專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的elisa試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的檢測(cè)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種基于雌激 素受體介導(dǎo)原理的檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的ELISA試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著工業(yè)污染的不斷加劇，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Endocrine disrupting C0mp0imdS，EDCS)成為繼工業(yè)革命帶來(lái)的煤煙污染及汽車(chē)工業(yè)發(fā)展帶來(lái)的光化學(xué)煙霧污染 之后的第三代環(huán)境污染物，將對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。EDCs主要有多氯聯(lián)苯類(lèi)、二惡英 類(lèi)、烷基酚類(lèi)、鄰苯二甲酸酯類(lèi)、農(nóng)用化學(xué)品類(lèi)、天然或合成的激素藥物等類(lèi)雌激素物質(zhì)，他 們可模擬體內(nèi)天然的雌激素，與雌激素受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止體內(nèi)雌激素與其受體的結(jié)合， 充當(dāng)雌激素受體拮抗劑，從而抑制雌激素活性，發(fā)揮類(lèi)雌激素作用，動(dòng)物胚胎期暴露可誘導(dǎo) 生殖系統(tǒng)發(fā)育畸形、功能異常以及乳腺分泌異常等。因?yàn)榄h(huán)境內(nèi)分泌干擾物以痕量的混合物形式存在于污水、土壤等環(huán)境中，其檢測(cè) 常常受到諸多限制，成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一。目前，各國(guó)多以氣相色譜(GC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法作為檢測(cè)EDCs 的標(biāo)準(zhǔn)方法。但由于EDCs通常以痕量混合物的形式存在，且環(huán)境中存在著大量的天然的或 人工合成的化學(xué)物，截止到2010年11月21日，在美國(guó)化學(xué)文摘社(Chemical Abstracts Service, CAS)登記的天然的或人工合成的化學(xué)物達(dá)62^7480種(http //www. cas. org/ cgi-bin/ cas/regreport. pi. 2010-11-21 )，面對(duì)如此多的化學(xué)物，采用傳統(tǒng)的萃取富集、 高效液相色譜/質(zhì)譜/氣相色譜等方法分離出單一成分并測(cè)定含量的試驗(yàn)方法已無(wú)法滿(mǎn)足 需求，所以必須探索通量高而又廉價(jià)的篩選方法。1998年美國(guó)美國(guó)環(huán)保局(U. S. EPA)推出了《環(huán)境內(nèi)分泌干擾物篩檢程序》 (U. S. EPA, 1998 ；Federal Register, 63: 71542-71568. ) ； 1997 年，Gaido 等建立了環(huán) 境雌激素酵母測(cè)評(píng)體系(feii/o K V, et al. Toxicol Appl Pharmacol, 1997，143(1): 205-212、-Mm 等(Jim SB, et al . Anal Sci. 2003，19: 4沒(méi)沒(méi)制備了熒光-ER 的 EDCs陣列玻片篩選技術(shù)，都是基于高通量的設(shè)想，但仍然存在周期長(zhǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)的不穩(wěn)定性 等局限，使得這些方法通量低、周期長(zhǎng)、系統(tǒng)誤差很大，準(zhǔn)確性和靈敏度差，只能半定量，而 且樣品中的EDCs也可能被細(xì)胞降解。實(shí)際上，評(píng)估痕量混合物的綜合生物學(xué)效應(yīng)及累加毒 性當(dāng)量(TEQ)更有意義。