專利名稱：含重組基因的酸性β-葡聚糖酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含重組基因的酸性β-葡聚糖酶及其用途，屬于微生物、酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國2009年啤酒產(chǎn)量達(dá)4236萬噸，據(jù)世界第一。由于規(guī)模大，啤酒行業(yè)的節(jié)能減排對我國整體二氧化碳減排和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。啤酒行業(yè)由于本身的特點(diǎn)是一個(gè)能耗較大的行業(yè)，因此啤酒生產(chǎn)節(jié)能減排技術(shù)具有特別重要的意義，而葡聚糖酶的應(yīng)用對啤酒生產(chǎn)中糖化液過濾過程的節(jié)能減排具有很大作用。大麥胚乳細(xì)胞壁的主要成分為半纖維素和大麥膠(由葡聚糖組成，約占大麥的5 8%)。傳統(tǒng)的麥汁制備工藝主要利用麥芽本身含有的β-葡聚糖酶來降解細(xì)胞壁，但是這種內(nèi)源性β-葡聚糖酶活性低而且不穩(wěn)定，利用傳統(tǒng)工藝進(jìn)行麥汁糖化時(shí)大量殘留的葡聚糖會(huì)使麥汁粘度上升，增加糖化液及啤酒過濾過程中的能量消耗、降低原料利用率并增加啤酒廠的廢物排放。近年來社會(huì)和企業(yè)對節(jié)能和減排日趨重視，一些啤酒廠開始利用外源添加β -葡聚糖酶的方式來改善麥汁的過濾性能，以達(dá)到節(jié)能減排的目標(biāo)。生產(chǎn)實(shí)踐證明，如在制麥過程中添加足夠量的β-葡聚糖酶處理麥汁，糖化液過濾過程中的能量消耗和廢物排放可以減少近一半。目前，葡聚糖酶的生產(chǎn)均采用微生物發(fā)酵法，菌種主要有綠色木霉、解淀粉芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌。其中以綠色木霉為代表的真菌產(chǎn)生的葡聚糖酶耐酸性能比較好，但由于真菌基因表達(dá)調(diào)控比較復(fù)雜，因此產(chǎn)酶水平的提高有一定的困難，目前市場上真菌來源的 β-葡聚糖酶的價(jià)格較高。芽孢桿菌來源的β-葡聚糖酶在耐酸性方面不如真菌來源的產(chǎn)品，但開發(fā)芽孢桿菌來源的葡聚糖酶基因資源具有重要的意義，一個(gè)重要原因是這一類基因易于在芽孢桿菌宿主菌中實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)。芽孢桿菌的多個(gè)種，如枯草芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌等長期以來被用于酶制劑的生產(chǎn)，是一類被公認(rèn)為食品安全的微生物，同時(shí)許多用于酶制劑生產(chǎn)的芽孢桿菌中控制酶基因表達(dá)的啟動(dòng)子和信號肽被成功用于外源基因分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，并已獲得了多個(gè)有效的表達(dá)系統(tǒng)。由于芽孢桿菌是一種原核生物其基因調(diào)控相比于真菌來講要簡單得多，因此利用芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因的高效分泌表達(dá)比較容易實(shí)現(xiàn)。在啤酒生產(chǎn)中葡聚糖酶主要應(yīng)用于麥汁糖化過程，這一工藝中麥汁的PH值一般控制在4. 5左右，而目前芽孢桿菌來源的β -葡聚糖酶的最適ρΗ —般均接近中性，很難適應(yīng)麥汁糖化工藝的要求，因此開發(fā)來源于芽孢桿菌的耐酸性β -葡聚糖酶具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用基因重組技術(shù)從酸性β -葡聚糖酶產(chǎn)生菌基因組DNA中克隆β -葡聚糖酶編碼基因并確認(rèn)其功能，從而提供一種來源于芽孢桿菌的酸性 β -葡聚糖酶編碼基因，并且利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)出含有該重組基因的酸性β -葡聚糖酶，使之用于啤酒生產(chǎn)過程中的麥汁糖化。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，一種含重組基因的酸性葡聚糖酶，其特征在于該酸性葡聚糖酶包含來源于芽孢桿菌的酸性葡聚糖酶編碼基因，所述芽孢桿菌是芽孢桿菌屬細(xì)菌Bacillus sp. 013，所述酸性β -葡聚糖酶編碼基因是bgl013，其核苷酸序列為序列表中的SEQ ID NO :1，所述酸性β-葡聚糖酶的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO :2。進(jìn)一步地，上述酸性β -葡聚糖酶編碼基因bgl013與克隆載體pMD18-TSimple組成的重組質(zhì)粒pMD-bgl013的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子是JM109/pMD-bgl013。上述含重組基因的酸性β -葡聚糖酶的用途是，在啤酒生產(chǎn)過程中用于麥汁的糖化，糖化時(shí)PH為4. 5，溫度為60°C。本發(fā)明的有益效果是利用本發(fā)明獲得的酸性β -葡聚糖酶編碼基因構(gòu)建重組微生物，可實(shí)現(xiàn)酸性β-葡聚糖酶的高效率生產(chǎn)，該酸性β-葡聚糖酶可應(yīng)用于啤酒生產(chǎn)的麥汁糖化工藝，有利于降低麥汁粘度并使麥汁澄清。