專利名稱：一種p75NTR-ECD在防治阿爾茨海默病藥物中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是一種防治阿爾茨海默病的藥物。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病的英文詞是Alzheimer，s disease，通?？s寫簡稱為AD。是以癡呆為特征的進行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是當(dāng)前危害老年人健康和生命的重要疾病。目前全球有AD患者約沈00萬人，每年新發(fā)病例500萬，預(yù)計到2040-2050年全球?qū)⒐灿蠥D患者 1億以上。AD已成為當(dāng)前人口死亡的主要原因，65歲以上人群死亡的第4-5位原因。AD給家庭和社會帶來的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，在所有疾病中排位三，僅次于心臟病和癌癥。中國面臨著嚴(yán)峻的人口老齡化形勢，是世界上老年人口最多的國家。中國目前約有AD患者500萬，每年新發(fā)病例200萬-300萬；到2050年，我國將有AD患者800萬-1200萬，每年新發(fā)病例450 萬-600萬。在未來50年中，AD將成為中國一個非常沉重的經(jīng)濟和社會負(fù)擔(dān)。目前還沒有能夠預(yù)防AD發(fā)生、延緩或阻止AD病情進展的方法和藥物。在AD的臨床治療方面，迄今為止僅有幾個藥物被美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)用于輕度和中度AD的治療，但這些藥物都是神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)藥物，僅能暫時改善部分患者的認(rèn)知功能，不能延緩或阻止病情進展。Beta淀粉樣肽(Amyloid-beta，通?？s寫為Aβ )被認(rèn)為是AD的致病物質(zhì)。Αβ自身聚合能力強，形成比Αβ單體毒性更強的寡聚體和纖維。因此，如何抑制Αβ聚集、清除腦內(nèi)Αβ和阻斷Αβ的神經(jīng)毒性作用已經(jīng)成為研究人員丞待解決的問題。p75NTR是神經(jīng)生長因子受體，其編碼的核苷酸和氨基酸序列在Genbank中的編號為ΝΜ_002507。在AD患者腦內(nèi)p75NTR表達增加。p75NTR是Αβ的受體，Aβ通過與p75NTR 結(jié)合而引起腦內(nèi)神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性。P75NTR在代謝過程中受到酶的切割，釋放其胞外段(以下簡稱P75NTR-ECD)，該胞外段在阿爾茨海默病發(fā)病中的作用目前未見相關(guān)報道。實驗證明，P75NTR-E⑶作為p75NTR的Αβ結(jié)合部位，具有抑制Αβ聚集成寡聚體和纖維、促進Αβ纖維解聚、清除腦內(nèi)Αβ的作用；同時還能拮抗Αβ的神經(jīng)毒性作用(包括神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性)。目前已知，人免疫球蛋白IgG的Fc段能增強與其相融合的蛋白的穩(wěn)定性。編碼人Fc段的核苷酸和氨基酸序列在Genbank中的編號為ΧΜ_002348257. 1。實驗證明，將 P75NTR-ECD和Fc段聯(lián)接在一起構(gòu)建成融合蛋白(以下簡稱p75NTR_ECD/Fc)，與p75NTR_ECD 相比，？75附1 4^汗(3抑制4 0聚集、促進Αβ纖維解聚和拮抗Αβ神經(jīng)毒性的作用更強， 在體內(nèi)的半衰期也更長。p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe在AD防治中的作用在全世界范圍內(nèi)未見報道，這兩種蛋白質(zhì)可作為預(yù)防和治療AD的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是把p75NTR-E⑶或p75NTR_E⑶/Fe應(yīng)用在制備防治阿爾茨海默病的藥物中，用P75NTR-E⑶或p75NTR-E⑶/Fe制備的藥物可以抑制A β聚集、促進A β纖維的解聚，清除腦內(nèi)Αβ ；同時還能夠阻斷Αβ的神經(jīng)毒性作用(包括神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性)。本發(fā)明的目的是通過這樣的技術(shù)方案實現(xiàn)的，它包括有p75NTR受體的胞外段 P75NTR-E⑶，p75NTR-E⑶的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列， P75NTR-E⑶的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。在本發(fā)明中，P75NTR-E⑶是按照如下的方法進行制備的