目前基于受體配體結(jié)合的篩選方法，既可以反映EDCs的結(jié)合量， 又能綜合反映其類(lèi)雌激素樣累加毒性當(dāng)量，且易于實(shí)現(xiàn)高通量，是最近幾年EDCs高通量篩 選和監(jiān)測(cè)的新方向。經(jīng)典的雌激素-受體信號(hào)傳導(dǎo)理論認(rèn)為，天然雌激素通過(guò)與雌激素受體α (estrogen receptor α ，ERα )中的配體結(jié)合域(LBD)結(jié)合后，受體發(fā)生變構(gòu)而形成二 聚體，從而暴露DNA結(jié)合區(qū)，使特異的DNA序列即雌激素效應(yīng)元件(estrogen response elements, ERE)與之結(jié)合，刺激靶基因轉(zhuǎn)錄，從而表現(xiàn)出各種生理效應(yīng)。在ER活化和DNA結(jié)合過(guò)程中，ERa的磷酸化起著十分重要的作用，537位酪氨酸(Tyr537 )磷酸化位點(diǎn)是ERa的 基本磷酸化位點(diǎn)，其重要作用是調(diào)控ERa的二聚體化，同時(shí)也是雌激素依賴(lài)的絲氨酸高度 磷酸化以及ERa結(jié)合DNA的前提條件；而167位絲氨酸(Ser167)磷酸化是雌激素依賴(lài)的。 環(huán)境雌激素(即EDCs)作為配體，以與內(nèi)源雌激素類(lèi)似的形式與ERa結(jié)合，并和內(nèi)源雌激 素如雌二醇(E2)—樣，主要通過(guò)ER α介導(dǎo)而產(chǎn)生相應(yīng)的生理效應(yīng)。根據(jù)此分子作用機(jī)制， 同時(shí)利用抗原抗體結(jié)合的特異性、生物素親和素結(jié)合的敏感性和放大作用，本發(fā)明建立了 基于ERa激活效應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法，以檢測(cè)和評(píng)估雌激素效應(yīng)，為環(huán)境類(lèi)雌激素污染的 檢測(cè)和應(yīng)用提供一種新的快捷、高通量方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種廉價(jià)、快速、高通量的檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng) 的ELISA試劑盒及其在環(huán)境及食品類(lèi)雌激素污染檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的，即一種檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的 ELISA試劑盒，其特征在于其組成包括探針，蛋白，結(jié)合緩沖液，酶標(biāo)板，酶混合液I，酶混 合液II，顯色液，終止液，IOX濃縮洗滌液，標(biāo)準(zhǔn)品；所述探針為5’端用生物素標(biāo)記的雙 鏈DNA，該序列含有至少一個(gè)雌激素反應(yīng)元件核心序列5’ -GGTCAnrmTGACC-3’，其中η為 任意核苷酸，能特異結(jié)合配體-ER 二聚體；所述蛋白為重組人雌激素受體；所述酶標(biāo)板為 一抗包被的聚苯乙烯板，所包被的一抗為167位絲氨酸磷酸化的雌激素受體的單克隆抗體 (anti-phospho-Ser167)；所述標(biāo)準(zhǔn)品為 1Χ1(Γ6 mol/L 的雌二醇。本發(fā)明的一個(gè)非限定性的實(shí)施例中，上述探針的核苷酸正鏈序列為SEQ Nol0上述酶混合液I為含有Ser167特異性磷酸化酶CK II，Tyr537特異性磷酸化酶 ρ60。-"。和ATP的TE緩沖液。上述酶混合液II為含有鏈親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶的PBS緩沖液。IOX 濃縮洗滌液每升由 80gNaCl，ll. 5g Na2HPO4 ‘ 2H20, 2g KH2PO4, 2g KCl、5ml Tween-20,0. 5g poly(dI:dC)及余量為去離子水組成的混合液。顯色液分為A、B兩種，分別含有過(guò)氧化氫和四甲基聯(lián)苯胺。終止液為lmol/L的硫酸。本試劑盒中蛋白保存于-70°C，探針保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融，其余組分 保存于4°C。本發(fā)明利用配體-受體生物學(xué)激活效應(yīng)的高效、特異性，生物素-親和素的放大效 應(yīng)和辣根過(guò)氧化酶催化底物顯色的靈敏性，以及ELISA操作的便捷性，構(gòu)建了痕量環(huán)境內(nèi) 分泌干擾物累加毒性當(dāng)量的快速ELISA檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的廉 價(jià)、快速、高通量監(jiān)測(cè)。本發(fā)明試劑盒使用方法包括以下步驟