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明從自然界中篩選到一株具有葡聚糖降解能力的芽孢桿菌，其編號為 Bacillus sp. 013，利用基因工程技術(shù)從Bacillus sp. 013基因組DNA中克隆出一條β -葡聚糖酶編碼基因，命名為bgl013，其核苷酸序列為序列表中的SEQ IDNO :1，其編碼的酸性β-葡聚糖酶原酶的氨基酸序列為序列表中的SEQ ID Ν0:2，基因bgl013與克隆載體pMD18-T Simple組成的重組質(zhì)粒pMD_bgl013的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，分類命名為JM109/ pMD-bgl013。所述酸性β -葡聚糖酶已經(jīng)經(jīng)過功能鑒定證實(shí)，它在最適作用溫度為60°C、最適作用PH為4. 5環(huán)境下的性能，適合于麥汁糖化工藝的要求。所述酸性β -葡聚糖酶編碼基因bgl013的獲得方法如下(1)從自然界篩選產(chǎn)酸性葡聚糖酶的芽孢桿菌從自然界采集土樣，采用高溫處理殺死營養(yǎng)體細(xì)胞，富集芽孢桿菌。在以β-葡聚糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上富集產(chǎn)β-葡聚糖酶細(xì)菌。進(jìn)一步通過搖瓶培養(yǎng)和β-葡聚糖酶酶活檢測篩選產(chǎn)β-葡聚糖酶的細(xì)菌。 用16s rDNA基因序列分析確認(rèn)所篩選微生物屬于芽孢桿菌屬。此輪工作選定芽孢桿菌 Bacillus sp.013為β -葡聚糖酶基因克隆研究的出發(fā)菌。(2)Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶基因的克隆第一步獲得Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶基因部分核苷酸序列根據(jù)細(xì)菌β -葡聚糖酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)一對簡并引物，以Bacillus sp. 013染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶基因部分DNA片段。測序獲得Bacillus sp.013 β-葡聚糖酶基因部分片段的序列，并根據(jù)所獲DNA序列設(shè)計(jì)一對反向PCR引物。第二步利用反向PCR技術(shù)獲得Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶編碼基因的完整序列利用上一步設(shè)計(jì)的一對反向PCR引物，通過PCR獲得普β -葡聚糖酶編碼基因編碼區(qū)完整DNA片段，該片段與克隆載體pMDIS-T Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從獲得的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒測序，并將所獲序列與已經(jīng)獲得序列的片段比對，獲得β-葡聚糖酶編碼基因的完整序列，即SEQ ID NO :1。
第三步獲得Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶編碼基因根據(jù)SEQ ID NO :1再設(shè)計(jì)一對引物以擴(kuò)增Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶編碼區(qū)完整基因，以Bacillus sp.013染色體DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得一 0. 8kb左右的DNA片段， 擴(kuò)增片段純化后與克隆載體PMD18-T Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從獲得的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒測序，獲得葡聚糖酶編碼基因編碼區(qū)完整序列，該基因命名為bgl013，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其編碼的β -葡聚糖酶原酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :2?；騜gl013與克隆載體pMD18-T Simple組成的重組質(zhì)粒pMD-bgl013的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，其分類命名為JM109/pMD-bgl013。(3) β -葡聚糖酶基因的表達(dá)及重組酶功能分析以含有bgl013基因的重組質(zhì)粒pMD_bgl013為模板，設(shè)計(jì)一對引物擴(kuò)增 bgl013基因的成熟肽編碼區(qū)，擴(kuò)增產(chǎn)物與大腸桿菌表達(dá)載體pET28a連接，重組質(zhì)粒命名為pET-bgl013。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌BL21 (DE3)/ pET-bgl013。重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-bgl013在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出有活性的β-葡聚糖酶。重組酶最適PH為4. 5，最適作用溫度為60°C，是一種酸性β -葡聚糖酶。含pET28a 空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子破碎液沒有淀粉酶酶活，可見上述克隆得到的基因確實(shí)為β -葡聚糖酶編碼基因。基因bgl013的應(yīng)用β -葡聚糖酶編碼基因bgl013能用于在不同宿主細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用于葡聚糖的降解，重組酶適合在啤酒生產(chǎn)中用于麥汁糖化工藝，有利于降低麥汁粘度并使麥汁澄清。