專利名稱：兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中魚類與蟹類的基因工程，具體涉及具有抗菌活性的鋸 緣青蟹抗菌肽SCyg0nadin2與大黃魚抗菌肽h印Cidin的融合表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的成熟及其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用，水生動物抗菌 肽的基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)與研究，(1、Brogden KA. Antimicrobial peptides :pore formers or metabolic inhibitors in bacteria[J]. Nat. Rev. Microbiol. 2005, 3 :238-250 ；2> S.E.Lofgren, L. C. Miletti, M. Steindel, E. Bachere, M. A. Barracco. Trypanocidal and leishmanicidal activities of different antimicrobial peptides (AMPs) isolated from aquatic animals. [J]. Experimental Parasitology. 2008,118 :197-202) SiJi^Jf 發(fā)針對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中疾病的預(yù)防與治療的相應(yīng)抗菌肽藥物具有廣闊的潛在應(yīng)用價(jià)值。利用 分子生物學(xué)技術(shù)，可建立高效、大量表達(dá)水生動物抗菌肽基因工程菌株，實(shí)現(xiàn)在體外獲得有 活性的、且能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的抗菌肽產(chǎn)品。將此類產(chǎn)品代替抗生素添加到飼料中，能增強(qiáng) 水產(chǎn)動物的免疫力，提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，還能避免抗生素在動物體中的富集。該方法不僅突破了 直接從水生動物體中提煉或者化學(xué)合成抗菌肽所帶來的產(chǎn)量低、費(fèi)用高等局限性，還能為 目前我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中長期使用抗生素所帶來的細(xì)菌耐藥性及抗生素污染等造成的問題提 出可供參考的解決方案。鋸緣青蟹抗菌肽SCyg0nadin2與大黃魚抗菌肽h印cidin均是來自于水產(chǎn)動物 (3、Cloning and expression of a hepcidin gene from a marine fish(Pseudosciaena crocea)and the antimicrobial activity of synthetic peptide. [J]. Peptides,2009, 30 :638-646)。本發(fā)明所用的SCyg0nadin2來自于無脊椎動物，在固有免疫中發(fā)揮作用，而 hepcidin來自于低等脊椎動物，與適應(yīng)性免疫密切相關(guān)。迄今，還未有關(guān)于這兩種類型抗菌 肽串聯(lián)表達(dá)的研究報(bào)道。因此研究水產(chǎn)動物養(yǎng)殖業(yè)中這兩個主要經(jīng)濟(jì)物種的抗菌肽基因串 聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物及其活性特點(diǎn)，具有重要的實(shí)踐價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法。所述兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的基因包括鋸緣青蟹抗菌肽 scygonadin2基因、連接肽和大黃魚抗菌肽h印cidin基因；所述兩種海洋動物抗菌肽基因 的融合表達(dá)產(chǎn)物命名為抗菌肽scygonadin2-h印cidin。所述鋸緣青蟹抗菌肽SCyg0nadin2的基因序列為cacccatggc gaatggcctg gcactcaaca gacttatgaa taaggccgtc gacgccatag 60tttatatggt tggacaacaa gacgcaggcg tctctcttct gggtcaccca tgtctggtgg 120agtcagcgaa acaaccggaa ggcatctaca ccgcagtaat gtcgtgtgct tcctggaccc 180ctcgcttcgt tggggaaggc acaagcgagg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttcgatca 240 gaagctttat ccgtaaggca tccgattacc agctgttaag taaagaagac ctcgaggact 300 ggcttgcttc ctacggttct ccaggttccg gt332
其中第1 3位的堿基序列cac為保護(hù)堿基，第4 9位堿基序列ccatgg為酶切 第315 332位的堿基序列g(shù)gttct ccaggttccg gt為連接肽。 所述大黃魚抗菌肽hepcidin的基因序列為
