測定的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物數(shù)量精確測定技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種土壤可培養(yǎng)微生物 數(shù)量精確測定的方法，適合于高等學(xué)校、科研單位、醫(yī)療衛(wèi)生和環(huán)境保護部門等測定土 壤可培養(yǎng)微生物的數(shù)量。
背景技術(shù)：
土壤微生物在土壤有機質(zhì)和氮磷等主要養(yǎng)分的循環(huán)和轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。 土壤微生物種類繁多，數(shù)量龐大。從分類學(xué)上看，土壤微生物可分為細菌、真菌、放線 菌、病毒和原生動物等。盡管土壤微生物基因分析表明，土壤可培養(yǎng)微生物的占土壤中 總微生物的比率較小，但在功能上土壤可培養(yǎng)微生物可能發(fā)揮著主要作用，特別是土壤 中可培養(yǎng)細菌和真菌。
最初測定土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的方法是采用稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法，該方法的 優(yōu)點在于可測定土壤中可培養(yǎng)的各種類型微生物的數(shù)量，包括細菌、真菌和放線菌。特 別是可用于測定可培養(yǎng)的具有特殊功能的微生物種群，如氨化細菌、硝化細菌、反硝化 細菌、解磷菌和固氮菌等。因此，稀釋平板培養(yǎng)計數(shù)法一直是測定土壤微生物數(shù)量最常 用的方法。但是，過去的方法普遍存在的主要問題是精密度低，準(zhǔn)確度和重復(fù)性差，不 適合用于進行精確的土壤微生物數(shù)量研究。其原因在于其一，該方法需要經(jīng)過多步 稀釋，采用傳統(tǒng)吸管進行土壤懸浮液進行稀釋，很難對少量(1.0毫升)的土壤懸浮液 進行準(zhǔn)確取樣，當(dāng)某次稀釋取樣不發(fā)生誤差時，將對后續(xù)稀釋度將帶來很大的影響。其 次，過去的方法在進行稀釋時沒有考慮到土壤中的水分，也是準(zhǔn)確度差和誤差大的原因 之一。其三，在測定土壤可培養(yǎng)細菌時，由于真菌的生長干擾細菌的計數(shù)，而測定土壤 真菌時，由于細菌的生長而影響真菌的計數(shù)。Lombard于2006年將稀釋培養(yǎng)法測定微生 物數(shù)量的過程比作“黑箱”，影響其測定結(jié)果不確定性的因素很多，包括器皿和設(shè)備 選擇、測定所用樣品的取樣和初始稀釋制備懸浮液、懸浮液系列稀釋及接種液涂抹、隨 機誤差的排除、操作者和時間、培養(yǎng)基和試劑、菌落確定和計數(shù)等。因此，建立精確的 稀釋平板培養(yǎng)法對于研究土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種土壤微生物數(shù)量精確測定的方法，該方法操作 簡便、快速，技術(shù)要求相對較低，測定結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適合于大批 量土壤樣品的各種可培養(yǎng)微生物數(shù)量的精確測定。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施首先對土壤樣品進行前處理，再測定土壤含水量，然后稱取土壤加無菌水制備土壤 懸浮液，再用經(jīng)滅菌的電動移液器將土壤懸浮液進行稀釋，然后分別經(jīng)滅菌的電動移液 器取適宜稀釋度的土壤懸浮液于平板培養(yǎng)基中，涂抹后進行培養(yǎng)，然后計數(shù)培養(yǎng)后平板 培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，再計算出土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量。