(1)標(biāo)準(zhǔn)品用結(jié)合緩沖液稀釋為IX10_6 mol/L 1X10_12 mol/L共7個(gè)梯度；蛋白 用結(jié)合緩沖液稀釋為2X10—9 mol/L ；10X濃縮洗滌液用去離子水稀釋為IX洗滌液；
(2)受體配體體外結(jié)合總體積lOOul，其中含50ul標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品以及50ul稀 釋后的蛋白，于4°C振搖孵育1小時(shí)，形成配體-受體復(fù)合物；以50ul不含樣品或不含標(biāo)準(zhǔn) 品的結(jié)合緩沖液作為本底對(duì)照；所有反應(yīng)均做復(fù)孔；(3)受體磷酸化及探針結(jié)合向步驟(2)的復(fù)合物中加入20ul酶混合液I，37°C孵育 30分鐘，再加入探針lul，37°C反應(yīng)10分鐘，成生物素DNA探針-雌激素受體-EDC復(fù)合物；
(4)ELISA反應(yīng)將步驟(3)的復(fù)合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶標(biāo)板中，室溫孵 育1小時(shí)，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入50ul鏈親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，37°C 孵育0. 5-1小時(shí)，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入顯色液A和B各50ul，37°C孵育15 分鐘，加入50ul終止液；同時(shí)做ELISA的試劑空白對(duì)照；
(5)酶標(biāo)儀檢測(cè)在ELISA檢測(cè)儀上，以試劑空白對(duì)照調(diào)零，以630nm波長(zhǎng)做校正，于 450nm波長(zhǎng)處，測(cè)定各孔吸光度值；
(6)結(jié)果計(jì)算相對(duì)吸光度值=樣本或標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值-本底對(duì)照吸光度值，與以雌 二醇為標(biāo)準(zhǔn)品所作的標(biāo)準(zhǔn)劑量-效應(yīng)曲線作比對(duì)，確定待測(cè)樣品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物相對(duì) 于雌二醇的累計(jì)類(lèi)雌激素效應(yīng)EEQ。本發(fā)明試劑盒方法的優(yōu)點(diǎn)在于(1)操作簡(jiǎn)便、快捷，讀取ELISA板的酶標(biāo)儀已常 規(guī)化，普通實(shí)驗(yàn)室即可開(kāi)展，與GC、GS/MS分析法相比，本技術(shù)沒(méi)有鑒定復(fù)雜混合物的困難， 由于模擬類(lèi)雌激素生物學(xué)過(guò)程，能夠反映EDCs的綜合雌激素樣效應(yīng)；而GC和GS/MS分析操 作繁瑣、技術(shù)要求高、成本昂貴；(2)與我們前期建立的ERC-PCR定量方法相比，本方法的進(jìn) 步在于縮短了實(shí)驗(yàn)周期，本試劑盒在1天內(nèi)就能出具結(jié)果、試驗(yàn)周期極短；同時(shí)，由于酶標(biāo) 儀的常規(guī)化，儀器便宜，更適合基層實(shí)驗(yàn)室普及和開(kāi)展；(3)由于利用了生物素-親和素的 放大效應(yīng)，使得本試劑盒靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)到nM ρΜ級(jí)，可廣泛用于食品、環(huán)境檢測(cè)等 領(lǐng)域。


附圖1為以雌二醇(Ε2)為標(biāo)準(zhǔn)品作的標(biāo)準(zhǔn)劑量-效應(yīng)曲線示意圖。附圖2顯示傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜法的檢測(cè)能力示意圖。附圖3傳統(tǒng)的GC/MS方法對(duì)混合樣本中EDCs的檢測(cè)鑒定能力示意圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例意在說(shuō)明實(shí)施本發(fā)明的現(xiàn)已知的一個(gè)最佳的實(shí)施方案，但是不應(yīng)該 認(rèn)為本發(fā)明局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1 一抗包被的聚苯乙烯酶標(biāo)板的制備