ggttctccag gttccggtgt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat 60 tttgctgatc cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaat 120 cgtcagggca gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga 180 tgtggtatct gctgcaggtt c ctcgagcgg210
其中第1 18位的堿基序列g(shù)gttct ccaggttccg gt為連接肽，第202 207位 基序列ctcgag為Biol酶切位點(diǎn)，第208 210位的堿基序列egg為保護(hù)堿基。所述連接肽的氨基酸序列為
Gly Ser Pro Gly Ser Gly
15
所述兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的氨基麵■序列為
MetAlaAsnGlyLeuAlaLeuAsnArgLeuMetAsnLysAlaValAsp
151015
AlaValTyrMetValGlyGlnGlnAspAlaGlyValSerLeuLeuGly
202530
HisProCysLeuValGluSerAlaLysGlnProGluGlylieTyrThr
354045
AlaValMetSerCysAlaSerTrpThrProArgPheValGlyGluGly
505560
ThrSerGluValGluLeuGluAlaLeuLysGlySerlieArgSerPhe
65707580
lieArgLysAlaSerAspTyrGlnLeuLeuSerLysGluAspLeuGlu
859095
AspTrpLeuAlaSerTyrGlySerProGlySerGlyValProAlaAsn
100105110
GluGluGlnGluLeuGluGlnGlnlieTyrPheAlaAspProGluMet
115120125
ProValGluSerCysLysMetProTyrTyrMetArgGluAsnArgGln
130135140
GlySerProAlaArgCysArgPheCysCysArgCysCysProArgMet
145150155160
ArgGlyCysGlylieCysCysArgPheLeuHisHisHisHisHisHis
165170175
其中103 108位氨基酸序列為連接肽。
所述兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的制備方法包括以下步驟1)克隆鋸緣青蟹sCyg0nadin2抗菌肽基因和大黃魚hepcidin抗菌肽基因，并PCR 擴(kuò)增出鋸緣青蟹與大黃魚的融合基因sCyg0nadin2-h印cidin ；2)將融合基因scygonadir^-kpcidin導(dǎo)入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶融合基因 scygonadin2-hepcidin的重組表達(dá)載體；3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得可表達(dá)融合基因scyg0nadin2-h印cidin 的工程菌；4)發(fā)酵培養(yǎng)可表達(dá)融合基因sCyg0nadin2-h印cidin的工程菌，分離純化發(fā)酵液 即得兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物。在步驟幻中，所述表達(dá)載體可為pET28a。在步驟幻中，所述宿主細(xì)胞可為大腸桿菌。本發(fā)明借助基因工程技術(shù)，利用pET28a原核表達(dá)載體，成功高效地表達(dá)出具有抗 菌活性的鋸緣青蟹抗菌肽SCyg0nadin2與大黃魚抗菌肽hepcidin的融合表達(dá)產(chǎn)物，使得串 聯(lián)抗菌肽的藥用價(jià)值得到開發(fā)。與現(xiàn)有抗菌肽相比，兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá) 產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)如下1、抗菌肽8(^80皿肚112來自鋸緣青蟹，抗菌肽11印(^肚11來自大黃魚。這兩種肽的 分子量都較小，分別表達(dá)的產(chǎn)物很可能會被大腸桿菌自身酶解；而采用串聯(lián)表達(dá)的方式，可 以增大表達(dá)產(chǎn)物的分子量，相比之下會更加穩(wěn)定。2、scygonadin2作為無脊椎動物體內(nèi)抗菌肽，主要在非特異免疫中發(fā)揮作用；而 hepcidin作為脊椎動物抗菌肽，涉及到脊椎動物的特異性免疫。二者的功能機(jī)制有所差異， 從而使得串聯(lián)產(chǎn)物的藥用開發(fā)對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重要研究價(jià)值。3、兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物在％ig/ml濃度下能夠抑制包括金黃 色葡萄球、溶壁微球菌、藤黃微球菌、谷氨酸棒狀桿菌、施氏假單胞菌和熒光假單胞菌在內(nèi) 的6種菌的生長。并且，該蛋白在稀釋后(濃度為6ym0l/L)對施氏假單胞菌、溶壁微球菌 和藤黃微球菌的生長仍然有抑制作用。