一種土壤微生物數(shù)量精確測定的方法，其步驟是
(1) 土壤前處理去除土壤樣品中可見的植物殘體(根、莖、葉等)和動物以及小 石子，再將土壤樣品徹底混合均勻。(2)測定土壤含水量先將鋁盒放在烘箱中于103°C下烘干8-10小時，取出 鋁盒置于下部放有部分干燥硅膠(硅膠CAS112926-00-8)的干燥器中冷卻至室溫(20-25°C)，稱量鋁盒重量，取10-20克新鮮土壤樣品放入上述烘干后的鋁盒中，稱量新鮮 土壤+鋁盒的重量，將其放入烘箱中在103°C下烘干20-24小時，取出置于上述干燥器中 冷卻至室溫(20-25°C)，然后稱量烘干土壤+鋁盒的重量。采樣下列公式計算土壤含水 量
土壤含水量(％)=[(新鮮土壤+鋁盒)(g)-鋁盒(g) ]/[(烘干土壤+鋁 盒)(g)-鋁盒(g) ] ‘ 100%。(3) 土壤懸浮液制備稱取相當(dāng)于10克烘干重的上述新鮮土壤樣品，置于經(jīng) 滅菌(121°C，30分鐘)的250-325毫升樂扣杯中，再加入經(jīng)滅菌的直徑為0.5厘米的玻 璃珠5-7粒，然后加入無菌水，使加入的無菌水與土壤中水之和為90毫升。將裝有土壤 懸浮液的樂扣杯置于振蕩器中震蕩，使土壤徹底分散。即得到KT1 土壤懸浮液。(4) 土壤懸浮液稀釋用經(jīng)滅菌的電動移液器按10倍稀釋法將上述土壤懸浮 液依次稀釋成10_2-10_6 土壤懸浮液。(5)培養(yǎng)基配制分別配置土壤可培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基和土壤可培養(yǎng)真菌培養(yǎng) 基，將培養(yǎng)基在121°C下滅菌30分鐘，冷卻至40-50°C后，在細菌培養(yǎng)基中加入真菌抑 制劑放線菌酮(Sigma公司產(chǎn))，真菌培養(yǎng)基中加入細菌抑制劑四環(huán)素和鏈霉素硫酸鹽
(Amresco公司產(chǎn))。然后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制備平板培養(yǎng)基。(6)接種與培養(yǎng)用經(jīng)滅菌的電動移液器分別取上述10_3-10_6 土壤懸浮液 0.1毫升，置于土壤可培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基或土壤可培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基中，每個稀釋度重復(fù)3-4 次，用經(jīng)酒精燈火焰滅菌的刮鏟將培養(yǎng)基表面懸浮液涂抹均勻，置于25-30°C下培養(yǎng)2-4 天。(7)計數(shù)與計算選擇培養(yǎng)皿中生長的菌落數(shù)為20-100個菌落的稀釋度進行 計數(shù)。采用下列公式計算土壤可培養(yǎng)細菌或真菌
土壤可培養(yǎng)細菌或土壤可培養(yǎng)真菌(cfu/克)=(菌落平均數(shù)’稀釋倍數(shù)’10) / 土 樣烘干質(zhì)量。其中，“10”為換算系數(shù)，即將0.1毫升懸土壤浮液換算為1.0毫升。用于實現(xiàn)本發(fā)明土壤可培養(yǎng)細菌和真菌數(shù)量精確測定的培養(yǎng)基配方
(1) 土壤可培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基牛肉膏10克、蛋白胨3克、氯化鈉5克、瓊脂20克、 水1升，滅菌(121°C，30分鐘)后加入放線菌酮200-300毫克/升。(2) 土壤可培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基硝酸鈉660毫克、磷酸二氫鉀330毫克、硫酸鎂 165毫克、硫酸亞鐵6.6毫克、酵母膏165毫克、蔗糖10克、瓊脂20克、水1升，滅菌