選用pet28a為原核表達載體，克隆位點選用Nde I和B10I酶切位點，構(gòu)建 pet28a-p75NTR-ECD原核表達載體，步驟如下設(shè)計上游引物5’ -CCGCATATGGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACC 和下游引物5，-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3，，以人 cDNA 為模板，PCR克隆p75NTR-E⑶基因。膠回收純化目的產(chǎn)物p75NTR_E⑶。再用限制性內(nèi)切酶 Nde I和BioI酶切pet28a質(zhì)粒，膠回收大片段。同樣酶切處理PCR產(chǎn)物p75NTR_E⑶，膠回收純化酶切產(chǎn)物。用jM DNA連接酶連接p75NTR-E⑶和pet28a酶切產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒 pet28a-p75NTR-E⑶，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，并測序驗證，確認(rèn)編碼閱讀框。P75NTR-ECD蛋白的誘導(dǎo)表達將鑒定正確的重組質(zhì)粒pet28a-p75NTR_ECD轉(zhuǎn)化 CaCl2法制備的五col . BL-21感受態(tài)細(xì)胞，挑取新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于IOml含50 μ g/ ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)過夜。按1 100比例將過夜菌菌液轉(zhuǎn)接于 200ml含50μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)至0D600 0. 5 0. 6， 加IPTG至終濃度為0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C繼續(xù)培養(yǎng)4小時。離心收集菌體，菌體可進行純化或凍存于-70° C。將誘導(dǎo)表達的菌體按原菌液1 / 10的體積重懸于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超聲破碎細(xì)胞(6 X 10秒X 40赫茲)，再加入終濃度為1%的 Triton X-100,輕輕振蕩20min，于4° C，12000r/m離心15分鐘，收集上清，0. 45微米孔徑濾膜過濾，獲得P75NTR-E⑶蛋白粗制樣品。p75NTR-E⑶蛋白的純化超聲破碎獲得的p75NTR_E⑶蛋白樣品首先經(jīng)離子交換層析純化，方法如下(1) DEAE-纖維素的活化取IgDEAE32或52，加入蒸餾水浸泡過夜， 其間換幾次水，每次除去細(xì)小顆粒。抽干，改用0. 5ml/LNa0H溶液浸泡1小時以上，抽干，用無離子水漂洗，使PH至8左右。再改用0. 5ml/LHCl溶液浸泡1小時以上，用無離子水洗至pH6左右。(2)裝柱用0. 02mol/L, pH6. 7，磷酸鹽緩沖溶液浸泡已處理好的DEAE—纖維素，并更換1 2次。然后攪拌均勻，灌入層析柱中。0.02mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖溶液平衡。(3)上樣洗脫緩慢上樣后，用0. 02mol/L, pH6. 7磷酸鹽緩沖溶液洗脫，控制流速為 lml/min，收集洗脫液，在此條件下在收集液中首先出現(xiàn)的蛋白質(zhì)即為p75NTR_ECD蛋白。將上述離子交換層析得到的p75NTR-ECD蛋白進一步用疏水柱純化疏水填料為 Phenyl s印harose，純化時所用緩沖液為Buffer A:50mM PBS,0. 6M 硫酸銨，ρΗ7· 0 ;Buffer B: 50mM PBS，pH7.0。使用Buffer A平衡柱子至^Onm處的吸收值達到基線位置且保持不變，再用Buffer A稀釋樣品，后上樣；再用Buffer B行一個線性梯度(10倍柱體積)洗脫，流速:3ml/min，硫酸銨濃度從0.6M—直到0M。監(jiān)測并收集蛋白。上述獲得的樣品再經(jīng) sephadex G200分子篩層析，首先用pH7. 5 PBS平衡s印hadex G200分子篩柱子，將約柱體積1%樣品加入分子篩柱，后用相同緩沖液洗脫蛋白，流速15ml/min，監(jiān)測并收集蛋白樣品。