圖1為鋸緣青蟹SCyg0nadin2和大黃魚h印cidin PCR產(chǎn)物的瓊脂電泳圖。在圖1 中，1為大黃魚h印cidin PCR產(chǎn)物；2為鋸緣青蟹scygonadin2PCR產(chǎn)物；M為DL2000Marker ； 250、100代表DL2000Marker中核酸片斷的堿基數(shù)目，核酸數(shù)目單位為bp，即堿基數(shù)。圖2為鋸緣青蟹SCyg0nadin2與大黃魚h印cidin融合基因的瓊脂電泳圖。在圖 2 ψ,Μ^ DL2000Marker ；1 為 scygonadin2-hepcidin ffi^SS ；500 DL2000Marker ψ 核酸片斷的堿基數(shù)目，核酸數(shù)目單位為bp，即堿基數(shù)。圖3為將pET28a空質(zhì)粒與pET28a/scygonadin2_h印cidin重組質(zhì)粒在同樣誘導(dǎo) 條件下，取總菌體進(jìn)行的SDS-PAGE電泳圖。在圖3中，M為SDS-PAGE預(yù)染蛋白質(zhì)Marker ； 1為pET28a空載體IPTG誘導(dǎo)證后的菌體總蛋白；2為pET28a/scygonadin2_h印cidin 重組表達(dá)載體IPTG誘導(dǎo)5h后的菌體總蛋白；3為pET28a/scygonadin2-t^pcidin重 組表達(dá)載體未誘導(dǎo)菌體總蛋白；49KDa、34KDa、25KDa、19KDa代表預(yù)染蛋白質(zhì)Marker中 各蛋白片斷的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位，即千道爾頓；A代表融合表達(dá)產(chǎn)物scygonadin2-hepcidin 蛋白。圖4為表達(dá)菌體超聲破碎并離心后的上清與沉淀的SDS-PAGE電泳圖。在圖4中， M為SDS-PAGE預(yù)染蛋白質(zhì)Marker ；1為pET28a/scygonadin2_hepcidin誘導(dǎo)菌體超聲破碎 后的沉淀；2為pET28a/scygonadin2-h印cidin誘導(dǎo)菌體超聲破碎后的上清；49KDa、;34KDa、 25KDa、19KDa代表預(yù)染蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片斷的分子量；KDa代表蛋白分子量的單位， 即千道爾頓；A代表融合表達(dá)產(chǎn)物scygonadin2-h印cidin蛋白。圖5為親和層析柱(IMAC)純化目的蛋白圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為流經(jīng)層析柱的溶 液的體積，單位為ml ；縱坐標(biāo)為280nm紫外吸收光密度值，單位為mAU ；A代表與層析柱結(jié)合 后又被洗脫下的蛋白峰。圖6為目的蛋白純化前和純化后的樣品SDS-PAGE電泳圖。在圖6中，1為經(jīng)過 IMAC柱純化后得到的目的蛋白；2為純化前的蛋白樣品；M為SDS-PAGE預(yù)染蛋白質(zhì)Marker ； 49KDa、34KDa、25KDa、19KDa代表預(yù)染蛋白質(zhì)Marker中各蛋白片斷的分子量；KDa代表蛋白 分子量的單位，即千道爾頓；A代表融合表達(dá)產(chǎn)物sCyg0nadin2-h印cidin蛋白。圖7為Bradford法蛋白濃度測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。在圖7中，橫坐標(biāo)為A595，即為595nm 可見吸收光密度值，縱坐標(biāo)為BSA(標(biāo)準(zhǔn)蛋白)濃度，單位為mg/ml ；標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為 Y = O. 8499X-0. 6551，R2 = 0. 9902。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1重組表達(dá)質(zhì)粒pEI^8a/scygonadin2-h印cidin的構(gòu)建1)鋸緣青蟹scygonadin2和大黃魚h印cidin基因的獲得根據(jù)pET28a載體上多克隆位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)合成鋸緣青蟹scygonadiM抗菌肽基因 (Genbank登錄號:DQ872630)和大黃魚h印cidin抗菌肽基因(Genbank登錄號:EF156401) 的特異性上、下游引物。在鋸緣青蟹scygonadiM基因上游引物5'端加上NcoI酶切位點(diǎn)， 上游引物Fl為Fl 5' CACCCATGGCGAATGGCCTGGCACTCAACAGGCTTATG 3‘其中黑斜體表示引入的NcoI酶切位點(diǎn)。在鋸緣青蟹scygonadiM抗菌肽基因下游引物的5'端突變BioI酶切位點(diǎn)，5'端 加入含有6個氨基酸的連接肽基因序列，下游引物Rl為Rl 5' ACCGGAACCTGGAGAACCGTAGGAAGCAAGCCAGTCTTCGAGGTC 3’其中黑斜體表示連接肽。在大黃魚h印cidin抗菌肽基因上游引物5'端加入互補(bǔ)連接肽基因序列，上游引 物F2為F2 5' GGTTCTCCA GGTTCCGGTGTCCCAGCCAATGAAGAGCAAG 3’其中黑斜體表示連接肽。在大黃魚h印cidin抗菌肽基因下游引物5'端加上B10I酶切位點(diǎn)，下游引物R2 為R2 5' CCGCTCGAGGAACCTGCAGCAGATACC 3‘其中黑斜體表示引入的BioI酶切位點(diǎn)。