(121°C, 30分鐘)后加入鏈霉素硫酸鹽200-300毫克/升和四環(huán)素10-15毫克/升。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1.使用本發(fā)明土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，測定的土壤可培養(yǎng)細菌和真 菌等數(shù)量的結(jié)果不僅精密度和準(zhǔn)確度高，而且重復(fù)性好，測定結(jié)果變異系數(shù)(CV)范圍 為 0.2%—5.4%。
2.本發(fā)明的土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，排除了土壤水分導(dǎo)致測定 結(jié)果偏低的影響，提高了測定準(zhǔn)確性。3.本發(fā)明的土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，排除了操作過程人為因素 的影響，操作簡便、快速。土壤懸浮液稀釋和稀釋液取樣誤差降低到1.0%-2.0%，操作 速度提高2-3倍。技術(shù)要求相對較低，適合大批量樣品的分析測定。4.本發(fā)明的土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，排除了土壤細菌和真菌測 定時相互影響，不需對細菌和真菌菌落進行顯微鏡判別，提高了測定速度和結(jié)果準(zhǔn)確 性。5.實用性廣，適合于旱地土壤、淹水稻田土壤、污泥以及食品中等各種可培養(yǎng) 微生物數(shù)量精確測定中應(yīng)用。


圖1為一種土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法的流程圖。圖2為一種添加稻草和選擇性抑菌劑對旱地土壤可培養(yǎng)細菌數(shù)量的影響示意 圖。圖3為一種添加稻草和選擇性抑菌劑對旱地土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量的影響示意 圖。圖4為一種添加稻草和選擇性抑菌劑對稻田土壤可培養(yǎng)細菌數(shù)量的影響示意 圖。圖5為一種添加稻草和選擇性抑菌劑對稻田土壤可培養(yǎng)真菌數(shù)量的影響示意 圖。
具體實施例方式一種土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，包括下列步驟
(1) 土壤前處理1:對于測定土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的樣品，應(yīng)在晴天從田間采 樣，采用時用直接為2厘米的土鉆采9-11鉆表層(0.1-20厘米)土壤。采集的土壤應(yīng) 先去除樣品中可見的植物殘體(根、莖、葉等)和動物以及小石子，再將土壤樣品徹底 混合均勻。旱地土壤也可過孔徑2毫米的篩后再混合，淹水稻田土壤可放入1-2升的燒 杯中混合。 (2)測定土壤含水量2:先將鋁盒放在烘箱中于103°C下烘干8或9或10小時， 取出鋁盒置于下部放有部分干燥硅膠的干燥器中冷卻至室溫(20-25°C，以下相同)，稱 量鋁盒重量，取10-20克新鮮土壤樣品放入上述烘干后的鋁盒中，稱量新鮮土壤+鋁盒的 重量，將其放入烘箱中在103°C下烘干20或21或22或23或24小時，取出置于上述干燥 器中冷卻至室溫(20-25°C)，然后稱量烘干土壤+鋁盒的重量。每個土壤重復(fù)3-4次。 采樣下列公式計算土壤含水量