4液測定其蛋白含量、活性和純度后，脫鹽濃縮、分裝，即得到P75NTR-E⑶蛋白，-20° C低溫保存?zhèn)溆谩＆ˇ略诋a(chǎn)生過程中因酶切不同，產(chǎn)生具有38-42個氨基酸的不同Αβ類型，其中含 42個氨基酸的A β 42是A β的一個重要類型，其聚集特性和神經(jīng)毒性作用最強，常作為A β 的代表，因此本發(fā)明以Αβ 42為實驗對象。經(jīng)實驗證明，P75NTR-E⑶具有抑制Αβ42單體形成寡聚體和纖維，并具有促進 Αβ 42纖維解聚的作用。將制備的P75NTR-ECD蛋白注射到大腦的海馬中，1周以后檢測，發(fā)現(xiàn)p75NTR-E⑶蛋白注射部位的A β水平減少25%，表明p75NTR_E⑶具有清除腦內(nèi)A β的作用。同時，p75NTR-E⑶還能拮抗A β 42的神經(jīng)毒性作用(包括神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性)。 將制備的P75NTR-E⑶注射到小鼠靜脈中，通過ELISA的方法檢測其水平，發(fā)現(xiàn)p75NTR_E⑶ 血液半衰期為4小時。本發(fā)明也可以是這樣的技術(shù)方案，它是將所述的P75NTR-E⑶基因與人免疫球蛋白Fc段基因相連接，形成編碼P75NTR-E⑶/Fe的DNA，在以此為模板，形成p75NTR_E⑶/ Fc蛋白。P75NTR-E⑶/Fe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列， P75NTR-E⑶/Fe的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列。所述的P75NTR-E⑶/Fe是按照如下的方法進行制備的
首先選用pet22-b(+)作為原核表達載體，克隆位點選用Nde I，BioI酶切位點，構(gòu)建pet22-b(+)-p75NTR-E⑶/Fe融合基因。步驟如下利用重疊引物PCR方法構(gòu)建融合基因 p75NTR-ECD/Fc。設(shè)計引物 1 :5，-CCGCATATGAAGGAGGCATGCCCCACAGGC,弓丨物 2 :5，-T GGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGTAATCCAACGGCCAGGGATC ；引物 3 :5’ -GACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC,和引物 4 :5’ -CCGCTCGAGTCATTTACCCGG AGACAGGGAG-3’。其中，引物2和引物3的5’端含有30個互補堿基，為加入的鏈接序列 GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA。以人cDNA為模板，引物1和引物2用于PCR克隆 P75NTR-E⑶基因片段，膠回收純化；引物3和引物4用于PCR克隆Fc基因片段，回收純化； 然后將純化的P75NTR-E⑶和Fc基因產(chǎn)物按照1 1混合，加入到不含引物的PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)94° C，30秒；68° C，2分鐘；反應(yīng)20個循環(huán)，然后以反應(yīng)液為模板，加入引物1和引物4進行PCR反應(yīng)，膠回收純化目的產(chǎn)物p75NTR-ECD/Fc融合基因。再用限制性內(nèi)切酶 Nde I和BioI酶切pet22-b(+)質(zhì)粒，膠回收大片段。同時酶切處理p75NTR_ECD/Fc，膠回收純化酶切產(chǎn)物。用jM DNA連接酶連接p75NTR-E⑶/Fe和pet22_b (+)酶切產(chǎn)物，得到重組載體pet22b+-p75NTR-ECD/Fc，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，并測序驗證序列，確認(rèn)編碼框。P75NTR-E⑶/Fe融合蛋白的誘導(dǎo)表達與純化將鑒定正確的重組質(zhì)粒 pet22b+p75NTR-ECD/Fc轉(zhuǎn)化CaC12法制備的五col . BL-21感受態(tài)細(xì)胞，挑取新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于IOml含50yg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)過夜。按 1 100比例將過夜菌菌液轉(zhuǎn)接于200ml含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)至0D600 0. 5 0. 6，加IPTG至終濃度為0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C繼續(xù)培養(yǎng)4 小時。離心收集菌體，菌體可進行純化或凍存于-70° C。將誘導(dǎo)表達的菌體按原菌液1/10 的體積重懸于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超聲破碎細(xì)胞(6X 10secX40hz)，再加入終濃度為1%的Triton X-100,輕輕振蕩20分鐘，于4° C，12000r/m離心15分鐘，收集上清，作為蛋白樣品，0.45微米孔徑濾膜過濾；將蛋白樣品加入kpharose-SPA層析柱， 以20mM PBS, pH7. 