以上引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，使用前用無菌超純水稀釋至 10 μ mol/Lo2)以鋸緣青蟹scygonadin2cDNA和大黃魚h印cidin cDNA重組pPMD18_T陽性質(zhì) 粒為擴(kuò)增模板，分別以Fl和F2為上游引物，Rl和R2為下游引物，以Ex Taq酶(購自TaKaRa 公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增兩種目的片段，反應(yīng)體系為無菌超純水 81 μ 1無菌超純水 81 μ 1
IOX反應(yīng)緩沖液(含Mfe)10 μIOX反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)10 μ 1
dNTPs(IOmmol/L each)2μ 1dNTPs(10mmol/L each)2μ 1
pPMD18-T/scygonadin2 質(zhì)粒2μ 1pPMD18-T/hepcidin 質(zhì)粒2μ 1
Fl(20pmol/y 1)2μ 1F2(20pmol/y 1)2μ 1
Rl(20pmol/y 1)2μ 1R2(20pmol/y 1)2μ 1
Ex Taa 酶(5U/μ 1)1 μ 1Ex Taa 酶(5U/μ 1)1 μ 1總反應(yīng)體積100 μ 1總反應(yīng)體積 100 μ 1混合均勻，在熱循環(huán)儀上按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)鋸緣青蟹scygonadin2 基因 PCR 程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 30sec，57°C 退火30sec，72°C延伸30sec ；進(jìn)行30個循環(huán)后，72°C延伸7min。大黃魚h印cidin基因PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；94°C變性30sec，62°C退火 30sec, 72°C延伸30sec ；進(jìn)行30個循環(huán)后，72°C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，將所有反應(yīng)液進(jìn)行2% (W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳，用Axegen凝膠 回收試劑盒回收特異性片段，得到鋸緣青蟹SCyg0nadin2基因PCR產(chǎn)物長度為300bp，大黃 魚h印cidin基因PCR產(chǎn)物長度為183bp。3)融合基因 scygonadin2-h印cidin 的制備以步驟2)中回收的兩種PCR產(chǎn)物為模板，以鋸緣青蟹SCyg0nadin2基因上游引物 Fl和大黃魚h印cidin基因下游引物R2為上、下游引物，用Ex Taq酶擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體 系為無菌超純水79 μ 1
IOX反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)10 μ 1
dNTPs(10mM each)2μ 1
scygonadin2 片段2μ 1
hepcidin 片段2μ 1
Fl(20pmol/y 1)2μ 1
Rl(20pmol/y 1)2μ 1
Ex Taq 酶(5U/ μ 1)1 μ 1_總反應(yīng)體積100 μ 1混合均勻，在熱循環(huán)儀上按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性5min ；94°C變性 30sec，63°C退火 30sec，72°C延伸 30sec ；進(jìn)行 30 個循環(huán)后，72°C延伸 7min。反應(yīng)結(jié)束后，將所有反應(yīng)液進(jìn)行2% (W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳，用Axegen凝膠回收試劑盒回收特異性片段，得到融合基因SCyg0nadin2-h印cidin PCR產(chǎn)物長度為 525bp04)預(yù)連接DNA片段的制備將上步中回收的PCR產(chǎn)物，用Nco I和Bio I進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)液置于37°C水浴中
反應(yīng)他。酶切體系為PCR 回收產(chǎn)物26 μ 1IOXK酶反應(yīng)緩沖液10 μ 1IOXBSA10 μ 1Nco I和Xho I限制性內(nèi)切酶各5 μ 1無菌超純水44 μ 1_總反應(yīng)體積100 μ 1反應(yīng)結(jié)束后，用2% (W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳檢查酶切效率，用Axegen凝膠回 收試劑盒回收目的片段?；幂d體的處理將pET28a原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，大量提取質(zhì)粒，具體操作方法為取Ιμ pET28a空載體轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α，涂布在含有卡那霉素(50 μ g/ml)的 LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落，并擴(kuò)大到IOml LB液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)； 離心收集菌體，堿裂解法提取質(zhì)粒；將pET28a空載體進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)液置于37°C水浴中