土壤含水量(％)=[(新鮮土壤+鋁盒)(g)-鋁盒(g) ]/[(烘干土壤+鋁 盒)(g)-鋁盒(g) ] ‘ 100%。例如測定某旱地土壤的含水量，鋁盒重量為12.88克，新鮮土壤+鋁盒重量為 23.03克，烘干土壤+鋁盒重量為21.12克。那么，該土壤的含水量=(23.03-12.88) /(21.12—12.88) ‘ 100%= 18.82%,即每100克新鮮土壤中含有18.82克水分。通常旱地土壤含水量為12%-22%，淹水稻田土壤含水量為40%-55%。若不測 定土壤含水量，在制備土壤懸浮液時不考慮土壤中的水分，將使土壤懸浮液的稀釋度升 高，導(dǎo)致測定的土壤微生物數(shù)量結(jié)果偏低，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明在土壤懸浮 液制備時，通過測定的土壤含水量，準(zhǔn)確計算出相當(dāng)于10克烘干重的新鮮土壤中的水分 量，使加入的無菌水量與土壤中水分量之和為90.0毫升，從而得到準(zhǔn)確的ICT1 土壤懸浮 液。(3) 土壤懸浮液制備3:稱取相當(dāng)于10克烘干重的上述新鮮土壤樣品，在無 菌工作臺上，將土壤置于經(jīng)滅菌(121°C，30分鐘)的250-325毫升樂扣杯中，再加入經(jīng) 滅菌的直徑為0.5厘米的玻璃珠5-7粒，然后用經(jīng)滅菌(121°C，30分鐘)的瓶口分液器
(Socorex Calibrex 521，10-100毫升，瑞士產(chǎn))加入無菌水，使加入的無菌水與土壤中 水之和為90.0毫升。將裝有土壤懸浮液的樂扣杯蓋緊后置于振蕩器中，在100轉(zhuǎn)/分鐘 下震蕩30分鐘，使土壤徹底分散。即得到ICT1 土壤懸浮液。例如采用上述含水量為 18.82%的土壤制備懸浮液時，應(yīng)稱取12.32克新鮮土壤，再加入87.68毫升無菌水，即得 到準(zhǔn)確的KT1 土壤懸浮液。(4) 土壤懸浮液稀釋4:用瓶口分液器(Socorex Calibrex 521, 2-20毫升，瑞 士產(chǎn))在長為10-12厘米、口徑為2厘米的試管中加水9.00毫升，塞棉塞于試管口，再 在121°C下滅菌30分鐘。在無菌工作臺上，用經(jīng)滅菌(121°C，30分鐘)的電動移液器
(BIOHIT eLINE, 50-1200微升，芬蘭產(chǎn))從混合均勻的上述10—1 土壤懸浮液中取1.00毫 升，加入上述含有9.00毫升無菌水的試管中，混合均勻，即得到10_2 土壤懸浮液。再按 上述相同方法從混合均勻的10_2 土壤懸浮液中取1.00毫升，加入上述含有9.00毫升無菌 水的試管中，混合均勻，即得到10_3 土壤懸浮液；依次類推，即可得到10_4、10_5和10_6 土壤懸浮液。采用該方法進行土壤懸浮液稀釋，不僅使可使稀釋過程中的取樣誤差降低 到1.0%-2.0%，提高土壤懸浮液稀釋液的準(zhǔn)確性，而且操作速度提高2-3倍。(5)培養(yǎng)基配制5: 土壤可培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基配制稱取牛肉膏10克、蛋白胨 3克、氯化鈉5克、瓊脂20克于2升燒杯中，加水1升，邊加熱邊攪拌煮沸，使試劑溶 化，然后將培養(yǎng)基分裝至500毫升三角瓶中，每瓶裝培養(yǎng)基200-250毫升，在瓶口加塞棉 塞，將裝有培養(yǎng)基的三角瓶置于高壓滅菌鍋中，在121°C溫度滅菌30分鐘。取出滅菌后 的培養(yǎng)基冷卻至40-50°C時，再將培養(yǎng)基置于無菌工作臺上，加入放線菌酮200-300毫克 /升。土壤可培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基配制稱取硝酸鈉660毫克、磷酸二氫鉀330毫克、硫酸鎂 165毫克、硫酸亞鐵6.6毫克、酵母膏165毫克、蔗糖10克、瓊脂20克于2升燒杯中， 加入水升，按上述相同方法進行培養(yǎng)基分裝、滅菌，滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至40-50°C時， 再將培養(yǎng)基置于無菌工作臺上，加入加入鏈霉素硫酸鹽200-300毫克/升和四環(huán)素10-15 毫克/升。然后在無菌工作臺上，將上述細菌和真菌培養(yǎng)基分別倒入經(jīng)滅菌(121°C， 30-60分鐘)的直徑為9厘米的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿倒入培養(yǎng)基15-20毫升。即可分 別得到細菌和真菌平板培養(yǎng)基。(6)接種與培養(yǎng)6:用經(jīng)滅菌(121°C，30分鐘)的電動移液器(BIOHIT eLINE, 5-300微升，芬蘭產(chǎn))分別取上述10_4-10_6或者10_3-10_5 土壤懸浮液0.1毫升，