4洗脫平衡，流速0. 5ml/min。p75NTR_ECD/Fc被柱上的SPA吸附住，其它蛋白質(zhì)隨洗脫液流出；再以PH4. 0檸檬酸緩沖液進行洗脫，即為提純的p75NTR-ECD/Fc ； 將收集的P75NTR-E⑶/Fe液測定其蛋白含量、活性和純度后，脫鹽濃縮、分裝、_20°C低溫保存?zhèn)溆谩嶒炞C明，p75NTR-E⑶/Fe不僅具備前述p75NTR_E⑶所具有的作用，而且其在體內(nèi)的半衰期比P75NTR-E⑶更長，在抑制A β 42聚集、促進A β 42纖維解聚、清除腦內(nèi)A β沉積和拮抗A β神經(jīng)毒性(包括神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性)等方面的作用也比P75NTR-E⑶更強。由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下的作用
1.抑制Αβ聚集成寡聚體和纖維，促進A β纖維的解聚，并清除腦內(nèi)Αβ。2.拮抗A β的神經(jīng)毒性作用(包括神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性)。本發(fā)明提供了發(fā)揮多重作用的AD防治新藥物，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。


本發(fā)明的

如下
圖1是p75NTR-E⑶和p75NTR-E⑶/Fe抑制A β 42形成寡聚體的比較圖。圖2是p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc抑制A β 42形成纖維的比較圖； 圖3是p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc促進A β 42纖維解聚的比較圖4是p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe海馬注射后清除局部總A β的比較圖； 圖5是p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe阻斷A β 42神經(jīng)毒性作用的示意圖； 圖6是p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe減輕Αβ 42引起的神經(jīng)突生長抑制的示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明
它包括有P75NTR-E⑶，p75NTR-E⑶的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列，P75NTR-E⑶的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列。在本發(fā)明中，p75NTR-E⑶是按照如下的方法進行制備的
選用pet28a為原核表達載體，克隆位點選用Nde I和B10I酶切位點，構(gòu)建 pet28a-p75NTR-ECD原核表達載體，步驟如下設(shè)計上游引物5’ -CCGCATATGGCACCTGAAC TCCTGGGGGGACC 和下游引物5，-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3，，以人 cDNA 為模板，PCR克隆p75NTR-E⑶基因。膠回收純化目的產(chǎn)物p75NTR_E⑶。再用限制性內(nèi)切酶 Nde I和BioI酶切pet28a質(zhì)粒，膠回收大片段。同樣酶切處理PCR產(chǎn)物p75NTR_E⑶，膠回收純化酶切產(chǎn)物。用jM DNA連接酶連接p75NTR-E⑶和pet28a酶切產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒 pet28a-p75NTR-E⑶，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，并測序驗證，確認(rèn)編碼閱讀框。p75NTR-ECD蛋白的誘導(dǎo)表達將鑒定正確的重組質(zhì)粒pet28a-p75NTR_ECD轉(zhuǎn)化 CaCl2法制備的五col . BL-21感受態(tài)細(xì)胞，挑取新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于IOml含50 μ g/ ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)過夜。按1 100比例將過夜菌菌液轉(zhuǎn)接于200ml含50μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)至0D600 0. 5 0. 6， 加IPTG至終濃度為0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C繼續(xù)培養(yǎng)4小時。