用雙蒸水將聚苯乙烯酶標(biāo)板潤(rùn)洗三次，烘干備用。用包被緩沖液將針對(duì)雌激素受體167 位絲氨酸磷酸化的特異性單克隆抗體(anti-phospho-Ser167)進(jìn)行1:100稀釋后，取100 ul 加入酶標(biāo)板內(nèi)，封板，4°C包被過(guò)液。棄包被的抗體溶液，洗滌液洗板5次，每次3分鐘。在 紙巾上將酶標(biāo)板拍干，每孔加入封閉液350ul，封板，4 °C封閉過(guò)夜。棄封閉液，用洗滌液洗 滌5次，每次3分鐘，將酶標(biāo)板真空干燥，密封入帶干燥劑的金屬箔袋內(nèi)，4 °C保存。其中， 包被緩沖液為PH9. 6的碳酸緩沖液，含有15 mmol/L碳酸鈉(Na2CO3)，35 mmol/L碳酸氫鈉 (NaHCO3)；封閉液為含5% BSA和0. 05%吐溫-20的PBS溶液；洗滌液為pH7. 4的磷酸鹽緩 沖液含有 0. 05% 吐溫-20，0. 05mg/ml poly (dl dC)，1· 5 mmol/L 磷酸二氫鉀(KH2PO4), 8 mmol/L 磷酸氫二鈉(Nei2HPO4), 140 mmol/L 氯化鈉(NaCl)，2. 5 mmol/L 氯化鉀。所述的雌 激素受體167位絲氨酸磷酸化的特異性單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma試劑公司。
實(shí)施例2生物素標(biāo)記的雙鏈DNA探針的制備
合成5，端用生物素標(biāo)記的DNA探針正鏈5，-Biotin- ggCTggCCggCgTggAAgTTTggTCT ggCTCACTgCAggggTCAAggTgACCCCCggggTCACTTgT
CTAAAAgggATggTTTgTggg-3，，用 SEQ Nol 表示；合成其互補(bǔ)鏈為 5，- CCCAC AAACCATCCCTTTTAGACAAGTGACCCCGGGGGTCACCTTGACCCCTGCAGTG AGCCAGACCAAACTTC CACGCCAGGCCAGCC-3’，用SEQ No2表示。序列由上海生物工程有限公司標(biāo)記和合成。用退 火緩沖液(10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA，pH=8. 0)溶解DNA探針正鏈及其互補(bǔ) 鏈，使其終濃度為20 100 umol/L。將二條鏈等摩爾混合，于94°C保溫5分鐘后、45°C保 溫5分鐘，冷卻至室溫，SDS-PAGE純化雙鏈DNA探針，測(cè)定濃度后，用TE稀釋探針至濃度為 5ng/ul，裝入1. 5ml朔料離心管，_20°C保存。實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)品雌二醇的劑量-效應(yīng)曲線繪制
以雌二醇E2為標(biāo)準(zhǔn)品，使用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，觀察雌二醇的結(jié)合能力，并繪制 標(biāo)準(zhǔn)劑量-效應(yīng)曲線。包括以下步驟
(1)標(biāo)準(zhǔn)品用結(jié)合緩沖液稀釋為1X10_6 mol/L 1X10_12 mol/L共7個(gè)梯度。(2)雌激素受體蛋白用結(jié)合緩沖液稀釋為2X10—9 mol/L;所述雌激素受體蛋白購(gòu) 自美國(guó)Sigma試劑公司。(3) IOX濃縮洗滌液用去離子水稀釋為IX洗滌液。(4)受體配體體外結(jié)合總體積lOOul，其中含50ul標(biāo)準(zhǔn)品以及50ul步驟(2)所 述稀釋后的雌激素受體，于4°C振搖孵育1小時(shí)，形成配體-受體復(fù)合物。(5)受體磷酸化及探針結(jié)合向步驟(4)的復(fù)合物中加入20ul酶混合液I，37°C 孵育30分鐘，再加入實(shí)施例2所述探針10ul，37°C反應(yīng)10分鐘，成生物素DNA探針-雌激 素受體-EDC復(fù)合物；以50ul不含樣品或不含標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合緩沖液作為本底對(duì)照；所有反 應(yīng)均做復(fù)孔。所述酶混合液I為每毫升TE緩沖液中含有100 150國(guó)際單位的Ser167特異 性磷酸化酶CK II，100 150國(guó)際單位的Tyr537特異性磷酸化酶p60e_src，0. 