分別接種到土壤可培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基或者土壤可培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基中，每個稀釋度重復(fù)3-4次，用經(jīng)酒精燈火焰滅菌的刮鏟將培養(yǎng)基表面懸浮液涂抹均勻，置于25-30°C下培養(yǎng)2-4 天。采用該方法進行土壤懸浮液接種，可使取樣誤差降低到1.0%-2.0%，提高測定準(zhǔn)確 性，降低測定誤差；操作速度提高3-5倍，適合于大批量樣品測定。(7)計數(shù)與計算7 選擇培養(yǎng)皿中生長的菌落數(shù)為20-100個菌落的稀釋度進行 計數(shù)。采用下列公式計算土壤可培養(yǎng)細菌或真菌數(shù)量
土壤可培養(yǎng)細菌或土壤可培養(yǎng)真菌(cfu/克)=(菌落平均數(shù)’稀釋倍數(shù)’10) / 土 樣烘干質(zhì)量。其中，“10”為換算系數(shù)，即將0.1毫升懸土壤浮液換算為1.0毫升。例如某土壤細菌數(shù)量測定時，稱取相當(dāng)于10克烘干重的新鮮土壤制備土壤懸 浮液，并按上述方法進行系列稀釋，然后選擇10_5 土壤懸浮液取0.1毫升接種到平板培養(yǎng) 基中，培養(yǎng)后，在培養(yǎng)皿中行成的細菌菌落數(shù)為82個。那么，該土壤的細菌數(shù)量=(82 ‘IO5 ‘ 10) / 10 = 8.2 ‘ IO6 cfu/ 克。以下是有關(guān)添加稻草和選擇性抑菌劑對紅壤稻田和旱地土壤可培養(yǎng)微生物影響 效果比較試驗
(1) 土壤采集和處理
取紅壤旱地和稻田表層(0-20厘米)土壤，除去其中可見動植物殘體，過篩(孔 徑<2毫米)，混勻，用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量至飽和持水量的40%，置密封的塑料桶 內(nèi)，在25°C黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)7-10天，桶內(nèi)放適量水以保持相對濕度為100%，并在桶 內(nèi)放1小杯1摩爾/升NaOH溶液以吸收土壤呼吸產(chǎn)生的CO2,經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后的新鮮土壤用 于培養(yǎng)試驗。(2)稻草制備及選擇性抑菌劑
收集曬干的稻草置45°C下烘干，粉碎后過60目篩，密封保存?zhèn)溆谩Ｕ婢种苿┓啪€菌酮(純度>94%，Sigma公司產(chǎn))，細菌抑制劑四環(huán)素(干 基效力> 900微克/毫克)和鏈霉素硫酸鹽(干基效力650 850單位/毫克)，均由 Amresco公司產(chǎn)。(3)試驗處理
稻田和旱地土壤均設(shè)4個處理對照(CK ；不添加稻草和抑制劑)、添加稻草 (Tl)、稻草+放線菌酮(T2)和稻草+四環(huán)素+鏈霉素硫酸鹽(T3)，每個處理4次 重復(fù)。取經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的相當(dāng)于500克烘干土重的新鮮土樣16份，稻草添加量按碳5000毫 克/公斤，直接與土樣徹底混勻；選擇性抑制劑加入量為放線菌酮200毫克/公斤、鏈 霉素硫酸鹽200毫克/公斤、四環(huán)素10毫克/公斤，分別配成溶液加入土樣中。各處理 用1% (重量比)硫酸銨溶液補充至氮50毫克/公斤，用蒸餾水調(diào)節(jié)旱地土壤含水量至 飽和持水量的45%、稻田土壤含水量至飽和持水量的105%，分別裝入1升塑料杯中，再 置于50升塑料桶(底部加少量水以保持100%濕度、并放置1小杯1摩爾/升NaOH溶 液吸收CO2)，密封后置于25 士 1°C、黑暗條件下培養(yǎng)45天，每3天通風(fēng)換氣1次以保 證土壤微生物生長所需充足的氧氣。分別于培養(yǎng)的第0、6、12、18、24、30和45天取 樣，采用本發(fā)明的方法測定土壤可培養(yǎng)細菌和真菌數(shù)量。(4)測定結(jié)果闡述