下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。(一 )產(chǎn)酸性β -葡聚糖酶芽孢桿菌Bacillus sp. 013的獲得從自然界篩選產(chǎn)葡聚糖酶的芽孢桿菌從無錫市大浮茶場附近采集PH 4左右的酸性土樣，在保鮮袋中常溫保存。在實(shí)驗(yàn)室中，將上述土樣放入燒杯中，加5倍雙蒸水， 混勻后在100°C保溫1小時(shí)。取少量上述混合液涂布以β-葡聚糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基平板，37°C培養(yǎng)三天，共獲得372個(gè)菌落，顯微鏡觀察確定其中86株為桿狀細(xì)菌。將上述桿狀細(xì)菌的菌落分別劃線分離后以單菌落接種發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)2天后取上清液檢測 β-葡聚糖酶酶活，其中3株菌培養(yǎng)液中檢測到明顯的葡聚糖酶活性。分別進(jìn)行細(xì)菌的 16s rDNA基因序列分析，其中編號為013的細(xì)菌的16s rDNA基因部分序列為SEQ IDNO :3， 利用BLAST軟件將SEQ ID NO :3與美國國家生物技術(shù)信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov， 簡稱NCBI)收錄的基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示SEQ ID NO :3與Bacillus cereus strain S09053的16s rDNA基因序列(NCBI登錄號HQ224510)最為接近，相似性為81%。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，013細(xì)菌應(yīng)屬于芽孢桿菌屬，命名為Bacillus sp. 013。Bacillus sp.013被用于下一步實(shí)驗(yàn)。(二)Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶基因的克隆第一步獲得Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶基因部分核苷酸序列根據(jù)細(xì)菌β -葡聚糖酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)一對簡并引物5，-AACTC (ATGC) GG (TG) TT (TC) TGG-3，(SEQ ID NO 4)5，-CCA (AG) TC (AG) AA (ATGC) GC(AG) TA-3，(SEQ ID NO :5)
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以Bacillus sp. 013染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得一 0. 4kb左右的擴(kuò)增片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與克隆載體PMD18-T Simple連接，獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析， 結(jié)果顯示所獲PCR產(chǎn)物全長4(^bp，其核苷酸序列與Bacillus amyloliquefaciens來源的β -葡聚糖酶基因的部分序列相似性高達(dá)71 %，這一結(jié)果顯示，上述PCR獲得的片段是 β-葡聚糖酶編碼基因的一部分。第二步獲得Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶編碼基因的完整序列根據(jù)第一步所獲Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶編碼基因部分片段核苷酸序列設(shè)計(jì)一對反向PCR引物5，-ACGAGAAGATTGTAGATGC-3，(SEQ ID NO 6)5，-TGATGAAAATACGGATACG-3，(SEQ ID NO 7)然后利用反向PCR技術(shù)克隆Bacillus sp. 013普魯蘭酶基因完整編碼區(qū)。取Bacillus sp. 013染色體DNA約10 μ g，溶于100 μ L雙蒸水中。在上述DNA溶液中加入IlyL酶切緩沖液和IyL限制性內(nèi)切酶Hind III，37°C酶切2小時(shí)后用柱式DNA 片段回收試劑盒回收經(jīng)酶切的DNA片段。取上述回收的含DNA片段的溶液44 μ L，加入連接反應(yīng)緩沖液5 μ L，連接酶1 μ L，16°C連接過夜。以上述連接產(chǎn)物為模板，利用反向PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，反向PCR獲得一 2. 2kb左右的擴(kuò)增片段，將上述擴(kuò)增片段分離后與克隆載體PMD-18T Simple連接，重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析，并將所獲序列與已經(jīng)獲得序列的片段比對，獲得β-葡聚糖酶編碼基因的完整序列，即SEQ ID Ν0:1。第三步獲得Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶編碼基因根據(jù)SEQ ID NO 1序列再設(shè)計(jì)一對引物以擴(kuò)增Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶編碼區(qū)完整基因，引物序列如下5，-ATGTTCTATCGTAAACGAAT-3‘ (SEQ ID NO 8)5，-TTATTTTTTAATATAGCGTAG-3，(SEQ ID NO 9)以Bacillus sp. 013染色體DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得一 0. 