01毫摩爾ATP ； 所述Ser167特異性磷酸化酶CK II購(gòu)自美國(guó)Calbiochem試劑公司，所述Tyr537特異性磷酸化 酶 p6(Tsrc 購(gòu)自美國(guó) Mi 11 ipore-Upstate 公司。(6) ELISA反應(yīng)將步驟(5)的復(fù)合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶標(biāo)板中，室溫 孵育1小時(shí)，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入50ul混合酶II，37°C孵育0. 5-1小時(shí)，棄 上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入顯色液A和B各50ul，37°C孵育15分鐘，加入50ul終止 液。同時(shí)做ELISA的試劑空白對(duì)照。所述混合酶II為每毫升PBS緩沖液中含有0. 5 1毫 克鏈親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶。(7)酶標(biāo)儀檢測(cè)在ELISA檢測(cè)儀上，以試劑空白對(duì)照調(diào)零，以630nm波長(zhǎng)做校正， 于450nm波長(zhǎng)處，測(cè)定各孔吸光度值，也即OD值。(8)結(jié)果計(jì)算相對(duì)吸光度值=樣本或標(biāo)準(zhǔn)品OD值-本底對(duì)照OD值。用SpSS13.0 軟件擬合以雌二醇(E2)為標(biāo)準(zhǔn)品的劑量-效應(yīng)曲線，見(jiàn)附圖1，并確定半數(shù)有效濃度EC5Q。 用待檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)劑量-效應(yīng)曲線作比對(duì)，即可確定待測(cè)樣品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物相對(duì)于 E2的累計(jì)效應(yīng)。(9)結(jié)果結(jié)果顯示，雌二醇的結(jié)合能力好，可達(dá)nM pM級(jí)，線性關(guān)系良好。雌二 醇的半數(shù)有效濃度EC5tl.E2=112pmol/L，最低檢測(cè)限E2可達(dá)1 X ΚΓ^πιοΙ/Ι。
實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒在環(huán)境樣品中的檢測(cè)應(yīng)用
以池塘污水為環(huán)境樣品，水樣采集后，12000g, 10 min離心，采上清作為檢測(cè)水樣原液， 環(huán)境水樣原液濃度設(shè)為1，用去離子水2倍倍比稀釋?zhuān)弓h(huán)境水樣系列濃度為1、2_\2_2、2_3、 2_4、2_5共6個(gè)梯度。以此6個(gè)樣本作為樣品，按照實(shí)施例3所述步驟代替標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 所有樣本均做復(fù)孔。得到6樣本的相對(duì)吸光度值，見(jiàn)附圖2，用SpSS13. 0軟件擬合計(jì)算樣品 的半數(shù)有效濃度EC5Q。結(jié)果顯示，系列環(huán)境樣品的EC5tl.#s=0. 104，則環(huán)境水樣品的類(lèi)雌激素效應(yīng)EEQ= EC50. E2/ EC50.樣品=1.08 nmol/L。實(shí)施例5本發(fā)明ELISA試劑盒與傳統(tǒng)的GC/MS方法的比較
采用SHIMADZU LC-MS-2010液-質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。液相色譜條件色譜柱采用 phenome gemini C18 柱(2. OmmX 10. OcmX 3 μ m)；流動(dòng)相為 80 % -20 % 的乙腈，第 0 min 時(shí)，水乙腈為20:80 (V:V)，第15 min時(shí)，水乙腈為8020 (V:V)，期間水和乙腈的體積 比均勻變化；柱溫30°C，流速11111/1^11，進(jìn)樣量5 4 1。質(zhì)譜條件電噴霧接口進(jìn)樣，接口溫度 為250°C;ESI/MS采用陽(yáng)離子模式，MS分析器質(zhì)量掃描范圍為 /^ 50 2000 ；噴霧電壓為 4500V，霧化器壓力為0. 2 MPa ；逆向干燥氣體N2溫度為200°C，流速為1. 