反應(yīng)他。酶切體系為pET28a 載體60 μ 1IOXK酶反應(yīng)緩沖液10 μ 110XBSA10 μ 1Nco I和Xho I限制性內(nèi)切酶各5 μ 1無菌超純水10 μ 1_總反應(yīng)體積100 μ 1反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液進(jìn)行(W/V)瓊脂糖凝膠-TAE電泳檢查酶切效率。用 Qiagen凝膠回收試劑盒回收處理好的載體片段。處理好的載體具有Nco I和)(h0 I酶切位 點(diǎn)的粘性末端，且雙酶切及回收處理后將成為單一的線性化條帶。6)重組表達(dá)載體的連接、轉(zhuǎn)化和鑒定將雙酶切處理后具有相同粘性末端的pET28a原核表達(dá)載體與含有鋸緣青蟹 scygonadin2基因和大黃魚h印cidin基因的DNA片段連接，反應(yīng)體系如下pET28a載體10 μ 1
融合基因8μ 1
10XT4DNA Ligase Buffer (連接緩沖液)2. 5μ 1
T4DNA Ligase2μ 1
無菌超純水2. 5μ 1
總反應(yīng)體積25 μ 1將反應(yīng)液置于16°C連接過夜；次日，取全部連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化至50μ1 Ε. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有卡那霉素(50yg/ml)的LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)過夜 后，挑取陽性菌落，以Fl和R2為上、下游引物，如前所述用PCR法鑒定陽性克隆菌，由上海 英俊公司進(jìn)行DNA核苷酸序列測定，結(jié)果顯示連接正確，核苷酸的開放閱讀框(ORF)編碼連 續(xù)，得到pET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重組表達(dá)質(zhì)粒(參見圖1和幻。該表達(dá)載體采用 T7啟動子，scygonadin2與h印cidin基因之間有6個氨基酸組成的連接肽，在插入目的基 因片段的C端有6個組氨酸，便于采用親和層析純化目的蛋白。實(shí)施例2pEI^8a/scygonadin2-h印cidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)1)誘導(dǎo)表達(dá)堿裂解法提取經(jīng)鑒定正確的pET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重組 質(zhì)粒，用熱擊法將pET28a空質(zhì)粒和pET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有卡那霉素(50 μ g/ml)的LB固體培養(yǎng)基平板 上，37°C培養(yǎng)過夜；次日挑取若干pET28a空質(zhì)粒和pET28a/scygonadin2-h印cidin重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株后生長的單菌落，分別接種于20ml LB液體培養(yǎng)基中(含50 μ g/ml卡那霉 素)，200rpm、37°C振蕩培養(yǎng)至0D_約為0. 3 (OD600為細(xì)菌培養(yǎng)液在600nm處的吸光值)，然 后加入IPTG至終濃度為0. 6mmol/L，在下180rpm振蕩培養(yǎng)5h。2)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測融合蛋白表達(dá)以pET28a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 的 E. coliBL21(DE3)為對照，以 pEI^8a/scygonadin2_h印cidin 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的 E. coli BL2KDE3)為實(shí)驗(yàn)組，取若干份對照組及實(shí)驗(yàn)組IPTG誘導(dǎo)前后的Iml菌液，分別離心收集 菌體；加入50 μ 11 X SDS加樣緩沖液和5 μ 1 β -巰基乙醇，沸水浴IOmin后，12000rpm離 心5min，取15 μ 1上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。配置SDS-PAGE凝膠。采用5%積層膠和12% 分離膠，以8V/cm電壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠(12%分離膠)后，以12V/cm電壓電 泳，溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部后，取出凝膠，用0. 5%考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2 3h，脫 色后掃描分析?？梢妏ET28a/SCyg0nadin2-h印cidin重組質(zhì)粒在誘導(dǎo)后較誘導(dǎo)前具有明顯 的蛋白質(zhì)條帶；并且重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒相比，也具有明顯的表達(dá)蛋白帶。重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白 分子量在23kDa左右，與計(jì)算的理論分子量相似(參見圖3)。