離心收集菌體，菌體可進行純化或凍存于-70° C。將誘導(dǎo)表達的菌體按原菌液1 / 10的體積重懸于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超聲破碎細(xì)胞(6 X 10秒X 40赫茲)，再加入終濃度為1%的 Triton X-100,輕輕振蕩20min，于4° C，12000r/m離心15分鐘，收集上清，0. 45微米孔徑濾膜過濾，獲得P75NTR-E⑶蛋白粗制樣品。p75NTR-E⑶蛋白的純化超聲破碎獲得的p75NTR_E⑶蛋白樣品首先經(jīng)離子交換層析純化，方法如下(1) DEAE-纖維素的活化取IgDEAE32或52，加入蒸餾水浸泡過夜， 其間換幾次水，每次除去細(xì)小顆粒。抽干，改用0. 5ml/LNa0H溶液浸泡1小時以上，抽干，用無離子水漂洗，使PH至8左右。再改用0. 5ml/LHCl溶液浸泡1小時以上，用無離子水洗至pH6左右。(2)裝柱用0. 02mol/L, pH6. 7，磷酸鹽緩沖溶液浸泡已處理好的DEAE—纖維素，并更換1 2次。然后攪拌均勻，灌入層析柱中。0.02mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖溶液平衡。(3)上樣洗脫緩慢上樣后，用0. 02mol/L, pH6. 7磷酸鹽緩沖溶液洗脫，控制流速為 lml/min，收集洗脫液，在此條件下在收集液中首先出現(xiàn)的蛋白質(zhì)即為p75NTR_ECD蛋白。將上述離子交換層析得到的p75NTR-ECD蛋白進一步用疏水柱純化疏水填料為 Phenyl s印harose，純化時所用緩沖液為Buffer A:50mM PBS,0. 6M 硫酸銨，ρΗ7· 0 ;Buffer B: 50mM PBS，pH7.0。使用Buffer A平衡柱子至^Onm處的吸收值達到基線位置且保持不變，再用Buffer A稀釋樣品，后上樣；再用Buffer B行一個線性梯度(10倍柱體積)洗脫，流速:3ml/min，硫酸銨濃度從0.6M—直到0M。監(jiān)測并收集蛋白。上述獲得的樣品再經(jīng) sephadex G200分子篩層析，首先用pH7. 5 PBS平衡s印hadex G200分子篩柱子，將約柱體積1%樣品加入分子篩柱，后用相同緩沖液洗脫蛋白，流速15ml/min，監(jiān)測并收集蛋白樣品。 液測定其蛋白含量、活性和純度后，脫鹽濃縮、分裝，即得到P75NTR-E⑶蛋白，-20° C低溫保存?zhèn)溆?。?jīng)實驗證明，p75NTR-E⑶具有抑制A β 42單體形成寡聚體和纖維，并具有促進 Αβ 42纖維解聚的作用。將制備的P75NTR-ECD蛋白注射到大腦的海馬中，1周以后檢測， 發(fā)現(xiàn)p75NTR-E⑶蛋白注射部位的A β水平減少25%，表明p75NTR_E⑶具有清除腦內(nèi)A β 的作用。同時，P75NTR-E⑶還具有拮抗A β 42的神經(jīng)毒性作用(包括神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性)。將制備的P75NTR-ECD注射到小鼠靜脈中，通過ELISA的方法檢測其水平，發(fā)現(xiàn) P75NTR-E⑶血液半衰期為4小時。本發(fā)明也可以是這樣的技術(shù)方案，它是將所述的P75NTR-E⑶基因與人免疫球蛋白Fc段基因相連接，形成編碼P75NTR-E⑶/Fe的DNA，在以此為模板，形成p75NTR_E⑶/ Fc蛋白。P75NTR-E⑶/Fe的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 3所述的核苷酸序列， P75NTR-E⑶/Fe的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列。所述的p75NTR-E⑶/Fe是按照如下的方法進行制備的
首先選用pet22_b(+)作為原核表達載體，克隆位點選用Nde I，XhoI酶切位點，構(gòu)建pet22-b(+)-p75NTR-E⑶/Fe融合基因。步驟如下利用重疊引物PCR方法構(gòu)建融合基因 p75NTR-ECD/Fc。設(shè)計引物 1 :5，-CCGCATATGAAGGAGGCATGCCCCACAGGC 和弓丨物 2 :5，-T GGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTGTAATCCAACGGCCAGGGATC ；引物 3 :5_GACAAAACTCAC ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC 和引物 4 :5，-CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3’。其中，引物2和引物3的5’端含有30個互補堿基，為加入的鏈接序列 GACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA。以人cDNA為模板，引物1和引物2用于PCR克隆 P75NTR-E⑶基因片段，膠回收純化；引物3和引物4用于PCR克隆Fc基因片段，回收純化； 然后將純化的P75NTR-E⑶和Fc基因產(chǎn)物按照1 1混合，加入到不含引物的PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)94° C，30秒；68° C，2分鐘；反應(yīng)20個循環(huán)，然后以反應(yīng)液為模板，加入引物1和引物4進行PCR反應(yīng)，膠回收純化目的產(chǎn)物p75NTR-ECD/Fc融合基因。再用限制性內(nèi)切酶 Nde I和BioI酶切pet22-b(+)質(zhì)粒，膠回收大片段。同時酶切處理p75NTR_ECD/Fc，膠回收純化酶切產(chǎn)物。用jM DNA連接酶連接p75NTR-E⑶/Fe和pet22_b (+)酶切產(chǎn)物，得到重組載體pet22b+-p75NTR-ECD/Fc，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，并測序驗證序列，確認(rèn)編碼框。p75NTR-E⑶/Fe融合蛋白的誘導(dǎo)表達與純化將鑒定正確的重組質(zhì)粒 pet22b+p75NTR-ECD/Fc轉(zhuǎn)化CaC12法制備的五col . BL-21感受態(tài)細(xì)胞，挑取新鮮轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于IOml含50yg/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)過夜。按 1:100比例將過夜菌菌液轉(zhuǎn)接于200ml含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37° C振蕩培養(yǎng)至0D600 0. 5 0. 6，加IPTG至終濃度為0. 1-0. 5mmol/L，移至30° C繼續(xù)培養(yǎng)4 小時。離心收集菌體，菌體可進行純化或凍存于-70° C。將誘導(dǎo)表達的菌體按原菌液1/10 的體積重懸于PBS中，后加入50mmol/L PMSF 15 μ 1后超聲破碎細(xì)胞(6X 10secX40hz)，再加入終濃度為1%的Triton X-100,輕輕振蕩20分鐘，于4° C，12000r/m離心15分鐘，收集上清，作為蛋白樣品，0.45微米孔徑濾膜過濾；將蛋白樣品加入kpharose-SPA層析柱， 以20mM PBS, pH7. 4洗脫平衡，流速0. 5ml/min。p75NTR_ECD/Fc被柱上的SPA吸附住，其它蛋白質(zhì)隨洗脫液流出；再以PH4. 0檸檬酸緩沖液進行洗脫，即為提純的p75NTR-ECD/Fc ； 將收集的P75NTR-E⑶/Fe液測定其蛋白含量、活性和純度后，脫鹽濃縮、分裝、_20°C低溫保存?zhèn)溆?。實驗證明，p75NTR-E⑶/Fe不僅具備前述p75NTR_E⑶所具有的作用，而且其在體內(nèi)的半衰期比P75NTR-E⑶更長，在抑制A β 42聚集、促進A β 42纖維解聚、清除腦內(nèi)A β沉積和拮抗Αβ神經(jīng)毒性(包括神經(jīng)元死亡和神經(jīng)末梢變性)等方面的作用也比P75NTR-E⑶更強。下面結(jié)合附圖和實驗例對發(fā)明作進一步說明
實驗例1 :p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc抑制A β 42寡聚體形成將2. 5 μ g A β 42 (終濃度為20 mM)分別與p75NTR_ECD/Fc (終濃度為IOmM)、 P75NTR-E⑶(終濃度為IOmM)或人IgG (以下簡稱HulgG，終濃度為IOmM)混合，4 °C孵育 1天。以等量A β 42 (終濃度為20 mM)不孵育，或等量A β 42 (終濃度為20 mM)單獨4 °C 孵育為對照。然后行蛋白電泳，采用6E10-biotin抗體作蛋白印記檢測，測定Αβ42寡聚體條帶的含量。如圖1所示，與Αβ 42單獨孵育組(Ab)比較(為方便比較，將此組的Aβ 42寡聚體含量作為100%)，HuIgG與Αβ 42共同孵育組(Ab+HuIgG)的Αβ 42寡聚體含量為78%， Aβ 42和p75NTR-ECD共同孵育組(Ab+p75NTR_ECD)的Αβ 42寡聚體含量為36%, Aβ 42和 p75NTR-ECD/Fc共同孵育組(Ab+p75NTR_ECD/Fc)的A β 42寡聚體含量為25%。上述結(jié)果表明p75NTR-ECD和p75NTR_ECD/Fc均具有抑制A β 42單體形成寡聚體的作用，p75NTR-ECD/Fc的作用效果強于p75NTR-E⑶。實驗例2 p75NTR-ECD 和 p75NTR_ECD/Fc 抑制 A β 42 纖維形成