5 L/ min ；四級(jí)桿 質(zhì)量分析器質(zhì)量掃描范圍為 /^ 100 500 ；DC電壓為5V，RF電壓為150V ；檢測(cè)方式為正 離子多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。E1、E2、E3、DES、DMP、PCB153、DBP、NP、4，4-DDT、BPA 的定 量離子 m/z 分別為 271、273、289、269、195、362、269、221、355、2四。檢測(cè)的樣品包括包含有El、E2、E3、DES、DMP、PCB153, DBP、NP,4, 4-DDT、BPA 共 10 種 EDCs 的混合標(biāo)準(zhǔn)品，各自終濃度分 1 X 10_6、1 X 10_8、1 X 10_1CI、1 X 10_12、1 X 10_14 mol/L 共5個(gè)梯度的樣品。結(jié)果利用傳統(tǒng)的GC/MS方法，在10種EDCs中只有DMP、PCB 153,4, 4-DDT三種 物質(zhì)能在各水平恒定的檢測(cè)出，見(jiàn)附圖3 ；E3在1X10_8水平檢出，El僅在1X10_6，而E2、 DES、NP、BPA及DBP在1 X 10_6水平就已經(jīng)無(wú)法檢出。結(jié)果顯示不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn) 品中傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法雖然檢出限低、靈敏度高，但在復(fù)雜混合樣品中的檢 出能力有限，不能用統(tǒng)一的條件去測(cè)定混合物中各組分的含量，例如《GB 5749-2006生活 飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》列出的半揮發(fā)性有機(jī)物指標(biāo)約有30種，而相應(yīng)的檢測(cè)方法有近沈種(見(jiàn) 《GB/T 5750-2006生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》)。檢測(cè)方法的單一性使得完全按標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái) 進(jìn)行水質(zhì)全分析需要花費(fèi)大量的時(shí)間和人力。而本發(fā)明試劑盒的主要優(yōu)勢(shì)在于(1)測(cè)量毒性當(dāng)量以雌二醇為標(biāo)準(zhǔn)品，定量測(cè) 定環(huán)境樣品中混合EDCs相對(duì)于雌二醇的含量，即相對(duì)于雌二醇的累計(jì)類(lèi)雌激素效應(yīng)EEQ， 以此評(píng)價(jià)環(huán)境樣品的可能的生物學(xué)效應(yīng)；而不像LC/MS方法那樣每種條件只能測(cè)一種物質(zhì) 而耗時(shí)費(fèi)力；(2)操作簡(jiǎn)便，普通實(shí)驗(yàn)室即可開(kāi)展；(3)實(shí)驗(yàn)周期短，1天即可出具檢測(cè)報(bào)告； (4)成本低廉。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的ELISA試劑盒，其特征在于其組成包括探 針，蛋白，結(jié)合緩沖液，酶標(biāo)板，酶混合液I，酶混合液II，顯色液，終止液，IOX濃縮洗滌液， 標(biāo)準(zhǔn)品；所述探針為5’端用生物素標(biāo)記的雙鏈DNA，該序列含有至少一個(gè)雌激素反應(yīng)元件 核心序列5’ -GGTCAnrmTGACC-3’，其中η為任意核苷酸，能特異結(jié)合配體-ER 二聚體；所述 蛋白為重組人雌激素受體；所述酶標(biāo)板為一抗包被的聚苯乙烯板，所包被的一抗為167位 絲氨酸磷酸化的雌激素受體的單克隆抗體；所述標(biāo)準(zhǔn)品為1Χ10—6 mol/L的雌二醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的ELISA試劑盒，其特 征是所述探針的核苷酸正鏈序列為SEQ Nol0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的ELISA試劑盒，其特 征是所述酶混合液I為含有Ser167特異性磷酸化酶CK II，Tyr537特異性磷酸化酶p6(TSM 和ATP的TE緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的ELISA試劑盒，其特 征是酶混合液II為含有鏈親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶的PBS緩沖液。