實(shí)施例3pEI^8a/scygonadin2-h印cidin重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的可溶 性分析1)按如上所述方法轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)20ml種子液，取2ml種子液加至200ml含有50 μ g/ ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C下200rpm搖床培養(yǎng)1. 5 池至OD6tltl約0. 3，加入 IPTG至濃度為0. 6mmol/L, 下180rpm搖床誘導(dǎo)5h。2)離心收集菌體，用預(yù)冷的20ml PBS (pH7. 4)懸浮菌體，經(jīng)_20°C凍融1次后，于 冰浴條件下超聲波破碎菌體細(xì)胞。3)將上述超聲破碎液于4°C，12000g，離心15min。分別收集上清液與沉淀，如上所 述進(jìn)行SDS-PAGE電泳，證實(shí)目的蛋白均以包涵體的形式表達(dá)(參見圖4)。實(shí)施例4親和層析法純化scygonadin2_h印cidin串聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物1)上柱樣品的制備將表達(dá)菌液按比例轉(zhuǎn)入IL含50 μ g/ml卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)2小時左右，至0D600為0. 3，加入0. 6mmol/L的IPTG，28°C、180rpm搖床誘導(dǎo)證。表達(dá)結(jié)束后，將全部誘導(dǎo)培養(yǎng)液于4°C，4500g離心20min，收集菌體，加入預(yù)冷的50ml PBS (pH7. 4)重懸菌體沉淀。放入-20°C冷凍過夜。次日，待菌液解凍后，于冰浴條件下超 聲破碎菌體細(xì)胞10 15min (超聲5s，間隔IOs)。破碎至菌液無粘性后4°C，IlOOOg離心 15min。用含2M尿素的緩沖液洗滌包涵體后，4°C、11000g離心15min。最后用含有8mol/L 尿素的緩沖液充分溶解包涵體，40C UlOOOg離心20min，將上清裝入處理好的透析帶中。放 入逐級降低的，含有6mol/L、4mol/L、2mol/L、lmol/L、0. 5mol/L、0mol/L尿素的緩沖液中透 析復(fù)性，多次更換透析液。以上操作均在低溫環(huán)境中進(jìn)行。透析結(jié)束后將蛋白溶液于4°C， 12000g離心20min。至此準(zhǔn)備好上柱樣品。2)準(zhǔn)備金屬鏊合層析柱金屬鏊合層析填料為s印harose fast flow (GE Healthcare)，親和層析介質(zhì)裝柱 后，先用3 4個柱體積的溶液A鏊合Ni2+，用5 10個柱體積超純水洗柱；再用5 10 個柱體積的溶液B洗去多余的M2+，并用5 10個柱體積超純水洗柱；接著用5 10個柱 體積溶液C充分平衡層析柱，等待上樣。全部溶液用0. 45 μ mol/L濾膜過濾。層析試劑為溶液A :200mmol/L 硫酸鎳；溶液B :25mmol/L NaH2P04+500mmol/L NaCl，pH 4. 0 (用磷酸調(diào))；溶液C :20mmol/L 磷酸緩沖液 +500mmol/L NaCl+40mmol/L 咪唑，pH 8. 0 ；溶液D :20mmol/L 磷酸緩沖液 +500mmol/L NaCl+400mmol/L 咪唑，pH 8. 0。3)上柱純化將上柱樣品經(jīng)0.45 μ mol/L過濾后，全部上柱。先用5 10個柱體積的溶液C洗 去未結(jié)合的雜蛋白；再用10個柱體積的溶液D過柱洗脫目標(biāo)蛋白；收集洗脫峰，可見到明 顯的洗脫蛋白峰(參見圖幻，取少量進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定(參見圖6)，通過凝膠掃描計(jì) 算得知，掃描凝純化后的融合表達(dá)產(chǎn)物具有90%的純度。將目的蛋白洗脫液裝入處理好的 透析帶中，放入磷酸鹽緩沖液中透析，多次更換透析液。最后透析入超純水中。以上操作均 在低溫環(huán)境中進(jìn)行。實(shí)施例5融合表達(dá)產(chǎn)物scygonadin2-t^pcidin抗菌活性的測定1)應(yīng)用Bradford法測定目的蛋白的濃度 取BSA儲液用1 X PBS稀釋10倍，終濃度為0. 5mg/ml ；將0. 5mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品按 0、1、2、4、8、12、16、20μ 1梯度加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用IXPBS分別補(bǔ)足至20μ 1，每個 濃度梯度設(shè)置3個平行樣；分別加20μ 1、10μ 1、5μ 1待測樣品到96孔板的樣品孔中，用 1 XPBS分別補(bǔ)足至20 μ 1，每個濃度梯度設(shè)置3個平行樣；每孔加入200 μ 1 G250染色液， 室溫放置:3min ；用酶標(biāo)儀測定595nm波長處的吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品的蛋白 濃度；應(yīng)用Bradford法測定BSA標(biāo)準(zhǔn)品得到蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(參見圖7)，根據(jù)公式可 計(jì)算出重組表達(dá)蛋白的濃度。