81Λ左右的DNA片段， 擴(kuò)增片段純化后與克隆載體PMD18-T Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從獲得的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒測序，獲得葡聚糖酶編碼基因編碼區(qū)完整序列。將上述葡聚糖酶編碼區(qū)基因序列提交美國國家生物技術(shù)信息中心 (www. ncbi. nlm. nih. gov,簡稱NCBI)，利用blast軟件進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示，該基因核苷酸序列與Bacillus amyloliquefaciens strain TB2來源的β-葡聚糖酶基因編碼區(qū)序列(NCBI登錄號EU368224)相似性最高，相似性為高達(dá)65 %，這一結(jié)果顯示，上述PCR獲得的片段是β-葡聚糖酶編碼基因的一部分該基因命名為bgl013，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其編碼的β-葡聚糖酶原酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :2?；騜gl013與克隆載體pMD18-T Simple組成的重組質(zhì)粒pMD_bgl013的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，其分類命名為JM109/ pMD-bgl013。(三)β-葡聚糖酶基因的表達(dá)及重組酶功能分析以含有bgl013基因的重組質(zhì)粒pMD_bgl013為模板，用引物5，-AATGAATTCTCTGCTGCATCAGCTCAGAC-3，(SEQ ID NO 10)5，-AATAAGCTTTTATTTTTTAATATAGCGTAG-3，(SEQ ID NO 11)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得bgl013基因的成熟肽編碼區(qū)，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I和Hind III酶切后與經(jīng)相同酶切的大腸桿菌表達(dá)載體pET28a連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109,在含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。任選4個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后用 EcoR I和Hind III酶切質(zhì)粒并電泳鑒定，結(jié)果顯示，4個(gè)質(zhì)粒酶切后均產(chǎn)生兩條帶，一條為5. 2kb與pET28a載體大小相當(dāng)，另一條為0. 7kb與PCR獲得的Bacillus sp. 013 β -葡聚糖酶基因相當(dāng)，可見均為pET28a與所獲β-葡聚糖酶基因的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒命名為pET-bgl013。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌BL21 (DE3)/ pET-bgl013。重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET-bgl013在LB液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至培養(yǎng)液渾濁度為0D_ = 0. 8時(shí)加入IPTG至終濃度為0. 5mg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后培養(yǎng)液用超聲波處理破碎細(xì)胞。作為對照，用空質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)獲得的重組菌 BL21(DE3)/pET28a也同樣培養(yǎng)并進(jìn)行細(xì)胞破碎。對細(xì)胞破碎液檢測β-葡聚糖酶酶活力， 結(jié)果顯示重組菌BL21(DE3)/pET-bgl013的細(xì)胞破碎液有明顯的β-葡聚糖酶活力，酶活約為120U/mL。而重組菌BL21(DE3)/pET28a的細(xì)胞破碎液β-葡聚糖酶活力為0。可見，基因bgl013成熟肽編碼基因的表達(dá)產(chǎn)物具有β -葡聚糖降解活性。(四)基因bgl013的應(yīng)用β -葡聚糖酶編碼基因bgl013能用于在不同宿主細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用于β-葡聚糖的降解，有利于啤酒生產(chǎn)中麥汁粘度的降低。葡聚糖酶最適作用溫度為 60°C，最適作用pH為4. 5，性能適合于麥汁糖化工藝的要求。材料和方法普通分子生物學(xué)方法除非提及，DNA操作和轉(zhuǎn)化按照標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行(Sambrook等1989分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)。除非另外提及，PCR操作使用標(biāo)準(zhǔn)方法和PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行，可參見(Sambrook等 1989分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)。DNA操作所使用的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用。