測定結(jié)果表明，對于旱地土壤，整個培養(yǎng)期間(45天)測定的各處理土壤細菌數(shù)量 的變異系數(shù)(CV)為0.2%-4.5%，各處理土壤真菌數(shù)量的變異系數(shù)(CV)為0.3%-5.0%(圖2、圖3)。這闡明該本發(fā)明方法測定土壤細菌和真菌數(shù)量的精確度高和重復(fù)性好。 對照處理(CK)由于沒有添加外源底物和抑菌劑，理論上每次測定的結(jié)果應(yīng)該是相同 的，實際測定結(jié)果表明在整個培養(yǎng)期間(45天)7次測定的旱地土壤細菌數(shù)量和真菌數(shù) 量的變異系數(shù)(CV)分別為1.7%和5.0% (圖2、圖3)。闡明本發(fā)明方法測定的旱地 土壤細菌和真菌數(shù)量的準(zhǔn)確性好，且系統(tǒng)誤差小。對于稻田土壤，整個培養(yǎng)期間(45天)測定的各處理土壤細菌數(shù)量的變異系數(shù) (CV)為0.3%-4.8%，各處理土壤真菌數(shù)量的變異系數(shù)(CV)為0.5%-5.4% (圖4、圖
5)。這闡明該本發(fā)明方法測定土壤細菌和真菌數(shù)量的精確度高和重復(fù)性好。對照處理 (CK)由于沒有添加外源底物和抑菌劑，理論上當(dāng)土壤含水量保持不變時，每次測定的 結(jié)果應(yīng)該是相同的；實際測定結(jié)果表明，當(dāng)土壤含水量由飽和持水量的45%改變?yōu)?05% 時，土壤細菌和真菌數(shù)量略有下降，采用培養(yǎng)第6-45天期間6次測定的稻田土壤細菌數(shù) 量和真菌數(shù)量的變異系數(shù)分別為0.5%和5.4% (圖4、圖5)。闡明本發(fā)明方法也可用 于測定的稻田土壤細菌和真菌數(shù)量，且準(zhǔn)確性好，系統(tǒng)誤差小。由于本發(fā)明方法測定的結(jié)果誤差小、精確度高，可用于研究添加稻草和選擇性 抑菌劑各處土壤細菌和真菌數(shù)量的變化。試驗結(jié)果表明，旱地土壤中添加稻草處理土壤 細菌和真菌數(shù)量比對照(CK)均顯著提高，但真菌的增加比例遠大于細菌，說明細菌和 真菌均參與土壤中稻草的分解和轉(zhuǎn)化，而真菌起主要作用。稻田土壤中，添加稻草處理 土壤細菌數(shù)量比對照(CK)顯著提高，而土壤真菌數(shù)量明顯下降，說明在淹水稻田土壤 中稻草分解和轉(zhuǎn)化的主要微生物為細菌，土壤細菌的大量繁殖可抑制土壤真菌。
權(quán)利要求
1.一種土壤微生物數(shù)量精確測定的方法，其步驟是(1)土壤前處理去除土壤樣品中的植物殘體和動物以及小石子，再將土壤樣品混 合均勻；(2)測定土壤含水量先將鋁盒放在烘箱中于103°C下烘干8-10小時，取出鋁盒置 于下部放有部分干燥硅膠的干燥器中冷卻至室溫，稱量鋁盒重量，取10-20克新鮮土壤 樣品放入上述烘干后的鋁盒中，稱量新鮮土壤+鋁盒的重量，將其放入烘箱中在103°C下 烘干20-24小時，取出置于上述干燥器中冷卻至室溫，然后稱量烘干土壤+鋁盒的重量， 采樣下列公式計算土壤含水量土壤含水量％=新鮮土壤+鋁盒g(shù)-鋁盒g(shù)/烘干土壤+鋁盒g(shù)-鋁盒g(shù)' 100% ；(3)土壤懸浮液制備稱取10克烘干重的上述新鮮土壤樣品，置于經(jīng)滅菌的250-325毫升樂扣杯中，再加入經(jīng)滅菌的直徑為0.5厘米的玻璃珠5-7粒，然后加入無菌水， 使加入的無菌水與土壤中水之和為90毫升，將裝有土壤懸浮液的樂扣杯置于振蕩器中震 