2)融合表達(dá)產(chǎn)物scygonadin2-t^pcidin抗菌活性的測定(1)取被測細(xì)菌，在MH(Mueller-Hint0n)平板上劃線，倒置培養(yǎng)12 16h ；挑取 單克隆接種于MH斜面，繼續(xù)培養(yǎng)12 16h ；用DPBS (DPBS為杜氏磷酸緩沖液)清洗斜面 培養(yǎng)物，調(diào)整稀釋至OD6tltl = 0. 1。取18 μ 1上訴稀釋菌液加入到MH稀釋培養(yǎng)基(DPBS 600 μ 1，MH 400 μ 1)中至終體積為1ml，至此準(zhǔn)備好細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC minimum inhibition concentration)的工作濃度。其中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)溫度為37°C，溶壁微球 菌、藤黃微球菌、谷氨酸棒狀桿菌、施氏假單胞菌、熒光假單胞菌培養(yǎng)溫度為28 30°C (所 使用的上述菌株均購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心)。(2)目的蛋白經(jīng)過0. 22 μ m過濾膜過濾除菌后，以96、48、24、12、6、3、1. 5 μ mol/L 為梯度進(jìn)行稀釋；(3)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每種被測細(xì)菌按照以下操作設(shè)置空白對照組、陰性對 照組和待測樣品實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置2個平行樣①空白對照組加50 μ 1蛋白樣品和50 μ 1杜氏磷酸緩沖液DPBS ；②陰性對照組加50 μ 1菌懸液和50 μ 1杜氏磷酸緩沖液DPBS ；③樣品實(shí)驗(yàn)組加50 μ 1待測各濃度蛋白樣品和50 μ 1菌懸液；培養(yǎng)24h后，判定目的蛋白對各種細(xì)菌的最小抑菌濃度。結(jié)果表明融合表達(dá) 產(chǎn)物scyg0nadin2-h印cidin對所測菌種均具有一定的殺傷作用，參見表1 融合表達(dá)產(chǎn)物 SCyg0nadin2-h印cidin對6種細(xì)菌的最小抑菌濃度圖。在表1中，測試菌株有施氏假單 胞菌(Pseudomonas stutzeri)、焚光假單胞菌(Psendomonas fluorescens)、金黃色葡萄 球菌(Staphylococcus aureus)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、藤黃微球菌 (Micrococcus leteus)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ；MIC是最小抑菌濃 度，單{立為 U mol/L ；scygonadin2_hepcidin代表融合表達(dá)白勺 scygonadin2_hepcidin 蛋白。表權(quán)利要求
1.兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于，所述兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的基因包括鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin2基因、連接肽和大黃魚抗菌肽hepcidin基因。
2.如權(quán)利要求l所述的兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于所述鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin2的基因序列為cacccatggc gaatggcctg gcactcaaca gacttatgaa taaggccgtc gacgccatag60tttatatggt tggacaacaa gacgcaggcg tctctcttct gggtcaccca tgtctggtggl 20agtcagcgaa acaaccggaa ggcatctaca ccgcagtaat gtcgtgtgct tcctggaccc180ctcgcttcgt tggggaaggc acaagcgagg ttgaacttga ggcgcttaaa ggttcgatca240gaagctttat ccgtaaggca tccgattacc agctgttaag taaagaagac ctcgaggact300ggcttgcttc ctacggttct ccaggttccg gt332其中第l一3位的堿基序列CaC為保護(hù)堿基，第4—9位堿基序列ccatgg為酶切位點(diǎn)，第315—332位的堿基序列g(shù)gttct ccaggttccg gt為連接肽。
3.如權(quán)利要求l所述的兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于所述大黃魚抗菌肽hepcidin的基因序列為ggttctccag gttccggtgt cccagccaat gaagagcaag agctggagca gcaaatttat60tttgctgatc cagagatgcc agtggaatca tgcaagatgc cgtattacat gcgtgagaatl 20cgtcagggca gccctgctag atgcaggttt tgctgccgtt gctgtcctag aatgagggga180tgtggtatct gctgcaggtt cctcgagcgg2 10其中第l—18位的堿基序列g(shù)gttct ccaggttccg gt為連接肽，第202—207位的堿基序列ctcgag為XhoI酶切位點(diǎn)，第208—210位的堿基序列cgg為保護(hù)堿基。