將2. 5 μ g A β 42 (終濃度為20 mM)分別與p75NTR_ECD/Fc (終濃度為IOmM)、 P75NTR-E⑶(終濃度為IOmM)或HuIgG (終濃度為IOmM)混合，37 °C孵育4天。以等量 Αβ42 (終濃度為20 mM)不孵育，或等量A β 42 (終濃度為20 mM)單獨37 °C孵育為對照。 然后加入Thioflavine T，檢測熒光強度(激發(fā)波長450nm，發(fā)射波長482nm)。熒光強度越高，表明Aβ纖維量越多。如圖2所示，與Αβ單獨孵育組(Ab)比較(為方便比較，將此組的熒光強度作為 100%)，HuIgG 與 Αβ 共同孵育組(Ab+HuIgG)熒光強度為 103%，Aβ 42 與 p75NTR_ECD 共同孵育組(Ab+p75NTR-ECD)的熒光強度為25%，Aβ 42與p75NTR_ECD/Fc共同孵育組 (Ab+p75NTR-ECD/Fc)的熒光強度 10%。上述結(jié)果表明p75NTR_ECD 和 p75NTR_ECD/Fc 均具有抑制A β 42纖維形成的作用，p75NTR-E⑶/Fe的作用效果強于p75NTR_E⑶。實驗例3 :p75NTR-ECD 和 p75NTR_ECD/Fc 促進 A β 42 纖維的解聚
首先將2. 5 μ g A β 42溶于DMEM (終濃度20 mM),37 °C孵育4天，形成A β 42纖維。 將形成的Aβ 42纖維和p75NTR-ECD (終濃度10 μ Μ)、p75NTR_ECD/Fc (終濃度10 μ Μ)或 HuIgG (終濃度10 μ Μ)混合，37 °C孵育3天。然后加入Thioflavine T，檢測熒光強度(激發(fā)波長450nm，發(fā)射波長482nm)。熒光強度越高，表明Αβ纖維量越多。如圖3所示，結(jié)果顯示，與A β纖維單獨孵育組(Ab )比較(為方便比較，將此組熒光作為100%)，Aβ纖維與P75NTR-ECD共同孵育組(Ab+p75NTR_ECD)熒光強度為56%，Αβ纖維與p75NTR-ECD/Fc共同孵育組(Ab+p75NTR_ECD/Fc)后熒光強度為35%，A β纖維與HuIgG 共同孵育后(Ab+HuIgG)熒光強度為92%。上述結(jié)果表明p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe均具有促進A β 42纖維解聚的作用，p75NTR-E⑶/Fe的作用強于p75NTR_E⑶。4 海馬注射p75NTR_ECD/Fc對Αβ的清除作用
采用9月齡Mo/Hu APPswe PSldE9 AD小鼠。該小鼠為雙重轉(zhuǎn)基因小鼠，載有人早老素蛋白-1 DeltaE9突變體和人APP瑞典突變體(APPSwe，KM 593/594 NL)嵌合基因，在腦內(nèi)產(chǎn)生大量的Αβ沉積，是公認(rèn)的AD動物模型。將小鼠隨機分為4組，每組8只。小鼠麻醉后，在不同組小鼠左側(cè)海馬分別注入2μ 1 p75NTR-ECD (Inmol )，p75NTR_ECD/Fc (lnmol), HuIgG (lnmol)或PBS，右側(cè)海馬注入2 μ 1 PBS。1周后取雙側(cè)海馬，采用ELISA方法測定左右兩側(cè)海馬的Aβ含量。左側(cè)海馬Aβ相對含量=左側(cè)海馬Aβ含量/右側(cè)海馬Aβ含量。如圖4所示，與對照組(PBS)比較(為方便比較，該組A β含量作為100%)， P75NTR-ECD 注射組(p75NTR_ECD)海馬的 Αβ 含量為 67%，p75NTR_ECD/Fc 注射組 (p75NTR-ECD/Fc)海馬Αβ含量為45%，而HuIgG注射組(HuIgG)海馬A β含量為98%。上述結(jié)果表明p75NTR-E⑶和p75NTR-E⑶/Fe具有清除腦內(nèi)A β的作用，p75NTR_E⑶/Fe的作用強于 P75NTR-ECD。實驗例5 :p75NTR_E⑶和p75NTR_E⑶/Fe對A β致神經(jīng)細(xì)胞死亡的拮抗作用
采用神經(jīng)細(xì)胞株R2L1 (表達P75NTR)，于96孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為0.5X IO4 cells/ 孔。培養(yǎng)基DMEM中加入20 μ M A β 42，然后加入p75NTR_ECD (終濃度10 μ M)、p75NTR_ECD/ Fc (終濃度10 μ Μ)或HuIgG (終濃度10 μ Μ)。同時設(shè)立僅以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為正常對照。三復(fù)孔。在37°C孵育20小時后，然后加入MTT，孵育4小時。在加入溶解液， 37° C再孵育12小時，600nm處讀取光密度值。光密度值越高，表明細(xì)胞存活數(shù)越多。如圖5所示，結(jié)果表明，與正常對照組比較(為方便比較，將此組的光密度值設(shè)為 100%)，HuIgG 組(Ab+HuIgG)的光密度值為 32%，p75NTR_ECD 組(Ab+p75NTR_ECD)的光密度值為 68%，p75NTR-ECD/Fc 組(Ab+p75NTR_ECD/Fc)的光密度值為 90%。表明 p75NTR_ECD 和p75NTR-E⑶/Fe具有拮抗A β 42神經(jīng)毒性的作用，p75NTR_E⑶/Fe的作用效果強于 P75NTR-ECD。實驗例6 :p75NTR_E⑶和p75NTR_E⑶/Fe對A β致神經(jīng)突起變性的拮抗作用