引物均為本專利發(fā)明人設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成。反向PCR 技術(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[Ochman H, Gerber AS and Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120:621-623]?？寺≥d體pMD18_T Simple為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為D506A。大腸桿菌JM109為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，大腸桿菌表達(dá)載體pET28a為 Novagen公司產(chǎn)品。DNA操作使用的酶和試劑盒除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性內(nèi)切酶，連接酶等均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品h Taq，產(chǎn)品編號為DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反應(yīng)時(shí)所使用的緩沖液均為購買酶時(shí)附贈(zèng)，緩沖液濃度均為反應(yīng)所需濃度的10倍。柱式DNA片段回收試劑盒以及從電泳凝膠中回收DNA片段的試劑盒均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號分別為DV807A和 DV805A, DNA純化以及從瓊脂糖凝膠中回收DNA的方法均按上述試劑盒說明書操作。細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒為上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品，細(xì)菌基因組DNA提取方法按上述試劑盒說明書進(jìn)行。
其它試劑β-葡聚糖為愛爾蘭Megazyme公司產(chǎn)品(產(chǎn)品編號為P-BGBH)，酵母氮基為Difco 公司0/0型酵母氮基，該產(chǎn)品不含碳源和氨基酸。酶活檢測用的葡聚糖溶液均采用IOmM的磷酸緩沖液配制，磷酸緩沖液使用雙蒸水配制，不同PH的磷酸緩沖液按文獻(xiàn)(諸葛健王正祥編著工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊.北京中國輕工業(yè)出版社，1994 :682 683.)介紹的方法配制。誘導(dǎo)大腸桿菌基因表達(dá)使用的IPTG為寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號為 D9030A。培養(yǎng)基LB在“Sambrook等1989分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊”中描述。以葡聚糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基酵母氮基lg/L，葡聚糖0. 5g/L，瓊脂粉15g/L，用雙蒸水配制。細(xì)菌的16s rDNA基因序列分析按文獻(xiàn)進(jìn)行[陳源源，牛丹丹，王正祥.一種快速鑒定細(xì)菌的方法.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33 (5) 29-31] β_葡聚糖酶酶活力測定按文獻(xiàn)[姜錫瑞等.新編酶制劑實(shí)用技術(shù)手冊.2002,北京輕工業(yè)出版社]介紹的方法進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.含重組基因的酸性β-葡聚糖酶，其特征在于該酸性β-葡聚糖酶包含來源于芽孢桿菌的酸性β-葡聚糖酶編碼基因，所述芽孢桿菌是芽孢桿菌屬細(xì)菌Bacillus sp.013, 所述酸性β-葡聚糖酶編碼基因是bgl013，其核苷酸序列為序列表中的SEQ ID N0:1，所述酸性β-葡聚糖酶的氨基酸序列為序列表中的SEQID NO :2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含重組基因的酸性葡聚糖酶，其特征在于所述酸性 β -葡聚糖酶編碼基因bgl013與克隆載體pMD18-T Simple組成的重組質(zhì)粒pMD_bgl013的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子是JM109/pMD-bgl013。
3.權(quán)利要求1所述的含重組基因的酸性葡聚糖酶的用途，其特征在于所述酸性 β -葡聚糖酶在啤酒生產(chǎn)中用于麥汁的糖化，糖化時(shí)PH為4. 5，溫度為60°C。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種來源于芽孢桿菌屬細(xì)菌Bacillus sp.013的酸性β-葡聚糖酶編碼基因bgl013，其核苷酸序列為序列表中的SEQ ID NO1。利用基因bgl013構(gòu)建的重組微生物表達(dá)產(chǎn)生的重組β-葡聚糖酶，其氨基酸序列為序列表中的SEQ ID NO2。利用本發(fā)明獲得的酸性β-葡聚糖酶編碼基因構(gòu)建重組微生物，可實(shí)現(xiàn)酸性β-葡聚糖酶的高效率生產(chǎn)，該酸性β-葡聚糖酶在生產(chǎn)啤酒的麥汁糖化過程中具有降低麥汁粘度的功效。
文檔編號C12N15/56GK102477438SQ201010563958
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者王正祥 申請人:蘇州普瑞信生物技術(shù)有限公司