4.如權(quán)利要求l所述的兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于所述連接肽的氨基酸序列為Gly Set Pro Gly Set Gly·l5。
5.如權(quán)利要求l所述的兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物，其特征在于所述兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列為 Met Ala Asn Gly Leu Ala Leu Asn Arg Leu Met Asn Lys Ala Val Asp ·l5lo15 Ala Val／yr Met Val Gly Gin Gin Asp Ala Gly Val Set Leu Leu Gly·202530HiS Pro Cys Leu Val Glu Set Ala Lys Gin Pro Glu Gly Ile／yr／hr·354045Ala Val Met Set Cys Ala Set／rp／hr Pro Arg Phe Val Gly Glu Gly·505560／hr Set Glu Val Glu Leu Glu Ala Leu Lys Gly Set Ile Arg Set Phe·65707580Ile Arg Lys Ala Set Asp／yr Gin Leu Leu Set Lys Glu Asp Leu Glu·859095Asp Trp Leu Ala Ser Tyr Gly Ser Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala Asn 100105110Glu Glu Gln Glu Leu Glu Gln Gln lie Tyr Phe Ala Asp Pro Glu Met 115120125Pro Val Glu Ser Cys Lys Met Pro Tyr Tyr Met Arg Glu Asn Arg Gln 130135140Gly Ser Pro Ala Arg Cys Arg Phe Cys Cys Arg Cys Cys Pro Arg Met145150155160Arg Gly Cys Gly lie Cys Cys Arg Phe Leu His His His His His His 165170175其中103 108位氨基酸序列為連接肽。
6.如權(quán)利要求1所述的兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，其特征 在于包括以下步驟1)克隆鋸緣青蟹scyg0nadin2抗菌肽基因和大黃魚h印cidin抗菌肽基因，并PCR擴(kuò)增 出鋸緣青蟹與大黃魚的融合基因scygonadin2-h印cidin ；2)將融合基因scygonadir^-kpcidin導(dǎo)入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶融合基因 scygonadin2_h印cidin的重組表達(dá)載體；3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，獲得可表達(dá)融合基因sCyg0nadin2-h印cidin的工 程菌；4)發(fā)酵培養(yǎng)可表達(dá)融合基因SCyg0nadin2-h印cidin的工程菌，分離純化發(fā)酵液即得 兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求1所述的兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，其特征 在于在步驟幻中，所述表達(dá)載體為pET28a。
8.如權(quán)利要求1所述的兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物的制備方法，其特征 在于在步驟幻中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
全文摘要
兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法。涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中魚類與蟹類的基因工程，提供兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法。融合表達(dá)產(chǎn)物的基因包括鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin2基因、連接肽和大黃魚抗菌肽hepcidin基因。制備方法包括克隆融合基因scygonadin2-hepcidin；表達(dá)融合基因scygonadin2-hepcidin，即得兩種海洋動物抗菌肽基因的融合表達(dá)產(chǎn)物。利用pET28a原核表達(dá)載體，成功高效的表達(dá)出具有抗菌活性的鋸緣青蟹抗菌肽scygonadin2與大黃魚抗菌肽hepcidin的融合表達(dá)產(chǎn)物，使得串聯(lián)抗菌肽的藥用價(jià)值得到開發(fā)。
文檔編號C12N15/12GK102061303SQ20101056246
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月26日
發(fā)明者王克堅(jiān), 蔡晶晶, 黃晟沛 申請人:廈門大學(xué)