采用神經(jīng)細(xì)胞株SH-SY5Y，于M孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞密度為0. 5 X IO3 cells/孔，在培養(yǎng)基DMEM中加入ΙΟμΜ all-trans retinoic acid, 37。C培養(yǎng)7天。然后在培養(yǎng)體系中加入 A β 42 (終濃度 1 μ Μ),同時加入 p75NTR-ECD (終濃度 1 μ M)、p75NTR_ECD/Fc (終濃度 1 μ Μ) 或HuIgG (終濃度ΙμΜ)。同時設(shè)立僅以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為正常對照。三復(fù)孔。 在37°C孵育5天。去培養(yǎng)基，然后加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞。用抗Beta-tubulin抗體， 行常規(guī)免疫組化染色。20倍鏡下拍照，測量細(xì)胞突起長度。如圖6所示，結(jié)果表明，與正常對照組比較(為方便比較，將正常對照組的細(xì)胞突起平均長度設(shè)為100%)，HuIgG組(Ab+HuIgG)的細(xì)胞突起長度為35%，p75NTR_ECD組 (Ab+p75NTR-ECD)的細(xì)胞突起長度為 61%，p75NTR-ECD/Fc 組(Ab+p75NTR_ECD/Fc)的細(xì)胞突起長度為82%。表明p75NTR-E⑶和p75NTR_E⑶/Fe具有拮抗A β 42引起的神經(jīng)突起變性作用，p75NTR-ECD/Fc 的作用效果強于 p75NTR_ECD。實驗例7 :p75NTR_E⑶和p75NTR_E⑶/Fe在體內(nèi)半衰期的比較
將AD小鼠分兩組，每組各5只，通過尾靜脈注射，分別注入5nmol的p75NTR_E⑶或 p75NTR-ECD/Fc。分別與注射后0，1,2,4,8, 12，18和24小時取尾靜脈血，通過ELISA方法， 檢測血液中的P75NTR-ECD或p75NTR_ECD/Fc濃度，計算半衰期。結(jié)果表明，p75NTR_ECD在體內(nèi)的半衰期為4小時，而p75NTR-E⑶/Fe的半衰期為10小時。
權(quán)利要求
1.一種具有序列表中SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列的P75NTR-ECD在制備防治阿爾茨海默病的藥物中應(yīng)用。
2.一種具有序列表中SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列的p75NTR-ECD在制備防治阿爾茨海默病的藥物中應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于具有序列表中SEQID NO. 3所述的核苷酸序列的p75NTR-E⑶/Fe在制備防治阿爾茨海默病的藥物中應(yīng)用，所述的p75NTR_E⑶/Fe是將p75NTR-E⑶基因與人免疫球蛋白Fc段基因相連接，形成編碼p75NTR_E⑶/Fe的DNA。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于具有序列表中SEQID NO. 4所述的氨基酸序列的p75NTR-E⑶/Fe在制備防治阿爾茨海默病的藥物中應(yīng)用，所述的p75NTR_E⑶/Fe是將p75NTR-E⑶基因與人免疫球蛋白Fc段基因相連接，形成編碼p75NTR_E⑶/Fe的DNA，然后以此為模板，形成P75NTR-E⑶/ 的蛋白質(zhì)。
全文摘要
一種防治阿爾茨海默病的藥物，它可以包括有p75NTR-ECD，其核苷酸序列是序列表中SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，其氨基酸序列是序列表中SEQIDNO.2所述的氨基酸序列。它也可以p75NTR-ECD/Fc，其核苷酸序列是序列表中SEQIDNO.3所述的核苷酸序列，其氨基酸序列是序列表中SEQIDNO.4所述的氨基酸序列。本發(fā)明不僅具有抑制Aβ聚集成寡聚體和纖維、促進Aβ纖維的解聚、清除腦內(nèi)Aβ的作用，而且還具有拮抗Aβ神經(jīng)毒性的作用。本發(fā)明提供了發(fā)揮多重作用的阿爾茨海默病治療新藥物，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/62GK102233128SQ20101056128
公開日2011年11月9日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者周新富, 王延江 申請人:王延江