5.一種采用權(quán)利要求1所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟(1)標(biāo)準(zhǔn)品用結(jié)合緩沖液稀釋為IX10_6 mol/L 1X10_12 mol/L共7個(gè)梯度；蛋白 用結(jié)合緩沖液稀釋為2X10—9 mol/L ；IOX濃縮洗滌液用去離子水稀釋為IX洗滌液；(2)受體配體體外結(jié)合總體積lOOul，其中含50ul標(biāo)準(zhǔn)品或待檢樣品以及50ul稀 釋后的蛋白，于4°C振搖孵育1小時(shí)，形成配體-受體復(fù)合物；以50ul不含樣品或不含標(biāo)準(zhǔn) 品的結(jié)合緩沖液作為本底對(duì)照；所有反應(yīng)均做復(fù)孔；(3)受體磷酸化及探針結(jié)合向步驟(2)的復(fù)合物中加入20ul酶混合液I，37°C孵育 30分鐘，再加入探針lul，37°C反應(yīng)10分鐘，成生物素DNA探針-雌激素受體-EDC復(fù)合物；(4)ELISA反應(yīng)將步驟(3)的復(fù)合物加入到一抗包被的聚苯乙烯酶標(biāo)板中，室溫孵 育1小時(shí)，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入50ul鏈親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶，37°C 孵育0. 5-1小時(shí)，棄上清，350ul洗滌液洗滌5次；加入顯色液A和B各50ul，37°C孵育15 分鐘，加入50ul終止液；同時(shí)做ELISA的試劑空白對(duì)照；(5)酶標(biāo)儀檢測(cè)在ELISA檢測(cè)儀上，以試劑空白對(duì)照調(diào)零，以630nm波長(zhǎng)做校正，于 450nm波長(zhǎng)處，測(cè)定各孔吸光度值；結(jié)果計(jì)算相對(duì)吸光度值=樣本或標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值-本底對(duì)照吸光度值，與以雌二醇為 標(biāo)準(zhǔn)品所作的標(biāo)準(zhǔn)劑量-效應(yīng)曲線作比對(duì)，確定待測(cè)樣品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物相對(duì)于雌二 醇的累計(jì)類(lèi)雌激素效應(yīng)EEQ。
6.權(quán)利要求1所述的試劑盒在環(huán)境及食品類(lèi)雌激素污染檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)痕量環(huán)境內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)的ELISA試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒包含探針，蛋白，結(jié)合緩沖液，酶標(biāo)板，酶混合液Ⅰ，酶混合液Ⅱ，顯色液，終止液，10×濃縮洗滌液，標(biāo)準(zhǔn)品。所述探針為5’端用生物素標(biāo)記的雙鏈DNA；所述蛋白為重組人雌激素受體；所述酶標(biāo)板包被了Ser167磷酸化雌激素受體單抗；所述酶混合液Ⅰ含有兩種磷酸化酶。通過(guò)與雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)劑量-效應(yīng)曲線比對(duì)，確定樣品中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物相對(duì)于雌二醇的累計(jì)類(lèi)雌激素效應(yīng)。本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)便、快速、通量高。可廣泛用于環(huán)境、食品檢測(cè)等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK102062781SQ201010562718
公開(kāi)日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者王莎莎, 譚文婷, 鄧國(guó)宏 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院