蕩，使土壤分散，即得到KT1 土壤懸浮液；(4)土壤懸浮液稀釋用經(jīng)滅菌的電動移液器按10倍稀釋法將上述土壤懸浮液依 次稀釋成10_2-10_6 土壤懸浮液；(5)培養(yǎng)基配制分別配置土壤可培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基和土壤可培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基，將培 養(yǎng)基在121°C下滅菌30分鐘，冷卻至40-50°C后，在細菌培養(yǎng)基中加入真菌抑制劑，真菌 培養(yǎng)基中加入細菌抑制劑，然后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制備平板培養(yǎng)基；(6)接種與培養(yǎng)用經(jīng)滅菌的電動移液器分別取上述10_3-10_6土壤懸浮液0.1毫 升，置于土壤可培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基或土壤可培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基中，每個稀釋度重復(fù)3-4次， 用經(jīng)酒精燈火焰滅菌的刮鏟將培養(yǎng)基表面懸浮液涂抹均勻，置于25-30°C下培養(yǎng)2-4天；(7)計數(shù)與計算選擇培養(yǎng)皿中生長的菌落數(shù)為20-100個菌落的稀釋度進行計 數(shù)，采用下列公式計算土壤可培養(yǎng)細菌或真菌土壤可培養(yǎng)細菌或土壤可培養(yǎng)真菌(cfu/克)=(菌落平均數(shù)’稀釋倍數(shù)’10) / 土 樣烘干質(zhì)量；其中，“10”為換算系數(shù)，即將0.1毫升懸土壤浮液換算為1.0毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，所述的土壤可 培養(yǎng)細菌培養(yǎng)基牛肉膏10克、蛋白胨3克、氯化鈉5克、瓊脂20克、水1升，滅菌 121°C，30分鐘后加入放線菌酮200-300毫克/升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，所述的土壤可 培養(yǎng)真菌培養(yǎng)基硝酸鈉660毫克、磷酸二氫鉀330毫克、硫酸鎂165毫克、硫酸亞鐵 6.6毫克、酵母膏165毫克、蔗糖10克、瓊脂20克、水1升，滅菌121°C，30分鐘后加 入鏈霉素硫酸鹽200-300毫克/升和四環(huán)素10-15毫克/升。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量精確測定的方法，其步驟是(1)土壤前處理去除土壤樣品中的植物殘體和動物以及小石子，再將土壤樣品混合均勻；(2)測定土壤含水量先將鋁盒放在烘箱中烘干，取出鋁盒置于下部放有部分干燥硅膠的干燥器中冷卻至室溫，稱量烘干土壤+鋁盒的重量；(3)土壤懸浮液制備稱取烘干重的新鮮土壤樣品，置于經(jīng)滅菌的杯中，得到土壤懸浮液；(4)土壤懸浮液稀釋用經(jīng)滅菌的電動移液器稀釋法土壤懸浮液依次稀釋；(5)培養(yǎng)基配制；(6)接種與培養(yǎng)；(7)計數(shù)與計算。該方法操作簡便、快速，測定結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適合于大批量土壤樣品的各種可培養(yǎng)微生物數(shù)量的精確測定。
文檔編號C12Q1/06GK102021222SQ201010560939
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者吳金水, 張洪霞, 盛榮, 肖和艾, 譚周進 申請人:中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所